涉及作为心脏衍生的心肌抑制因子的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的治疗和生物测定方法

摘要

本发明的涉及作为心脏衍生的心肌抑制因子的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的治疗和生物测定方法。在一个实施方案涉及药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种抗-MIF抗体；和至少一种药学上可接受的载体。本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种抗-CD74抗体；和至少一种药学上可接受的载体。本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种抗-TNFR抗体；治疗有效量的至少一种抗-MI F抗体；和至少一种药学上可接受的载体。本发明的其它实施方案涉及治疗或预防心脏功能障碍、心脏抑制、烧伤伴随的心脏功能障碍、改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能、和鉴别MIF抑制剂的方法。

说明书

本发明得到了由国家卫生研究院授予的基金号R01GM58863的政府支持。政府可具有本发明的某些权利。 

本申请是基于2003年8月29日提交的美国临时申请60/498,659，2004年2月25日提交的60/547,054，2004年2月25日提交的60/547,056，2004年2月25日提交的60/547,057，2004年2月25日提交的60/547,059，和2004年3月26日提交的60/556,440，每一篇的完整内容在这里为所有目的引作参考。 

发明背景 

发明领域

本发明总地涉及脊椎动物物种中涉及细胞因子和其它细胞信号转导机理的病理学和生理学，以及涉及细胞因子和其它细胞信号转导机理的诊断试验。本发明的其它方面涉及作为心肌抑制因子和作为体内内毒素-诱发的心脏功能障碍的介质的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)。本发明的其它方面涉及调解和/或抑制MIF的生产或活性，以及治疗和预防心脏功能障碍、败血症、烧伤或与烧伤相关的其它状况的化合物、组合物和方法。本发明的其它方面涉及LPS攻击后从心脏、肝和脾的MI F释放和TNF受体I/II信号转导的作用。本发明的其它方面涉及不依赖于TNF受体I/II信号转导的MIF向血清中的释放。本发明的其它方面涉及CD 74在心肌细胞上的表达和它对心脏功能障碍的介导。 

技术背景

巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是多能的、促炎性的细胞因子，在过去的四十多年来，已经仔细地考查了它的作用机理。本领域目前有关 MIF的理解包括指向下述的研究：它作为三聚体的结晶，它的生理上有关的低聚状态；它的推定的膜受体；和它作为互变异构酶和氧化还原酶的细胞内酶活性的生理相关性。 

许多研究已经证实，MIF在许多疾病中有重要作用，象类风湿性关节炎(M.Leech，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor in Rheumatoid Arthritis：Evidence of Proinflammatory Function and Regulation by Glucocorticoids″，Arthritis Rheum，42，1601-1608(1999)，M.Leech，等，″Involvement of Macrophage Migration Inhibitory Factor in the Evolution of Rat Adjuvant Arthritis″，Arthritis Rheum.，41，910-917(1998)，A.Mikulowska，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor is Involved in the Pathogenesis of Collagen Type11-Induced Arthritis in Mice″，J.Immunol.，158，5514-5517(1997))，迟发型超敏反应(J.Bernhagen，等，″An Essential Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor in the Tuberculin Delayed-Type Hypersensitivity Reaction″，J.Exp.Med.，183，277-282(1996)，H.Y.Lan，等，″De Novo Renal Expression of Macrophage Migration Inhibitory Factor During the Development of Rat Crescentic Glomerulonephritis″，Am.J.Pathol.，149，1119-1127(1996)，H.Y.Lan，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor Expression in Human Renal Allograft Rejection″，Transplantation，66，1465-1471(1998)，H.Y.Lan，等，″TNF-Alpha Up-Regulates Renal MIF Expression in Rat Crescentic Glomerulonephritis″，Mol.Med.，3，136-144(1997)，T.Shimizu，等，″Increased production of Macrophage Migration Inhibitory Factor by PBMCs of Atopic Dermatitis″，J.Allergy Clin.Immunol.，104，659-669(1999))，炎性肺病(S.C.Donnelly，等，″Regulatory Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor in Acute Respiratory Distress Syndrome″，Nat.Med.，3，320-323(1997)，H.Makita，等，″Effect  of Anti-Macrophage Migration Inhibitory Factor Antibody on Lipopolysaccharide-Induced Pulmonary Neutrophil Accumulation″，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，158，573-579(1998)，A.G.Rossi，等，″Human Circulating Eosinophils Secrete Macrophage Migration Inhibitory Factor(MIF).Potential Role in Asthma″，J.Clin.Invest.，101，2869-2874(1998))，癌症(J.Chesney，等，″An Essential Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor(MIF)in Angiogenesis and Growth of a Murine Lymphoma″，Mol.Med.，5，181-191(1999)，M.T.del Vecchio，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor in Prostatic Adenocarcinoma：Correlation with Tumor Grading and Combination Endocrine Treatment-Related Changes″，Prostate，45，51-57(2000)，J.D.Hudson，等，″AlProinflammatory Cytokine Inhibits p53Tumor Suppressor Activity″，J.Exp.Med.，190，1375-1382(1990)，A.Kamimura，等，″Intracellular Distribution of Macrophage Migration Inhibitory Factor Predicts the Prognosis of Patients with Adenocarcinoma of the Lung″，Cancer，89，334-341(2000)，K.Meyer-Siegler，等，″Increased Stability of Macrophage Migration Inhibitory Factor(MIF)in DU-145Prostate Cancer Cells″，J.Interferon Cytokine Res.，20，769-778(2000)，T.Shimizu，等，″High  Expression of Macropha ge  Migration Inhibitory Factor in Human Melanoma Cells and Its Role in Tumor Cell Growth and Angiogenesis″，Biochem.Biophys.Re s.Commun.，264，751-758(1999)，Takahashi，等，″Involvement of MacrophageMigration Inhibitory Factor(MI F)in the Mechanism of Tumor Cell Growth″，Mol.Med.，4，707-714(1998))，心肌梗塞(M.Takashashi，等，″Elevation of Plasma Levels of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Patients with Acute Myocardial Infarction″，Am.J.Cardiol.，89，248-249(2002)，M.Takahashi， 等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor as a Redox-Sensitive Cytokine in Cardiac Myocytes″，Cardiovasc Res.，52，438-445(2001)，C.M.Yu，等，″Elevation of Plasma Level of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Patients with Acute Myocardial Infarction″，Am.J.Cardiol.，88，774-777(2001))，和败血症性休克(J.Berhnagen，等，″MIF is a Pituitary-Derived Cytokine that Potentiates Lethal Endotoxaemia″，Nature，365，756-759(1993)，M.Bozza，等，″Targeted Disruption of Migration Inhibitory Factor Gene Reveals Its Critical Role in Sepsis″，J.Exp.Med.189，341-346(1999)，T.Calandra，等，″MIFas a Glucocorticoid-I nduc ed Modulator of Cytokine Production″，Nature，377，68-71(1995)，T.Caland ra，等，″Protection from Septic  Shock by Neutralization of Macrophage  Migration Inhibitory Factor″，Nat.Med.，6，164-170(2000)，T.Calandra，等，″Macrophage  Migration Inhibitory Factor is a Critical Mediator of the Activation of Immune Cells by Exotoxins ofGram-Positive Bacteria″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，11383-11388(1998))。有一些证据证实，单克隆的或多克隆的抗-MI F抗体可能影响败血症的病理学，然而尚未在人类中穷尽地表征它们的作用。但是，在败血症性休克的过程中，MIF在动物和人的血浆中增多，并且单克隆或多克隆抗体对MIF活性的封闭，能导致患有实验诱导败血症的动物的存活率显著提高(M.Bozza，等，″Targeted Disruption of Migration Inhibitory Factor Gene Reveals Its Critical Role in Sepsis″，J.Exp.Med.189，341-346(1999)，T.Calandra，等，″Protection from Septic Shock by Neutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor″，Nat.Med.，6，164-170(2000))。 

已经用许多抑制剂证实了对MI F活性的封闭。如2002年8月23日提交的目前未决的美国专利申请系列号10/226,299所述，已经用 多种化学化合物证实了对MIF酶活性的封闭。也参见，例如，美国专利号6,492,428。如美国专利号6,030,615所述，还已经使用抗体来封闭MIF活性。使用1996年10月24日提交的目前未决的美国专利申请系列号08/738,947或美国专利号6,268,151公开的反义技术，也可以抑制MIF表达，美国专利号6,268,151另外证实了可以与所有上述的MIF抑制剂一起使用的药物制剂。 

脂多糖(LPS)能抑制固有的心肌收缩性，且认为其对于发生在败血症和败血症性休克中的心肌功能障碍是重要的(A.M.Lefer，″Mechanisms of cardiodepression in endotoxin shock″，Circ Shock Suppl 1：1-8(1979)，J.E.Parrillo，等，″Acirculating myocardial depressant substance in humans with septic shock.Septic shock patient swith a reduced ejection fraction have a circulating factor that depresses in vitro myocartdial cell performance″，J.Clin.Invest.76：1539-1553(1985)，J.M.Reilly，等，″A circulating myocardial depressant substance is associated with cardiac dysfunction and peripheral hypoperfusion(lactic acidemia)in patients with septic shock″，Chest.95：1072-1080(1989))。在LPS攻击后，会释放出许多促炎性的细胞因子，已经证实它们能直接介导观察到的心脏功能障碍，包括TNF-α，I L-1β，IL-6，IL-18，NO和巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)(O.Court，等，″Clinical review：Myocardial depression sepsis and septic shock″，Crit.Care 6：500-508(2002)，L.B.Garner，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor is a caridac-derived myocardial depressant factor″，Am.J.Physiol Heart Circ Physiol，285：H 2500-2509(2003)，S.Krishnagopalan，等，″Myocardial dysfunction in the patient with sepsis″，Curr.Opin.Crit.Care 8：376-388(2002))。最近，我们在亚致死量的内毒素攻击(内毒素中毒)的模型中，描述了巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)作为心脏衍生的心肌抑制因子(L.B.Garner，等，″Macrophage  Migration Inhibitory Factor is a cardiac-derived myocardial depressant factor″，Am.J.Physiol Heart Circ.Physiol 285：H2500-2509(2003))。LPS攻击诱导了促炎性的细胞因子MIF的组成性存在，到12小时最大释放。在该模型中MIF的释放与显示MIF介导的心脏功能障碍平行，其在LPS攻击后延迟。抗-MIF抗体对MIF的中和，导致了显著的保护，在8小时开始且到48小时完全消除((L.B.Garner，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor is a cardiac-derived myocardial depressant factor″，Am.J.Physiol Heart Circ.Physiol285：H 2500-2509(2003)))。在前述的细胞因子中，在它的延迟释放和阻断下游介质的能力方面，MI F是独特的。 

研究人员以前已经报道了心肌中的TNF-α水平和在内毒素血症过程中发生的收缩功能障碍之间在时间上的不一致性(X.Meng，等，″TNF-alpha and myocardial depression in endoxtoxemic rats：temporal discordance of an obligatory relationhship″，Am.J.Physiol 275：R502-508(1998))。也就是说，在TNF-α水平恢复到基线之前，心脏功能障碍不会发生，表明TNF-α是其它心脏抑制剂的重要标记信号，所述的心脏抑制剂能更直接地协同作用，造成败血症中的功能障碍。尚不清楚这些早期细胞因子的重要性，但是，已经在人实验中测试了针对败血症性休克的早期介质的治疗策略(例如抗-IL-1β和抗-TNF-α模态)，没有观察到益处，可能是由于它们在该疾病过程中的较早出现(C.J.Fisher，等，″Recombinant human inerleukin 1 receptor antagonist in the treatment of patients with sepsis syndrome.Results from a randomized，double-blind，placebo-controlled trial″，Phase IIIrhIL-1ra Sepsis Syndromve Study Group，Jama，271：1836-1843(1994)，C.J.Fisher，等，″Initial evaluation of human recombinant interleukin-1receptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome：a randomized，open-label，placebo-controlled multicenter trial″，The IL-1RA Sepsis Syndrome Study Group，Crit.Care Med.，22： 12-21(1994)，C.Natanson，等，″Selected treatment strategies for septic shock based on proposed mechanisms of pathogenesis″，Ann.Intern.Med.，120：771-783(1994)，K.Reinhart，等，″Anti-tumor necrosis factor therapy in sepsis：update on clinical trials and lessons learned″，Crit.Care Med.，29：S121-125(2001))。 

巨噬细胞迁移抑制因子(MI F)也参与几种疾病的发病机理，包括败血症。MIF能对抗糖皮质激素的抗炎作用，且也能显著改变组织代谢。尽管MIF似乎是普遍表达的，目前没有出版物表明MIF是否在体内在心肌中表达，或者在败血症的过程中，MIF从心肌或其它组织的释放是否能负面地影响心脏性能。 

在败血症过程中的心脏功能障碍(O.Court，等，″Clinical review：Myocardial depression sepsis and septics hock″，Crit.Care，6：500-508(2002)，S.Krishnagopalan，等，″Macrophage Dysfunction in the Patient with Sepsis″，Curr.Opin.Crit.Care，8，376-388(2002))与人(P.Ammann，等，″Elevation of Troponin I in Sepsis and Septic Shock″，Intensive Care Med.，27，965-969(2001)，C.N.Sessler，等，″New Concepts in Sepsis″，Curr.Opin.Crit.Care，8，465-472(2002))和动物模型(M.Bozza，等，″Targeted Disruption of Migration Inhibitory Factor Gene Reveals Its Critical Role in Sepsis″，J.Exp.Med.，189，341-346(1999)，T.Calandra，等，″Protection from Septic Shock by Neutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor″，Nat.Med.，6，164-170(2000))中的不良后果相关。以前已经证实，败血症或烧伤伴随的心脏功能障碍主要是由于循环心肌抑制因子，包括TNF-α(B.P.Giroir，等，″Inhibition of Tumor Necrosis Factor Prevents  Myocardial Dysfunction  During Burn Shock″，Am.J.Physiol.，267，H118-H124(1994)，Ha udek，等，″Differential Regulation of Myocardial NF Kappa B Following Acute or Chronic  TNF-Alpha Exposure″，J.Mol.Cell Cardiol.，33，1263-1271(2001)，A.Kumar，等，″Tumor Necrosis Factor Alpha and Interleukin 1Beta are Responsible for in vitro Myocardial Cell Depression Induced by Human Septic Shock Serum″，J.Exp.Med.，183，949-958(1996))。但是，由于TNF-α是标记性的快速响应细胞因子，且在分辨心肌功能障碍之前数天或周就从循环中消失，仍然需要发现是否可能存在其它的心肌抑制蛋白。 

以前的使用活细菌的研究，通过直接腹膜内地注射大肠杆菌或通过盲肠结扎和穿刺(CLP)，已经证实了MIF血浆和/或腹膜液水平在攻击后几小时增加，且针对MIF的抗体能保护小鼠免于致命的细菌性腹膜炎(T.Calandra，等，″Protection from Septic Shock by Neutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor″，Nat.Med.，6，164-170(2000))。另外，当晚至感染发作后8小时施用抗体时，能保护小鼠(T.Calandra，等，″Protection from Septic Shock by Neutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor″，Nat.Med.，6，164-170(2000))。 

MIF具有许多令它在细胞因子中与众不同的性质。MIF能从许多细胞类型中预形成释放，包括淋巴细胞、巨噬细胞和脑垂体前叶(J.Bernha gen，等，″Regulation of the Immune Response by Macrophage Migration  Inhibitory Factor：Biological and Structural Features″，J.Mol.Med.，76，151-161(1998)，T.Calandra，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor(MIF)：AGlucocorticoid Counter-Regulator Within the Immune System″，Crit.Rev.hnmunol.，17，77-88(1997)，S.C.Donnelly，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor：A Regulator of Glucocorticoid Activity with a Critical Role in Inflammatory Disease″，Mol.Med.Today，3，502-507(1997)，R.A.Mitchell，等，″Tumor Growth-Promoting Properties of Macrophage Migration Inhibitory Factor(MIF)″，Semin.Cancer Biol.，10，359-366 (2000))。但是，MIF的来源清单继续增长，且包括其它组织，例如肺、肝、肾上腺、脾、肾、皮肤、肌肉、胸腺、皮肤和睾丸(M.Bacher，等，″Migration  Inhibitory Factor Expression in Experimentally Induced Endotoxemia″，Am.J.Pathol.，150，235-246(1997)，G.Fingerle-Rowson，等，″Regulation of Macrophage Migration Inhibitory Factor Expression by Glucocorticoids in vivo″，Am.J.Pathol，162，47-56(2003))。MIF至少具有2种不同的催化活性：互变异构酶和氧化还原酶活性。为此，已经开发了MIF互变异构酶活性的药理学抑制剂，用于治疗MIF-相关的疾病，例如败血症，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，哮喘，特应性皮炎，类风湿性关节炎，肾病，和癌症(A.Dios，等，″Inhibition of MIF Bioactivity by Rational Design of Pharmacological Inhibitors of MIF Tautomerase Activity″，J.Med.Chem.，45，2410-2416(2002)，M.Orita，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor and the Discovery of Tautomerase Inhibitors″，Curr.Pharm.Des.，8，1297-1317(2002))。已经证实，这些疾病能从抗-MIF抗体获益。 

几项研究表明，MIF可能通过直接的和间接的机理发挥作用。以前的研究已经提供证据，MIF能促进其它促炎性细胞因子的释放和药效学作用。能表达反义MIF cDNA(导致较少的内源性MIF)的巨噬细胞分泌/表达明显更少的TNF-α，IL-6和NO，而LPS会引起NF-κB活性的降低(44)。因此，MIF好像直接与LPS信号转导途径相互作用(H.Lue，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor(MIF)：Mechanisms of Action和Role in Disease″，Microbes Infect.，4，449-460(2002))。另外，如2002年12月19日提交的美国专利申请号(代理案卷号9551-095-27)所证实的，对致死量的LPS有抗性的MI F敲除的(MIFKO)小鼠具有比处于基线的野生型小鼠更低的TNF-α循环血浆水平。经LPS攻击，它们表现出循环TNF-α浓度的减小，一氧化氮(NO)浓度增加，IL-6和IL-12浓度未改变(M.Bozza，等，″Targeted Disruption of Migration Inhibitory Factor Gene Reveals  Its Critical Role in Sepsis″，J.Exp.Med.189，341-346(1999))。尽管MIF似乎能促进促炎性细胞因子，已经证实了MIF的效果以独立于TNF-α的方式起作用。当在TNF-α敲除的小鼠中进行CLP时，与野生型小鼠的0％生存率相比，在施用了抗-MIF抗体的小鼠中观察到了60％生存率(T.Calandra，等，″Protection from Septic Shock by Neutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor″，Nat.Med.，6，164-170(2000))。 

关于与败血症无关的心脏功能障碍，还已经在急性心肌梗塞后的患者中描述了升高的血清MIF浓度(M.Takahashi，等，″Elevation of Plasma Levels of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Patients with Acute Myocardial Infarction″，Am.J.Cardiol.，89，248-249(2002)，M.Takahashi，等，″Macrophage MigrationInhibitory  Factor as a Redox-Sensitive  Cytokine in CardiacMyocytes ″，Cardiovasc Res.，52，438-445(2001)，C.M.Yu，等，″Elevation of Plasma Level of Macropha ge Migration InhibitoryFactor in Patients with Acute Myocardial Infarction″，Am.J.Cardiol.，88，774-777(2001))，生理相关性至今未知。类似地，已经注意到培养的心肌细胞能释放MIF，作为对缺氧和过氧化氢(自由基引发剂)的响应，但是对血管紧张肽II，内皮缩血管肽-1，IL-1β，或TNF-α无响应(J.Fukuzawa，等，″Contribution of Macrophage Inhibitory Factor to Extracellular Signal-Regulated KinaseActivation by Oxidative Stress in Card iomyocytes″，J.Biol.Chem.，277，24889-24895，M.Takahashi，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor as a Redox-Sensitive Cytokine in Cardiac Myocytes″，Cardiovasc Res.，52，438-445(2001))。存在许多能潜在地触发心肌的MIF释放、从而负面地影响心脏功能的临床情况。心脏功能障碍可通过心肌细胞和心脏组织的任何异常的状况得以表现。这样的功能障碍通常包括但不限于心肌炎，心内膜炎，心包炎，风湿性心脏病，心肌梗塞，心律失常，纤颤，心原性休克， 局部缺血，肥大，心肌病，心绞痛，心脏杂音或心悸，心脏病发作或心力衰竭，和与先天性心脏病有关的任何症状或缺陷。 

巨噬细胞迁移抑制因子能在许多器官中表达，包括心脏，且已经与内毒素中毒鼠模型中的延迟的心脏功能障碍相联系(Garner，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor is A Cardiac-Derived Myocardial Depressant Factor″，Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol，258，H2500-H 2509(2003))。 

烧伤会导致包含降低的心输出量、休克和左心室衰竭的心脏损伤和收缩功能障碍(J.T.Murphy，等，″Evaluation of Troponin-Ias An Indicator of Cardiac Dysfunction After  Thermal Injury，45，700-704，(1998)，E.M.Reynolds，等，″Left Ventricular Failure Complicating  Severe Pediatric Burn Injuries″，J.Pediatr.Sur g.30，264-269；discussion  269-270(1995)，W.C.Shoemaker，等，k″Burn Pathophysiology  In Man.I.SequentialHemodynamic Alterations，J.Surg.Res.，14，64-73(1973)，R.R.Wolfe，等，″Review：Acute Versus Chronic Response to Burn Injury″，Circ.Shock，8，105-115(1981))。已经报道，这些收缩缺陷早在烧伤后2小时就出现(J.W.Horton，等，″Postbum Cardiac Contractile Function  and Biochemical Markers of Postburn Cardiac Injury″，J.Am.Coll.Surg.，181，289-298(1995))。一些近期的研究已经阐明了早期的分子事件，其涉及对肠衍生的因子作出响应的内毒素信号转导途径，包括toll-样受体4(Tlr-4)，I RAK，和NF-kB(D.L.Carlson，等，″I Kappa B Overexpression in Cardiomyocytes Prevents NF-Kappa B Translocation and Provides Cardioprotection in Trauma″，Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol，284，H804-814(2003)，J.T.Sambol，等，″Burn-Induced Impairment of Cardiac Contractile Function is Due to Gut-Derived Factors Transported in Mesenteric Lymph″，Shock，18，272-276(2002)，J.A.Thomas，等，″IRAK Contributes to  Burn-Triggered Myocardial Contractile Dysfunction″，Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.，283，H829-836(2002)，J.A.Thomas，等，″TLR4Inactivation and rBPI(21)Block Burn-Induced Myocardial Contractile Dysfunction″，Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.，283，H1645-1655(2002))。 

尽管通过Tlr-4受体内毒素信号转导代表着烧伤伴随的心脏功能障碍的初始途径，其它研究人员已经证实，早期的下游介质包括TNF-α，IL-1β，和IL-6(H.Lue，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor(MIF)：Mechanisms of Action和Role in Disease″，Microbes Infect.，4，449-460(2002))。在实验中，当阻断TNF-α时，会减轻烧伤伴随的心脏功能障碍，强调了它作为功能障碍的关键调节剂的重要性(B.P.Giroir，等，″Inhibition of Tumor Necrosis Factor Prevents Myocardial Dysfunctional During Burn Shock″，Am.J.Physiol.，267，H118-124(1994))。当在人实验中测试针对败血症性休克的早期介质的治疗方案(例如抗-IL1β和抗-TNF-α模态)时，没有观察到益处，可能是由于它们在该疾病过程中的较早出现(C.J.Fisher，等，″Recombinant human inerleukin 1receptor antagonist in the treatment of patients with sepsis syndrome.Results from a randomized，double-blind，placebo-controlled trial″，Phase III rhIL-1ra Sepsis Syndromve Study Group，Jama，271：1836-1843(1994)，C.J.Fisher，等，″Initial evaluation of human recombinant interleukin-1receptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome：a randomized，open-label，placebo-controlled multicenter trial″，The IL-1RA Sepsis Syndrome Study Group，Crit.Care Med.，22：12-21(1994)，C.Natanson，等，″Selected treatment strategies for septic shock based on proposed mechanisms of pathogenesis″，Ann.Intern.Med.，120：771-783(1994)，K.Reinhart，等，″Anti-tumor necrosis factor therapy in sepsis：update on  clinical trials and lessons learned″，Crit.Care Med.，29：S121-125(2001))。 

最近，已经证实称作巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的细胞因子在败血症死亡率中起关键作用(H.Lue，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor(MIF)：Mechanisms of Action and Role in Disease″，Micorbes Infect.，4，449-460(2002))。实际上，已经证实抗-MI F疗法能显著提高败血症的致死模型(盲肠结扎和穿刺)中的存活率，甚至在长达损伤后8小时施用时(T.Calandra，等，″Protection From Septic Shock Byneutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor″，Nat.Med.，6，164-170(2000))。另外，已经证实MIF在ARDS(K.N.Lai，等，″Role For Macrophage Migration Inhibitory Factor in Acute Respiratory Distress Syndrome″，J.Patho l.，199，496-508(2003))-烧伤的普遍并发症(M.Bhatia，等，″Role of Inflammatory Mediators in the Pathophysiology of Acute Respiratory Distress Syndrome″，J.Pathol.，202，145-156(2004))中起关键作用。此研究的目的则是，使用明确的鼠烧伤模型，鉴别和表征MI F为烧伤伴随的心脏病态的有用治疗靶(Garner，等，″Macrophage Migration Inhibitory Factor is a Cardiac-Derived Myocardial Depressant Factor″，Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.，285，H2500-2509(2003))。 

因此，仍然需要对目前得不到治疗的心脏抑制、心脏功能障碍、烧伤伴随的病态和心脏保护的疗法。 

美国专利号6,030,615涉及用于治疗由细胞因子-介导的毒性造成的疾病的方法和组合物。 

美国专利号6,420,188涉及用于拮抗MIF活性的方法和组合物，和治疗多种基于该活性的疾病的方法。 

美国专利号6,599,938涉及用于拮抗MIF活性的方法和组合物，和治疗多种基于该活性的疾病的方法。 

美国专利号6,645,493涉及用于抑制MIF的释放和/或生物活性 的组合物和方法。 

发明简述 

本发明的一个实施方案涉及药物组合物，其对于选自下述的至少一项是有效的：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包含： 

有效量的至少一种抗-MI F抗体；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其对于选自下述的至少一项是有效的：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包含： 

有效量的至少一种抗-CD74抗体，和 

有效量的至少一种药学上可接受的载体。 

本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其对于选自下述的至少一项是有效的：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包含： 

有效量的至少一种抗-TNFR抗体； 

有效量的至少一种抗-MIF抗体；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。 

本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。 

本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种抗-CD74抗体。 

本发明的另一个实施方案涉及改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。 

本发明的另一个实施方案涉及鉴别MIF抑制剂的方法，该方法包括： 

将至少一个肌细胞暴露于至少一种MIF； 

检测至少一种MIF-相关的肌细胞活性； 

将肌细胞暴露于所述的MIF和至少一种候选剂； 

检测在有候选剂存在的情况下，MIF-相关的肌细胞活性；和 

检测候选剂是否能影响MIF-相关的肌细胞活性。 

本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种抗-TNFR抗体和有效量的至少一种抗-MIF抗体。 

本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。 

本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防对象中烧伤伴随的 心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-MIF抗体和至少一种药学上可接受的载体。 

本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-CD74抗体和至少一种药学上可接受的载体。 

本发明的另一个实施方案涉及改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-MIF抗体和至少一种药学上可接受的载体。 

本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-TNFR抗体，至少一种抗-MIF抗体，和至少一种药学上可接受的载体。 

本发明的另一个实施方案涉及用于选自下述的至少一项的方法：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包括给所述的对象施用有效量的至少一种选自下述的试剂：小分子MIF抑制剂，其盐，其前药，和其组合。 

本发明的另一个实施方案涉及用于选自下述的至少一项的方法：治疗或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包括给需要的对象施 用有效量的至少一种抗-TNFR抗体；和任选地，至少一种药学上可接受的载体。 

附图说明

当结合附图阅读时，能更好地理解前面的描述。为了解释本发明的目的，在附图中显示了一个目前优选的实施方案，但是应当理解，本发明不限于所示的准确安排和手段。 

图1：在心脏组织中，在LPS攻击12小时内，检测了MIF蛋白释放。每个数据点是3个独立的蛋白印迹实验的平均值(+/-标准误差)。在图下面显示了代表性的蛋白印迹。*p＜0.05 

图2：LPS攻击不能上调心脏组织中的MIF mRNA。图中每个数据点是3个独立的RNA印迹实验的平均值(+/-标准误差)。在图下面显示了代表性的RNA印迹。没有鉴别出时间点之间的显著差异(p＞0.05). 

图3：在LPS攻击之前和之后，MIF存在于心脏、肝和脾中。在LPS攻击后12小时(B，E，和H)，在心脏、肝和脾(A，D，G)中预形成的MIF减少，且在24小时后(C，F，和1)再补充，如免疫组织化学所证实的。放大率：100X(肾，脾)，400X(心脏)。 

图4：rMIF攻击后，在C57BL/6J小鼠和内毒素-抗性的C3H/HeJ小鼠中通过Langendorff制品测得的心脏功能，证实了rMIF能以独立于LPS的机理介导心脏功能障碍。数据代表着每组7(C3H/HeJ)至10(C57BL/6J)个独立的Langendorff实验的平均值。*p＜0.05. 

图5：LPS和LPS+抗-MIF抗体施用对心脏功能的影响的超声心动图评估。处于基线的和LPS施用后8小时的野生型小鼠中的代表性的M-模式超声心动图，分别是A和B。C和D分别显示了在8和48小时时LPS+抗-MIF处理的小鼠中的代表性的超声心动图。当处理前给予抗-MIF抗体时，在LPS攻击的小鼠中观察到了心脏功能的显著保护(FS％)(E)。数据代表着来自在多个时间点监视的3只小鼠的9个心动周期的平均值。*p＜0.05. 

图6：证实LPS攻击后抗-MIF抗体对MIF的抑制的烧伤模型。烧 伤数据证实抗-MIF抗体对MIF的抑制，和在烧伤后恢复心脏功能。 

图7：证实热伤后心脏的MIF释放速度的图示。巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)在心脏组织中组成性地表达，且在烧伤后8小时最大释放。每个数据点代表着3个独立的蛋白印迹实验的平均密度，任意单位(A.U.)/mm²±SE。在图下面显示了代表性的蛋白印迹。采用单向ANOVA和使用Tukey方法的多重比较方法，确定了与对照组相比的统计显著性(*p＜0.05). 

图8：证实MI F存在于多种组织样品中的免疫化学染色载玻片。插图G-烧伤后，组成性地存在于心脏、肝、脾、肺和肾中的MIF减少。在烧伤后8小时，心脏、肾和脾(A，E，I)中的预形成的MI F会减少(B，F，J)，除了肝(M，N)以外，并在24小时时在心脏和肾中增加(C，G)，但是不在心脏或肝中(K，0)，如通过免疫组织化学所证实的。阴性对照(二抗，没有一抗抗-MI F抗体)一致地证实了，在每个时间点，在研究的每个器官中都不存在背景染色，如最右列所代表的(D，H，L，P)。放大率：100X(肾，脾，肝)，400X(心脏).

图9：热伤后，3种不同的细胞因子随时间的浓度变化的图示。图9-烧伤后，MIF(ng/ml)，IL-12(pg/ml)，和IL-6(pg/ml)的血清浓度(分别是A-C)。将数据表达为通过ELISA测得的6只C57BL/6J小鼠的平均值±SE，并使用单向-ANOVA，以及采用Bonferroni方法的多重比较方法，进行统计学分析，以确定组间的显著性(与基线相比，*p＜0.05). 

图10：证实热伤后MIF mRNA上调的图示和代表性的RNA印迹。到8小时，烧伤显著上调心脏组织中的MIF mRNA表达。使用与MIF和β-肌动蛋白mRNA互补的³²P放射性标记的探针，检测了MIF和β-肌动蛋白mRNA。每个数据点代表着3个独立的RNA印迹实验的平均密度，任意单位(A.U.)/mm²±SE。在图下面显示了代表性的RNA印迹。通过用存在的相对β-肌动蛋白密度乘以MIF密度，确定了标准化的MIF。采用单向ANOVA和使用Tukey方法的多重比较方法，确定了与基线相比的统计显著性(*p＜0.05). 

图11：计算出的冠状动脉血流速度的图示以3种不同方式对比未治疗的热伤和用抗-MI F治疗的热伤的流速的控制测量。烧伤后18小时，通过Langendorff制品测得的心脏功能随冠脉血流量(A)和Ca²⁺而变化。将心脏功能表达为25个独立的Langendorff实验(11假操作，9烧伤，5抗-MI F处理后的烧伤)的平均值±SE。使用重复测量ANOVA和采用Bonferroni方法的多重比较方法，对随治疗组和冠状动脉血流速度而变的每个LVP，+dP/dt_max，和-dP/dt_max，进行单独的分析，以确定组间的显著性差异(*p＜0.05). 

图12：烧伤后抗-MI F抗体治疗作用的超声心动图和图示，证实了MIF封闭的心脏保护作用。烧伤后抗-MIF抗体治疗作用的超声心动图评估，证实了MIF封闭的心脏保护作用。A和B分别代表了处于基线和烧伤后8小时的野生型小鼠中的代表性的M-模式超声心动图。C和D分别说明了在4和48小时烧伤+抗-MIF处理的小鼠中的代表性的超声心动图。在烧伤前施用抗-MIF抗体的烧伤小鼠中，观察到了心脏功能的明显恢复(FS％)(E)。来自每组的数据，代表着来自在多个时间点监视的3只小鼠的9个心动周期的平均值±SE。将通过超声心动描记术测定的心脏功能表达为缩短分数％(LVED-LVES/LVED x 100)±SE，并使用单向重复测量-ANOVA和采用Tukey检验的多重比较方法分析，确定特定组之间的显著性差异。 

图13：在(A)野生型小鼠，(B)TNFR-/-小鼠，和(C)用 预处理(60分钟)的野生型小鼠中进行4mg/kg内毒素攻击后的血清MIF浓度(从基线倍数增加)。将数据表达为(A)6只C57BL/6J小鼠，(B)6只TNFR-/-小鼠，和(C)用 预处理的3只C 57BL/6J小鼠的MIF的基线水平分数(平均值+/-标准误差)。通过ELISA测定了血清水平，并使用单向-ANOVA和采用Bonferroni方法的多重比较方法进行统计学分析，确定组间显著性(与基线相比，*p＜0.05)。 

图14：在心脏组织中进行LPS攻击后，未检测到MI F蛋白释放。每个数据点是3个独立的蛋白印迹实验的平均值(+/-标准误差)。在图下面显示了代表性的蛋白印迹。*p＜0.05 

图15：在TNFR-/-小鼠中LPS攻击之前和之后，心脏、肝和脾中MIF的存在。在LPS攻击后12小时(B，F，J)，在心脏、肝和脾中的预形成的MIF(A，D，G)没有降低(而这种现象在野生型小鼠中观察到)，如通过免疫组织化学所证实的。放大率：100X(肾，脾)，400X(心脏)。 

图16：LPS攻击不能上调TNFR-/-小鼠心脏组织中的MIF mRNA。图中的每个数据点是3个独立的RNA印迹实验的平均值(+/-标准误差)。在图下面显示了代表性的RNA印迹。没有鉴别出时间点之间的显著差异(p＞0.05). 

图17：在C57BL/6J，B6/129S，和TNFR-/-小鼠中进行rMI F攻击后，通过Langendorff制品测定的心脏功能，证实了rMI F能体外介导独立于TNF-α信号转导的心脏功能障碍。数据代表着每组6个(C 57BL/6J)，4个(B6/129S)，和4个(TNFR-/-)独立的Langendorff实验的平均值。*p＜0.05. 

图18：LPS和LPS+抗-MIF抗体施用对TNFR-/-小鼠的心脏功能的作用的超声心动图评估。A和B分别代表了处于基线和LPS施用后4小时野生型小鼠中的代表性的M-模式超声心动图。C和D分别说明了在4和48小时LPS+抗-MIF处理的小鼠中的代表性的超声心动图。当在处理前施用抗-MIF抗体时，在LPS攻击的小鼠中观察到了心脏功能的明显保护(FS％)(E)。数据代表着来自在多个时间点监视的3只小鼠的9个心动周期的平均值。*p＜0.05. 

图19：LPS攻击后，野生型和TNFR-/-小鼠中的血清细胞因子测定。在Luminex平台上，测试了炎性细胞因子组的：(A)TNF-α，(B)IL-β，(C)IFN-γ，(D)IL-12，(E)IL-10，＝(F)IL-6，(G)GM-CSF，和IL-2，IL-4，IL-5(未显示数据)。将数据表达为3只独立的实验小鼠在每个时间点的血清细胞因子浓度的平均值+/-标准误差。 

图20：有或没有抗-MIF预处理(90分钟)，LPS攻击后野生型中的血清细胞因子测定。显示出了受调制的细胞因子：(A)IFN-γ和(B)IL-10，如在Luminex平台上所测定的。将数据表达为3只独立的实 验小鼠在每个时间点的血清细胞因子浓度的平均值+/-标准误差。 

图21：对比了仅LAD和抗-MIF+LAD，LAD结扎后的心脏功能(缩短分数)。 

图22：显示了仅LAD和抗-MIF+LAD，LAD之前的抗-MIF台疗的效果。 

图23：显示了几个治疗组在LAD后48小时的心脏功能数据。 

图24：显示了以预先的和延迟的抗-MIF台疗，在LAD后48小时的血清肌钙蛋白浓度。 

图25：显示了结扎后2周的血清肌钙蛋白I和MIF浓度。 

图26：显示了器官CD74组成性表达和心脏CD74在LPS攻击后的表达。 

图27：显示了几个组在LPS攻击后从t＝0至t＝48小时的超声心动图/缩短分数。 

图28：显示了LPS攻击后的血清sCD74释放。 

图29：显示了CD74系列凝胶。也参见表5。 

图30：显示了CD74KO小鼠的冠状动脉血流速度v.LVP，+dP/dt max，如-dP/dt max。 

图31.显示了对照、小分子MI F抑制剂+DMSO/MI和DMSO/MI的结扎后小时v.缩短分数。 

发明详述 

从下面的发明详述中，可以更充分地明白、同时更好地理解本发明的各种其它目标、特征和附加的优点，除非另有说明，它无意进行限制。 

本发明的一个优选的实施方案涉及治疗和生物测定的方法，其涉及作为心脏-衍生的心肌抑制因子的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)。 

本发明的一个优选的实施方案涉及治疗和/或预防与烧伤相关的心脏功能障碍的方法。 

本发明的一个优选的实施方案涉及调制MIF作为对心肌梗塞的治 疗。 

本发明的一个优选的实施方案涉及在心脏功能障碍中TNF-α的调制。 

本发明的一个优选的实施方案涉及通过CD74的抑制进行心脏保护的方法。 

本发明的一个优选的实施方案涉及用抗-MIF抗体对MIF进行调制。 

本发明的一个优选的实施方案涉及用于鉴别能抑制MIF活性的试剂的生物测定。 

本发明的一个优选的实施方案涉及抗-MIF抗体对MIF的抑制和伴随的(烧伤后)心脏功能的恢复。 

本发明的一个优选的实施方案涉及通过施用抗-MIF抗体改善烧伤伴随的心脏抑制的方法。 

本发明的一个优选的实施方案涉及通过施用抗-MIF抗体改善急性心肌梗塞后的心脏功能。 

本发明的一个优选的实施方案涉及一项发现，即来自心脏、肝和脾的MI F释放依赖于TNF-α受体I/II信号转导，因而TNF-α可以是治疗靶物。 

本发明的一个优选的实施方案涉及用重组人TNFR:Fc中和TNF-α。 

本发明的一个优选的实施方案涉及用一种或多种抗-MIF抗体中和MIF活性。 

本发明的一个优选的实施方案涉及TNF-α作为MIF的上游介质的发现。 

本发明的一个优选的实施方案涉及一项发现，即CD74(MIF受体)在心肌细胞上表达，且是心脏功能障碍的“关键”介质。 

本发明的一个优选的实施方案涉及通过用一种或多种抗-CD74单克隆中和抗体抑制CD74受体，抑制MIF和改善心脏保护。 

本发明的一个优选的目标涉及治疗和/或预防心脏功能障碍的方 法，例如心肌活性的紊乱或抑制。该方法优选地包括施用有效量的组合物，其包含巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)抑制剂。抑制剂可以是抗体。抑制剂可以影响特定的MIF活性，包括酶活性，例如互变异构酶活性或氧化还原酶活性。 

本发明的一个优选的实施方案涉及用于鉴别能抑制MIF活性的试剂的试验。该试验优选地包含体外或体内的肌细胞和MIF，在有和没有可抑制MIF活性的试剂存在的情况下。该试验能分析肌细胞活性，使用免疫化学或超声心动描记术等工具，在有MIF和潜在的抑制剂存在的基础上。 

本发明的一个优选的实施方案涉及使用该实验来鉴别能抑制MIF活性的试剂的方法，其包括：在有可抑制MIF活性的试剂存在的情况下，放置肌细胞和MIF，并检测对肌细胞活性的作用。肌细胞可以是体外或体内的，且可以使用免疫化学或超声心动描记术测量作用。 

本发明人已经发现，MIF是心肌功能障碍的诱导物，已知后者能明显助长人败血症的发病率和死亡率。在人患者和动物模型中，与败血症有关的心脏功能障碍的特征在于，双心室扩张，减少的心脏收缩期收缩性，和减少的心脏舒张期松弛。不希望受理论的约束，认为它的发病机理是多因子的，全身和心肌衍生的细胞因子例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)参与诱导它的发作。 

本申请的一个实施方案指向鉴别MIF或其它的心脏衍生的蛋白是否能通过旁分泌或自分泌机理介导败血症和其它心脏病中的心肌功能障碍。小鼠中的心脏基因表达的筛选微阵列分析表明，MIF在心脏中表达，且在脂多糖(LPS)-攻击后受到有差别的调节。考虑到MIF抑制能改善患有实验性败血症的动物的结果的数据，构建了下面的实施例，来验证心肌细胞是否能体内地表达MIF，内毒素攻击是否能改变该表达，和MIF是否对心脏功能具有生理上重要的作用。本文中的几个实施例证实了体内的心脏MIF表达，并确认MIF能在体内亚致死量的内毒素攻击中抑制心脏功能。 

MIF在正常的心肌中组成性地表达，且在内毒素攻击后由心肌细 胞释放，在攻击后12小时心脏组织水平达到最低点。在本申请中，通过蛋白印迹和免疫组织化学观察到了能支持延迟释放的证据，证实了在第12小时时从心脏和脾组织明显释放，并得到了以下事实的间接支持：从第8小时开始、此后持续的心脏保护作用的延迟发生。用抗-MIF单克隆抗体治疗LPS攻击的小鼠，能显著改善体内的心脏功能，如左心室缩短分数的提高所证实的。 

为了进一步证实MIF的心肌抑制作用，用含有一定浓度的重组的MIF(rMIF)的溶液，灌注了分离的搏动的小鼠心脏(Langendorff灌注)。灌注rMIF，导致了对心脏收缩和心脏舒张性能的显著抑制。本发明人已经证实，MIF由心肌细胞体内地合成，并在LPS攻击后释放。因而，MIF能直接介导心脏功能障碍，并证实了MIF作为药理学靶物用于改善败血症和其它心脏病中的心脏功能。 

心脏基因表达的微阵列数据表明，MIF也在心脏组织中表达。本文中的几个实施例表明，MIF灌注能直接体外抑制心脏功能；另外，用针对MIF的2种独立的单克隆抗体中的任一种进行治疗，都能减轻后期的心肌抑制。 

本发明的另一个优选的实施方案涉及治疗和/或预防烧伤伴随的状况的方法，包括但不限于心脏功能障碍，例如心肌活性的紊乱或抑制。该方法优选地包括施用有效量的组合物，其包含巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)抑制剂。该抑制剂可以抑制MI F活性和/或MIF生产。该抑制剂优选地是抗体或蛋白。该抑制剂可以影响特定的MIF活性，包括酶活性，例如互变异构酶活性或氧化还原酶活性。该抑制剂可以抑制或阻断MIF活性或心肌组织中的MIF生产。该抑制剂也可以抑制或阻止MIF释放，例如ABC转运蛋白的抑制剂。 

本发明的另一个优选的实施方案涉及用于鉴别能抑制MIF活性或生产的试剂的试验。该试验包含体外或体内的肌细胞，和可能包含MIF，在有和没有能抑制MIF活性或MIF生产的试剂存在的情况下。该试验将分析肌细胞活性，使用免疫化学或超声心动描记术等工具，在有MIF和潜在的抑制剂存在的基础上。 

本发明的一个实施方案在预防/治疗方法和诊断试验中，利用了MIF在烧伤伴随的心脏功能障碍中的作用。使用鼠烧伤模型(40％TBSA)，本发明人鉴别出了烧伤后8小时组成性的心脏MIF显著减少(2.1倍)，如通过蛋白印迹分析所测定的。在烧伤后4小时，血清MIF达到最大(2.2倍增加)。这些特征与烧伤后从心脏和全身来源的预形成的细胞质储存的MIF释放相一致。如在本文的实施例中观察到的，为了确定MIF在烧伤后的心脏功能障碍中的作用，用抗-MIF中和单克隆抗体预处理了小鼠。从烧伤后4小时开始(并且持续至48小时)，只有烧伤的小鼠表现出了受抑制的左心室缩短分数百分比(FS％)38.6+/-1.8％(假操作的FS％56.0+/-2.6％)。抗-MIF处理的小鼠在烧伤后表现出了延迟的改善的心脏功能，到24小时完全恢复功能。这表明，细胞因子MIF能介导晚期的烧伤伴随的心脏功能障碍，还表明，MIF是用于治疗烧伤伴随的心脏功能障碍以及其它MIF介导的并发症(例如与烧伤相关的ARDS)的药理学靶物。 

烧伤后，MIF在4小时最大释放到血清中(图9)；组织释放到8小时达到最大(心脏和脾)(图7&8)。当用抗体中和MIF时，到12小时心脏功能显著改善，且到24小时完全改善，这证实了MIF调制作为烧伤后体内心脏功能障碍的介质(图12)。 

在烧伤的小鼠模型中，已经证实LPS能通过它与Tlr-4(toll-样受体4)的相互作用和与IRAK-1的相互作用，介导相关的心脏功能障碍。由于几种潜在的与烧伤相关的损害，它们包括肠局部缺血，细菌易位，和提高的肠渗透性，认为LPS的来源是肠-衍生的。不希望受理论的约束，认为炎性因子的生产和释放能通过肠有关的淋巴组织变成全身性的。 

在亚致死量的内毒素中毒小鼠模型(4mg/kg LPS)中，发现MIF能在体内介导晚期心脏抑制作用。还通过Langendorff试验测得，重组的MIF能以独立于LPS的方式体外地诱导即时的心脏抑制。关于烧伤，本发明的-个实施方案与在内毒素中毒模型中得到的观察相比，适当地具有几个优点。首先，与LPS攻击(8小时)相比，MIF在烧 伤模型的更早时间点(4小时，图7)释放，且全身的MIF浓度的增加明显更高(2.2倍增加(图9)vs.1.5倍)。其次，如通过超声心动描记术测得，与内毒素中毒模型相比，心脏功能障碍的程度在烧伤模型中不那么大。关于烧伤，与在4小时时的内毒素中毒模型(67.2FS％-31.1FS％/67.2FS％)中的53.7％相比，本发明人理想地在4小时使缩短分数百分比(心输出量的估计值)从基线降低38％(56.2FS％-34.8FS％/56.2FS％)。根据本发明的一个实施方案的MIF抑制，导致了到24小时完全的心脏保护(图12)，这在内毒素中毒模型中直到48小时才出现，虽然在内毒素中毒模型中在8小时就首次观察到了明显的保护，而在烧伤模型中直到12小时才观察到。这表明，MIF在与烧伤相关的心脏功能障碍中起更大的作用。最后，测得心脏MIF mRNA水平的增加在烧伤中到8小时就显著增加(图10)，而在内毒素中毒模型中直到48小时才增加。尽管已经证实烧伤的心脏作用与肠衍生的LPS相关，有效的损伤比内毒素中毒模型更复杂，因为它涉及皮肤和肠，且是更加生理上相关的疾病过程。 

MIF的中和导致了心脏保护，从12小时开始，而早在4小时，就在烧伤的小鼠中鉴别出了明显的心脏功能障碍(图12)。TNF-α，IL-1β，IL-6，和IL-10由心肌细胞分泌，TNF-α和IL-1β是心肌抑制的主要介质。本发明预想它们在发生在MIF介导的心脏功能障碍之前的早期心脏功能障碍中的作用。由于在通过超声心动描记术观察到的抗-MIF治疗的保护作用(12小时)之前(8小时)，MIF局部地从心脏释放出来，本发明预期，MIF在该模型中在更晚的时间点(烧伤后12-48小时)观察到的心脏功能障碍中起显著作用。在10种全身地研究的其它细胞因子(图9)中，在烧伤后只调制全身的IL-6和IL-12。在前12小时，全身的IL-12水平显著降低，如已经在手术后的败血症患者中报道的。将该TH1细胞因子的降低假设为已经在烧伤中鉴别出的对感染的受损的先天性免疫反应会降低败血症的存活率的一种机理。 

已经证实，严重烧伤能造成血浆和心脏丙二醛(MDA)水平的显著增加，它是由组织中的氧化应激产生的脂质过氧化作用的主要产物。 另外，已经证实抗氧化剂治疗能减少烧伤中的炎性细胞因子的释放，将炎性反应与增强的氧化应激相关联。以前的研究已经证实，在氧化应激后，从心肌细胞分泌MIF，不希望受理论的约束，这可能是释放MIF的一种机理。H₂O₂启动的氧化应激能导致ERK1/2信号转导途径和蛋白激酶C的活化，其中的后者似乎负责MIF的分泌。因此，心脏中氧化应激的增加，可能会启动预形成的MIF的心脏释放，这能触发MIF的释放(图7和8)和上调它的转录(图10)，以补充心肌细胞的储存。 

大部分细胞因子具有紧密受控的表达，其在刺激后被上调。但是，MIF能以实质性的量预形成存在，且它的表达不仅依赖于重新蛋白合成，而且还来自预先存在的储存，后者由涉及ABC转运蛋白的分泌机理控制。MIF基因不编码N-末端信号序列，后者的作用是将它移位到内质网中。MIF主要位于细胞溶质中的小囊泡中和核中，其被夹断，并且被释放到细胞外。因此，坏死性细胞损伤会导致预先储存的MIF的释放。不希望受理论的约束，由于以前的研究已经清楚地证实，我们的模型中的烧伤包含皮肤坏死，MIF释放可以从皮肤的坏死细胞直接释放，因为已经在皮肤中鉴别出了MIF，且其定位于表皮的基层。 

除了预形成的MIF的坏死性释放以外，已经证实损伤的表皮和成纤维细胞能增加MIF的表达和分泌。例如，在特应性皮炎中，MIF受到上调，且在该疾病的病理生理学中起关键作用。已经证实，体内地总体UVB暴露能增加MIF生产，表明它参与组织损伤。受损的表皮和培养的成纤维细胞也能增加MIF的表达，这积极地有助于伤口愈合过程。与内毒素中毒模型相比，在该烧伤模型中，由于烧伤的皮肤释放出的MIF等因素，MIF的全身水平可以更迅速地和急剧地增加(在烧伤模型中到4小时增加2.2倍，而在内毒素中毒模型中到8小时增加1.5倍)。 

已经证实和假设，MIF在ARDS和败血症的肺并发症中起作用。已经证实，抗-MIF治疗能减少与败血症有关的急性肺损伤中的肺嗜中性粒细胞积累。MIF在肺泡毛细管内皮中和来自ARDS患者的浸润巨噬细胞中表达。已经证实，MIF表达能与TNF-α形成放大环，有效地将严 重的炎症与ARDS中的这2种细胞因子相联系。由于ARDS是烧伤的重要且普遍的并发症，本发明包括抗-MIF治疗，其可以用于除心脏保护适应症外的其它情况，并严重地影响结果。 

在细胞因子中，MIF是独特的，因为它具有多种酶活性，包括氧化还原酶和互变异构酶活性。已经证实，抑制它的互变异构酶活性，能对抗已知的MIF活性，例如它的糖皮质激素超越活性。已经为抗-MIF治疗有效的疾病开发出了MIF互变异构酶活性的药理学抑制剂，例如败血症，哮喘，特应性皮炎，和急性呼吸道综合征(ARDS)。 

细胞因子MIF在与烧伤相关的晚期心脏功能障碍中起显著作用。MIF自身是直接的心脏抑制剂，且从心脏中延迟释放。MIF的延迟释放和能潜在地抑制MIF的活性的抑制剂的开发，使MIF成为疾病的潜在靶物，例如与涉及它的心肺作用的发病率和死亡率有关的烧伤。 

在本发明的另一个实施方案中，本发明人已经发现，LPS攻击后，从心脏、肝和脾的MIF释放依赖于TNF受体I/II信号转导。另外，本发明人鉴别出了MIF独立于TNF受体I/II信号转导的向血清中的释放。没有TNF受体信号转导，MIF水平似乎稍稍延迟(12-24小时，与在野生型中8小时相比)和轻微增加(1.7-2.3倍基线，与在野生型小鼠中1.5倍增加相比)。另外，TNF受体I/II缺陷的小鼠(TNFR-/-)中的独立于TNF受体的MI F释放足以在LPS攻击后至少24小时介导心脏功能障碍，尽管以前已经在野生型小鼠中鉴别出了缺少组织MIF释放。在TNFR-/-小鼠中鉴别出了早期的心脏功能障碍，不希望受理论的约束，认为可能是由于本发明人已经鉴别出其在该模型中高度表达的已知的介质(IL-1β，IL-6)，以及其它的潜在介质(例如IL-18以及其它的介质)。在分离的心脏(Langendorf prep)中，测得MIF能直接在TNFR-/-和野生型小鼠中以相同的程度诱导立即的(在20分钟内)心脏功能障碍(心脏收缩期和心脏舒张期)。但是，在TNFR-/-小鼠中LPS诱导的心脏功能障碍到48小时通过抗体中和MIF完全除去，表明TNF受体介导的独立的MIF释放能在内毒素中毒模型中诱导显著的晚期心脏功能障碍(24和48小时)。 

细胞因子MIF在许多细胞类型中组成性地表达，包括淋巴细胞、巨噬细胞和脑垂体前叶。许多组织也含有MIF，包括心脏，肺，肝，肾上腺，脾，肾，皮肤，肌肉，胸腺，皮肤，和睾丸。最近，已经在LPS刺激的单核细胞中描述了分泌机理。经典蛋白分泌的抑制剂例如莫能菌素或布雷菲德菌素A不能抑制MI F的分泌，这暗示着非-经典的蛋白输出途径。当施用ABCA1(ATP结合盒A1)转运蛋白的抑制剂(优降糖和probenicide)时，不会发生MIF分泌。MIF主要位于胞质中的小囊泡和核中，它们被夹断并释放到细胞外侧。已经证实，该非-经典的、泡囊-介导的分泌途径是分泌其它重要的炎性介质例如HMGB1的机理，已经证实HMGB1在炎性疾病、尤其是败血症中起显著作用。在本发明中，首次描述了MIF分泌对几种组织中的TNF-α信号转导的依赖性。 

MIF具有许多生物活性，包括糖皮质激素拮抗性质，催化性质，其通过共激活剂JAB1/CSN5和细胞表面蛋白CD74/Ii链调节。炎性刺激(例如内毒素(LPS)和肿瘤坏死因子)后，产生MIF的特异性的分泌，以及激素例如ACTH和血管紧张肽II。除了免疫细胞以外，内分泌细胞和一些上皮细胞也能分泌MIF。分泌是由于MIF表述和重新合成的增强以及从预先存在的储存进行释放的诱导；以前已经在心脏中证实了这二者。 

已经报道，野生型小鼠LPS攻击后12小时，心脏MIF最大地释放。LPS攻击后，野生型小鼠中的血清MIF水平在8小时达到最大释放，这与心脏功能障碍的早期保护相对应。当在LPS攻击后通过 预处理或在TNFR-/-小鼠中抑制TNF-α信号转导时，MIF水平更晚地且略微更高地达到顶峰，表明TNF-α具有对血清MIF水平的一些控制，但是不能抑制MIF释放。当用抗-MIF中和抗体预处理野生型小鼠并进行LPS攻击(4mg/kg)时，在第4小时时观察到了初期的严重心脏功能障碍，其与单独施用LPS的小鼠相同。但是，在8小时时观察到了初次明显的保护，一直升高直到48小时，这时与对照动物的心脏功能没有显著的差异。由于MIF在分离的野生型心脏中具有几 乎立即的且直接的心脏作用，认为MIF在心脏功能中起作用，与它的延迟释放相平行。但是，在本发明中，已经证实MIF的非-心脏释放也可以对体内功能有显著作用(24和48小时)。与野生型小鼠(最大MIF释放在8小时)相比，当封闭了TNF-α信号转导(12-24小时)时，这些作用比以前描述的(初次保护在8小时)发生得更晚，且与全身的MIF释放的延迟平行。 

认为早期的心脏功能障碍可以归因于几种已经证实能介导败血症(和LPS)有关的心脏功能障碍的细胞因子，例如TNF-α，IL-1β，和IL-18。已经报道了内毒素血症中心肌的TNF-α水平和收缩功能障碍之间在时间上的不一致性。LPS有关的心肌功能障碍在TNF-α水平恢复到基线之前不会发生的这些发现与其它发现相矛盾，后者已经报道TNF-α中和后免受LPS诱导的心脏功能障碍的保护。这些发现和其它发现已经导致了假设，即TNF-α是LPS诱导的下游介质的增加所必需的，例如IL-1β，IL-6，IL-18，以及其它的尚未鉴别出的因子。本发明人证实了，TNF信号转导能介导MIF在内毒素血症模型中的一些(来自心脏、肝、脾的MIF分泌)但不是全部作用。 

其它研究人员已经研究了TNF-α信号转导的标记作用，尤其是关于内毒素血症模型中的细胞因子IL-18。在TNF-α敲除的(-/-)小鼠中进行LPS攻击后，心脏中的IL-18水平没有显著变化，而野生型小鼠的IL-18水平表现出了显著增加。当中和IL-18时，该研究证实，能减轻LPS诱导的心脏功能障碍，IL-18似乎对组织TNF-α，IL-1β，以及ICAM-1/VCAM-1水平具有下游作用。该研究集中在心肌中IL-18的心肌生产和释放，没有研究IL-18的非-心脏来源。认为在TNR-α对组织(心脏)生产/释放IL-18的依赖性方面，该研究类似于本发明人的。 

同样地，注意到以前的一项研究是重要的，该研究鉴别了LPS攻击后TNF-α抑制对心肌细胞因子mRNA表达以及血浆细胞因子水平的作用。TNF的抑制能在2小时部分地、但是显著地减少1L-1β，IL-6，和MCP-1的血浆水平，但是对MIF，TNF，IL-10，或IL-12则不能；相 反地，抗-TNF预处理在该较早的时间点能显著减少IL-1β的心肌表达，但是对其它细胞因子(包括MIF)则不能。由于本发明人已经证实，MIF在2小时以后才表现出释放(在12小时达到峰值)，本发明人首次描述了TNF独立性的和TNF依赖性的MIF途径，其在该以前的研究中与IL-1β，IL-6，和MCP-1平行。这些是重要的发现，因为已经证实这些细胞因子中的大多数能直接介导心脏功能障碍。 

尽管在该研究中LPS攻击后TNFR-/-小鼠的心脏功能障碍(18.2％(45.9-27.7FS％)不象在我们以前的研究中从野生型小鼠测得的结果36.7％(67.3-30.6)一样重大，抑制是显著的。由于已经将多种细胞因子归于LPS攻击后的早期心脏功能障碍，我们在TNFR-/-模型中测定了血清细胞因子水平。与野生型小鼠相比，TNF-α的水平急剧增加，但是，没有功能受体(TNF受体I或TNF受体I I)，它的作用并未介导观察到的早期的心脏功能障碍。但是，除了最近描述的其它的细胞因子(例如IL-1β)以及尚未描述的其它介质以外，在4小时清楚地观察到了IL-1β和IL-6的增加(分别超过野生型小鼠31.2和8.5倍)，且可能促成早期的心脏功能障碍。以前已经描述了TNF-α信号转导在调节TNF-α分泌中的作用。但是，本发明人已经首次证实，TNF-α受体信号转导能通过负反馈机制调节IL-1β，IL-12，和I L-10，并正调节IFN-γ(图19)。同样地，LPS攻击后，缺乏IL-6的小鼠具有增强的IL-1β和TNF-α表达，本发明人预期，心脏IL-6能通过负反馈机制抑制促炎性介质(包括它自身)的表达。 

TNF-α信号转导通过2种受体进行：TNF-α受体1和2。这2个途径具有分歧的信号转导途径。TNF-α和受体1的相互作用能激活几种信号转导途径，包括NF-kB，而TNF-α受体不能。为了研究2种可能的TNF受体中的哪一个负责抑制心脏中的MIF释放，本发明人攻击了小鼠，其中IkB在心脏中的过表达导致了几乎完全的NF-kB抑制。通过蛋白印迹分析，本发明人证实了在测试的所有时间点，都没有以与TNFR-/-小鼠相同的方式发生释放(未显示数据，与图2A相同)。这些小鼠具有与野生型相同的循环TNF-α(因为NF-kB抑制是心脏特 异性的)。另外，与野生型小鼠类似，这些小鼠能在血清中表达MIF。因此，本发明预期，TNF受体1可介导来自心脏的在野生型小鼠中观察到的组织释放。由于在LPS攻击后，在前48小时的过程中，echo完全保护了该心脏的表型(未显示数据)，本发明人预期，循环MIF需要上游NF-kB介导的蛋白作为信号(TNF-α，IL-1β)，或者MIF能通过NF-kB自身介导它的作用。 

当用MIF中和抗体预处理时，会减弱野生型小鼠中LPS攻击后的IL-10和IFN-γ的释放(图20)。由于MI F具有延迟的释放，它们可能是受影响的细胞因子，由于它们与MI F在时间上的关系是它们在释放MIF后发生(图13)。这些发现表明，在内毒素攻击后，MIF活性在IL-10和IFN-γ释放中起显著作用，尽管它可能不是用于它们的释放的唯一信号。令人感兴趣地在TNFR-/-小鼠中发现(图19C)，也抑制了IFN-γ释放，使TNF和MIF都成为它的释放所必需的。同样地，在硫酸葡聚糖-诱导的结肠炎的模型中，抗-MIF抗体明显抑制了IFN-γ。当与IFN-γ一起(而不是没有IFN-γ)施用TNF-α和LPS时，已经证实了在心肌细胞中iNOS的表达。由于iNOS自身在LPS有关的心脏功能障碍的调节途径中起作用，这些细胞因子途径是复杂的，且可能密切地相互作用。 

为减少败血症和败血症性休克的发病率和死亡率而抑制TNF-α的尝试以前在临床上已经失败，即使在小鼠中的临床前研究能够针对内毒素攻击进行保护。本发明人已经发现，在LPS攻击之前抑制TNF-α信号转导，能抑制组织的MIF分泌，尽管血清MIF释放不受影响。另外，当在LPS攻击之前即刻或之后(而不是90分钟前)施用Enbrel时，偶发地发生MIF的组织释放(未显示数据)，可以用其解释该治疗的另外下游MIF作用。不希望受理论的约束，这些发现表明了抗-TNF-α治疗可能由于MIF作用而不起效的机理。 

尽管在没有活感染的情况下，该LPS攻击研究不能直接外推到败血症-诱导的心肌功能障碍，重要的是注意到了，已经证实MIF在活体的多种微生物腹膜炎模型(CLP)中是生理上有关的。当将MIF中和抗体 施用给TNF-α-/-小鼠(对CLP损害特别敏感)时，MIF在15小时时对致死率有保护性(在第9天时，与只有CLP时的0％相比，在MIF中和的小鼠中是62％存活率)。同样地，在野生型小鼠中，MIF中和抗体的保护性持续9天(实验的终点)，这时有81％存活，与31％相比，即使在损害后多达4.5小时时施用抗体(61％存活率，与5％相比)。因此，本发明人预期针对败血症-诱导的心肌功能障碍的抗-MIF治开。 

由于封闭重要的上游介质例如TNF-α，能延迟且部分地未影响MIF释放，它可以代表一种好的治疗靶。为此，可以药理学上地干预能介导它的一些生物功能的MIF的互变异构酶活性的抑制。此外，近来的释放的非-经典的分泌机理也是治疗的潜在靶物。但是，重要的是意识到已知的败血症中其它明显靶物(HMGB1)以及没有描述的靶物仍然存在。因此，重要的是理解所有这些介质的治疗性发明的作用。 

本发明人已经证实，MIF在LPS诱导的心脏功能障碍中起显著的作用，认为它有助于败血症过程中的心肌功能障碍。因为认为TNF-α是LPS诱导的心脏功能障碍中的重要的标记细胞因子，已经研究了体内阻断TNF-α信号转导途径对MIF诱导的心脏功能障碍的作用。通过抑制TNF-α信号转导，可以轻微增加和延迟MIF的血清浓度和时间分布(最大增加12-24小时(TNF-α信号转导抑制，1.7-2.3倍基线，vs.8小时，在野生型中(1.5倍增加))。与以前在野生型小鼠中观察到的在12小时时延迟的最大释放不同，抑制TNF-α信号转导后，LPS攻击后不会发生预形成的MIF从心脏、肝和脾的释放。心脏MIF mRNA的RNA印迹分析揭示，LPS攻击后的转录没有显著变化。当将重组的MIF应用到分离的TNFR-/-心脏(Langendorff制品)时，检测到了与野生型小鼠相同的心脏功能的显著降低，表明MIF信号转导是TNF-α。LPS攻击后的TNFR-/-小鼠的超声心动描记术证实了，在48小时后最低限度地改善的早期心脏功能障碍(缩短分数％降低了18.2％)。当用单克隆抗体中和MIF时，到24小时心脏功能显著改善，到48小时完全恢复，表明MIF在晚期LPS相关的心脏功能障碍中起作用，尽管缺少组织释放。该研究首次证实了，从心脏和其它组织的MIF释放依赖于TNF 信号转导，且LPS攻击后缺少TNF信号转导不会影响MIF的血清释放，并且其足以介导心脏功能障碍。 

巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是多能的细胞因子，在败血症(严重感染)过程中对心脏功能具有直接的和明显毒害的作用。本发明的一个实施方案在小鼠模型中证实，MIF活性的抑制可以显著地改善急性心肌梗塞后的心脏功能(见图21-25)。该改善在几小时内明显，且在实验过程中持续(1周)。非常可能的是，MIF的调制会减少梗塞面积和其它病理学参数。心脏功能的改善程度是显著的，且与其它免疫靶物例如TNF-α相比基本上过量了至少10倍。 

在本发明之前，还没有能靶向心脏功能障碍和急性心肌组织损伤的化合物/细胞因子介质的心肌梗塞治疗。当前的技术目标是，通过治疗例如TPA，使梗塞最小化。一旦施用了TPA或类似的治疗，除了标准的inotropes(多巴酚丁胺)或机械装置(主动脉内球囊泵)外，就没有能预防心原性休克/衰竭的药物治疗。这里预期阻断MI F的治疗与TPA或球囊血管成形术同时施用，进一步改善短期的和长期的心脏功能，并潜在地使梗塞面积最小化。 

本发明的一个实施方案解决了急性心肌梗塞后的急性和慢性心脏功能障碍的问题。本发明使得提供一类独特的治疗成为可能，因为它能调制免疫介质，即MIF。不希望受理论的约束，认为本发明可以直接减少梗塞面积。没有等同的治疗能保持长期的心脏功能。关于短期的功能，根据本发明调制MIF活性，能使对主动脉内球囊泵和其它机械装置的需求最小化。从Cytokine Pharma Science，Inc.，King of Prussia，PA，可以得到合适的单克隆抗-MIF抗体。 

本发明的另一个实施方案涉及对CD74的抑制，以保护与严重疾病有关的心脏功能障碍，例如败血症，外伤，急性MI，和充血性心力衰竭。尽管已经在循环免疫细胞和抗原呈递细胞(结合MHC II类)上描述了CD74，在本发明之前，尚未报道CD74在心脏(以及其它器官)中存在。更重要的是，以前没有证实在生理或疾病过程中CD74对心脏功能的功能作用。尽管已经证实，CD74能体外地介导MIF活性，这尚未 得到独立的证实，且限于成纤维细胞和白细胞。 

可以得到合适的抗-人CD74抗体，例如，从BD Biosciences(产品目录号555538(克隆M-B741；纯化的格式；同种型小鼠IgG_2a，κ；W.S.NoV CD74.4；反应性人)和555612(克隆LN 2；纯化的格式；同种型小鼠IgG₁，κ；W.S.No V CD74.3；反应性人) 

本发明使得抗-细胞因子治疗(包括抗-MIF)在心脏病中的应用成为可能。在败血症模型中使用抗-TNF治疗的初步实验未能起效。另外，MIF(即推定的受CD74抑制封闭的细胞因子)是较晚产生的细胞因子，且在我们的急性MI的模型中，在损害后增加了数周，允许在任何时间进行干预。 

在急性MI和败血症早期的心脏功能障碍是与这些疾病中的每一种有关的高发病率和致死率的原因。本发明人预期，可以增强性能和潜在地降低与每一种相关的发病率的细胞因子治疗。 

心脏病中的大多数治疗性干预已经集中在再灌注(MI)或inotropes(MI和败血症)。通过本发明的一个实施方案，用CD74受体(推定的MI F的受体)干预，可以减弱急性和慢性心原性损伤，并改善存活率/结果。 

LPS攻击后，MIF从心肌细胞分泌出来，并直接介导晚期发作的(＞6小时)心脏功能障碍。在免疫细胞中，确定CD74是MIF受体，通过ERK1/2细胞内信号转导途径发挥作用。为了确定CD74是否能介导败血症中的MIF-诱导的心脏功能障碍，本发明人进行了下述攻击：1)用LPS攻击野生型小鼠(C57BL/6)；2)用抗-CD74单克隆中和抗体预处理的野生型小鼠；并用LPS攻击，和3)用LPS(4mg/kg)攻击CD74敲除的小鼠。进行连续的超声心动描记术，并确定缩短分数(FS％)。在24小时，与对照(FS％＝58±1％)相比，在施用LPS的野生型小鼠中观察到了显著的功能障碍(FS％＝31.6±3.3％)。在抗-CD74抗体处理的和CD74敲除的用LPS攻击的小鼠中，与单独施用LPS的野生型小鼠相比，心脏功能显著改善(FS％分别是49±3.6％和53.3±2.4％，D＜0.05)。由于从未记载在心脏中表达CD74，本发明人进行了免疫印 迹和组织化学，这证实了CD74组成性地存在于心脏细胞膜上和细胞溶质中；且在LPS攻击后受到实质性调节(在12小时几乎没有-＞4倍减少)。本发明人证实，CD74在心肌细胞上表达，且是心脏功能障碍的关键介质。 

本发明的另一个实施方案涉及，通过使用一种或多种可溶性MIF受体或MIF受体拮抗剂，抑制MIF活性。作为一个实施例，对于抗-TNFα治疗，REMICADE^TM或INFLIXIMAB^TM(抗体TNFα)和ENBREL^TM或ETANERCEPT^TM(可溶性TNF-受体)是合适的。该方法包括，给需要的对象施用一种或多种可溶性MIF受体和/或MIF受体拮抗剂，其量能有效地治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，或其组合。 

本发明的另一个实施方案涉及小分子MIF抑制剂(有时称作″MIF拮抗剂″或″异 唑啉化合物″)在下述方面的应用：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，或其组合。 

在下面的化学式中，使用在取代基上的上标来标识取代基的名称(例如，″R²″用于指命名为R²的取代基)，而使用下标来列举取代基发生在该分子位置的次数(例如，″R₂″或″(R)₂″都用于指2个简称作″R″的取代基)。 

用于本文的方法中的合适的小分子MIF抑制剂具有下式I： 

其中：R_1-4独立地是，R，卤素，N₃，CN，OH，NRR′，或SH；R和R′独立地是，H或C_1-6烷基； 

X是R，卤素，N₃，CN，OR，NRR′，SH，＝O，＝CH₂，或A； 

A是取代的或未取代的芳香环； 

Y是R，NRR′，NRR″或(CH₂)_n-A； 

Z是R，OR，OR″，NRR′，NRR″，或A； 

R″是饱和的或不饱和的、直链或支链C₂-C₁₈；且 

n是0或1。 

优选地，式I化合物是含有对羟苯基-异 唑啉的化合物，其中R，R_1-4，X和Y中的每一个是H或-CH₂-A，且Z是OR。更优选地，式I化合物是(R)-3-(4-羟苯基)-4，5-二氢-5-异 唑啉乙酸的酯、尤其是它的甲酯(在本文中有时称作″ISO-1″或″CPSI″或″CPSI-26″)，后者也称作对羟苯酚-异 唑啉甲酯。更优选地，该化合物是2-{3-(4-羟基-苯基)-4，5-二氢-异 唑-5-基}-3-苯基-丙酸的酯，尤其是它的甲酯(称作″ISO-2″)。 

用于本文的方法中的其它合适的小分子MIF抑制剂具有下式II或III： 

其中B是氧或硫，且独立地定义每个″R″： 

R＝H，R¹，或 

要求是，每个″R″不能仅仅作为式II或III上的氢而存在(即，式II或III上的至少一个R是氢以外的″R″取代基)，和任意的B独立地是氧或硫；任意的R¹独立地是氢，(C₁-C₆)烷基或一些其它的合适的取代基，任意的R²是胺，烷氧基或一些其它的合适的取代基；且″m″独立地是0或1-20的整数； 

每个X独立地是碳或氮；且当任意的X是碳时，则Y是为每个X独立地定义为以下的取代基， 

Y＝H，R¹，或 

每个Z独立地是氢，羟基，卤素，或一些其它的合适的取代基；且 

″n″独立地是0，1，2，3，或4中的任一个； 

和其药学上可接受的盐和前药。 

本发明还涉及通式I，II，或III的化合物的药学上可接受的酸加成盐。可以用于制备前述的本发明的碱化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸是能形成无毒的酸加成盐(即，含有药理学上可接受的阴离子的盐)的那些，所述盐例如氯化物，溴化物，碘化物，硝酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，酸式磷酸盐，醋酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐，酸式柠檬酸盐，酒石酸盐，酒石酸氢盐，琥珀酸盐，马来酸盐，富马酸盐，谷氨酸盐，L-乳酸盐，L-酒石酸盐，甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，葡糖酸盐，糖酸盐，苯甲酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对 甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1，1′-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。 

本发明还涉及小分子MI F抑制剂的碱加成盐。可以用作制备在性质上是酸性的通式I，II，或III的化合物的药学上可接受的碱盐的试剂的化学碱是能与这样的化合物形成无毒的碱盐的那些。这样的无毒的碱盐包括但不限于源自这样的药理学上可接受的阳离子的那些，例如碱金属阳离子(例如，钾和钠)和碱土金属阳离子(例如，钙和镁)，铵或水溶性胺加成盐例如N-甲基葡糖胺-(葡甲胺)，和低级链烷醇铵和药学上可接受的有机胺的其它碱盐。 

小分子MIF抑制剂的化合物和前药可以以几种互变异构体、几何异构体和其混合物的形式存在。所有这样的互变异构体形式都包括在本发明的范围内。互变异构体作为在溶液中的互变异构体的混合物存在。在固体形式中，通常一种互变异构体占优势。即使可能只描述一种互变异构体，本发明包括小分子MIF抑制剂的所有互变异构体。 

本发明还包括小分子MIF抑制剂的阻转异构体。阻转异构体是指可以分离成旋转受限制的异构体的小分子MIF抑制剂的化合物。小分子MIF抑制剂可以含有烯烃-样的双键。当存在这样的键时，小分子MIF抑制剂可以作为顺式和反式构型和作为其混合物存在。 

″合适的取代基″意在指化学上和药学上可接受的官能团，即不使小分子MIF抑制剂的抑制活性无效的基团。本领域的技术人员可以常规地选择这样的合适的取代基。合适的取代基的示例性实例包括但不限于卤素基团，全氟代烷基基团，全氟代烷氧基基团，烷基基团，链烯基基团，炔基基团，羟基基团，氧代基团，巯基基团，烷硫基基团，烷氧基基团，芳基或杂芳基基团，芳氧基或杂芳氧基基团，芳烷基或杂芳烷基基团，芳烷氧基或杂芳烷氧基基团，HO-(C＝O)-基团，氨基基团，烷基-和二烷基氨基基团，氨甲酰基基团，烷基羰基基团，烷氧基羰基基团，烷基氨基羰基基团，二烷基氨基羰基基团，芳基羰基基团，芳氧基羰基基团，烷基磺酰基基团，芳基磺酰基基团等。 

在2004年3月26日提交的美国临时申请60/556,440、2001年6 月8日提交的美国临时申请60/296,478和2002年6月10日提交的美国申请10/164,630中，可以发现优选的小分子MIF抑制剂，每篇的完整内容在这里为所有目的引作参考。 

优选地，在该实施方案中，将有效量的一种或多种小分子MIF抑制剂和/或其盐作为活性成分施用给需要的对象。小分子MIF抑制剂的组合也是可行的。 

如果需要，也可以以它们的药学上有活性的盐和/或前药的形式，施用小分子MIF抑制剂化合物。盐和/或前药的组合是可行的，如同小分子MIF抑制剂的盐-形式和非盐-形式的组合。 

本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其适用于：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，或其组合，其包含作为活性成分的一种或多种小分子MIF抑制剂和/或其盐和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂、辅剂和/或稀释剂。 

本发明的另一个实施方案涉及向需要的对象施用有效量的组合物，其包含至少一种小分子MIF抑制剂、其盐、和/或其前药和至少一种抗-MIF抗体，用于治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，或其组合。 

本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其适用于：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治 疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，或其组合，其包含有效量的至少一种小分子MIF抑制剂、其盐、和/或其前药和至少一种抗-MIF抗体的组合，和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂、辅剂和/或稀释剂。 

本发明的另一个实施方案涉及向需要的对象施用有效量的组合物，其包含至少一种小分子MIF抑制剂、其盐、和/或其前药、至少一种抗-TNFR抗体和至少一种抗-MIF抗体的组合，用于治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，或其组合。 

本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其适用于：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，或其组合，其包含有效量的至少一种小分子MIF抑制剂、其盐、和/或其前药、至少一种抗-TNFR抗体和至少一种抗-MIF抗体的组合，和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂、辅剂和/或稀释剂。 

本发明的另一个实施方案涉及向需要的对象施用有效量的组合物，其包含至少一种小分子MIF抑制剂、其盐、和/或其前药、至少一种抗-CD-74抗体和至少一种抗-MIF抗体的组合，用于治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后心脏功能障碍，治疗和/或预 防有此需要的对象中的心脏抑制，或其组合。 

本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其适用于：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，或其组合，其包含有效量的至少一种小分子MIF抑制剂、其盐、和/或其前药、至少一种抗-CD-74抗体和至少一种抗-MIF抗体的组合，和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂、辅剂和/或稀释剂。 

本发明的另一个实施方案涉及向需要的对象施用有效量的组合物，其包含至少一种小分子MIF抑制剂、其盐、和/或其前药和至少一种抗-CD-74抗体的组合，用于治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，或其组合。 

本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其适用于：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，或其组合，其包含有效量的至少一种小分子MIF抑制剂、其盐、和/或其前药、至少一种抗-CD-74抗体的组合，和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂、辅剂和/或稀释剂。 

不希望受理论的约束，认为用小分子MIF抑制剂中和互变异构酶活性(已经证实细胞因子MIF具有它)能导致或有助于对在心肌梗塞 后发生的心脏抑制的抑制。用小分子抑制剂抑制互变异构酶，会产生与抗-MIF抗体类似的心脏保护。由于已经证实MIF具有互变异构酶活性，且已经在体外研究中提示其可介导它的活性，认为MIF的中和可能发生在抑制它的互变异构酶活性之后。 

本发明人已经发现，抑制MIF和/或中和MIF互变异构酶活性，能提供针对心脏病的抗-细胞因子/炎症治疗。MIF的抑制，能改善心肌梗塞后的心脏功能，且可能有助于心肌梗塞的急性后遗症，例如减轻在急性心肌梗塞早期的心脏功能障碍和降低伴随的高发病率和死亡率。与现有的技术相比，本发明的一个优点是，与集中在inotropes上的心脏病的治疗性干预不同，本发明通过治疗和/或预防心脏功能障碍的原因，可以减弱急性和慢性心原性损伤，并改善存活率/结果。 

本发明的一个实施方案涉及药物组合物，其包含作为活性成分的至少一种本发明的化合物(和/或盐和/或其前药)和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂、辅剂和/或稀释剂。 

还可以以它们的药学上有活性的盐的形式，任选地使用基本上无毒的药学上可接受的载体、赋形剂、辅剂或稀释剂，来施用化合物。可以以已知的方式，以合适的剂量水平，在任意的常规的固体或液体载体或稀释剂和任选地任意的常规的药学上制备的辅剂中，制备本发明的组合物。优选的制剂是可施用的形式，其适用于经口应用。这些可施用的形式，例如，包括丸剂，片剂，膜片剂，包衣片剂，胶囊，粉末和长效制剂(deposit)。 

可经口施用的形式以外的形式也是可行的。可以通过任何适当的方式，包括但不限于注射(静脉内的，腹膜内的，肌肉内的，皮下的)，经上皮层或粘膜皮肤层(口腔粘膜，直肠的和阴道的上皮层，鼻咽粘膜，肠粘膜)吸收；经口地，直肠地，透皮地，局部地，真皮内地，胃内地，皮内地，阴道内地，血管内地，鼻内地，颊内地，经皮地，舌下地，或制药领域内可得到的任何其它方式，施用本发明的化合物和/或含有所述化合物的药物制剂。 

含有至少一种本发明的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成 分的本发明的药物组合物，典型地可以与根据目的给药形式合适地选择的合适的载体材料混合施用，所述给药形式即经口片剂，胶囊(固体填充的，半固体填充的或液体填充的)，用于配制的粉末，经口凝胶，酏剂，可分散的颗粒，糖浆，悬浮液等，且符合常规的制药实践。例如，对于片剂或胶囊形式的经口施用，可以将活性药物组分与任何经口的无毒的药学上可接受的惰性载体相组合，例如乳糖，淀粉，蔗糖，纤维素，硬脂酸镁，磷酸二钙，硫酸钙，滑石，甘露醇，乙醇(液体形式)等。另外，当理想地或需要时，也可以在混合物中掺入合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂。 

药物组合物可以包含约5-约95重量％的活性成分，该范围包含其中的所有值和子范围，包括5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、90.5、91、91.5、92、92.5、93、93.5、94、94.5和95重量％。 

合适的粘合剂包括淀粉、明胶，天然糖类，玉米甜味剂，天然的和合成的树胶例如阿拉伯胶，海藻酸钠，羧甲基-纤维素，聚乙二醇和蜡。在润滑剂中，用于这些剂型中可以提及硼酸、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、瓜尔豆胶等。在适当时，还可以包含甜味剂、矫味剂和防腐剂。在下面更详细地讨论了一些上面指出的术语，即崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂等。 

另外，可以将本发明的化合物或组合物配制成持续释放形式，以控制速度地释放任意一种或多种组分或活性成分，优化治疗效果，即抗组胺活性等。合适的用于持续释放的剂型包括分层片剂，其含有不同崩解速度的层，或充满了活性组分且制成片剂形式的控释聚合基体或含有这样的充满的或包封的多孔聚合基体的胶囊。 

液体形式制剂包括溶液、悬浮液和乳状液。作为实例，可以提及用于肠胃外注射的水、乙醇、水-乙醇或水-丙二醇溶液，或向经口的溶液、悬浮液和乳状液加入甜味剂和遮光剂。液体形式制剂还可以包括用于鼻内施用的溶液。 

适用于吸入的气雾剂可以包括溶液和粉末形式的固体，其可以与药学上可接受的载体相组合，例如惰性压缩气体，例如氮。 

为了制备栓剂，首先熔化低熔点的蜡，例如可可脂等脂肪酸甘油酯的混合物，通过搅拌或类似的混合，将活性成分均匀地分散在其中。然后，将熔化的均匀混合物倒入方便的大小确定的模具中，进行冷却，从而固化。 

还包括固体形式的制剂，其意在即将使用前转化成用于经口的或肠胃外的施用的液体形式制剂。这样的液体形式包括溶液、悬浮液和乳状液。 

还可以透皮地输送本发明的化合物。透皮的组合物可以采取乳剂、洗剂、气雾剂和/或乳状液的形式，且可以包含在基质或储存器类型的透皮贴剂中，如在本领域用于该目的的常规的。 

术语胶囊指用于容纳或包含含有活性成分的组合物的由甲基纤维素、聚乙烯醇或变性的明胶或淀粉制成的特殊容器或外壳。硬壳胶囊典型地由相对较高凝胶强度的骨和猪皮明胶的混合物制成。胶囊自身可以含有小量的染料、遮光剂、增塑剂和防腐剂。 

片剂指压制的或模制的固体剂型，其含有活性成分和适当的稀释剂。通过压制由湿颗粒、干颗粒得到的混合物或颗粒，或通过本领域的普通技术人员众所周知的压紧，可以制备出片剂。 

经口的凝胶是指分散或溶解在亲水的半固体基质中的活性成分。 

用于配制的粉末是指含有可以悬浮在水或汁中的活性成分和合适的稀释剂的粉末混合物。 

合适的稀释剂是通常用于补足组合物或剂型的主要部分的物质。 

合适的稀释剂包括糖类，例如乳糖，蔗糖，甘露醇和山梨醇，源自小麦、玉米、稻和马铃薯的淀粉，和纤维素例如微晶纤维素。组合物中的稀释剂的量可以占总组合物重量的约5-约95％，优选约25-约75％，更优选约30-约60重量％。 

术语“崩解剂”是指加入组合物中辅助它破碎(崩解)并释放药物的物质。合适的崩解剂包括淀粉，″冷水可溶的″改性淀粉例如羧甲 基钠淀粉，天然的和合成的树胶例如槐豆，刺梧桐，瓜尔豆，黄芪胶和琼脂，纤维素衍生物例如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠，微晶纤维素和交联的微晶纤维素例如交联羧甲纤维素钠，海藻酸盐例如海藻酸和海藻酸钠，粘土例如膨润土，和泡腾混合物。组合物中的崩解剂的量可以占组合物的约2-约20重量％，更优选约5-约10重量％。 

粘合剂表征能将粉末粘或“胶”到一起的物质，并使它们通过形成颗粒发生粘合，从而用作制剂中的“粘合剂”。粘合剂能增加已经在稀释剂或填充剂中可以得到的粘合强度。合适的粘合剂包括糖类，例如蔗糖，源自小麦、玉米、稻和马铃薯的淀粉；天然的树胶例如阿拉伯胶，明胶和黄芪胶；海藻的衍生物例如海藻酸，海藻酸钠和海藻酸钙铵；纤维素材料例如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠和羟丙基-甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；和无机物例如硅酸铝镁。组合物中的粘合剂的量可以占组合物的约2-约20重量％，更优选约3-约10重量％，更优选约3-约6重量％。 

润滑剂指加入到剂型中的、通过减少摩擦力或磨损使已经压制的片剂、颗粒等从模型或模具中释放出来的物质。合适的润滑剂包括金属硬脂酸盐例如硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸钾；硬脂酸；高熔点蜡；和水可溶的润滑剂，例如氯化钠，苯甲酸钠，醋酸钠，油酸钠，聚乙二醇和d，1-亮氨酸。通常，在压制之前的最后步骤中加入润滑剂，因为它们必须存在于颗粒的表面上、和它们与片剂冲具的部件之间。组合物中的润滑剂的量可以占组合物的约0.2-约5重量％，优选约0.5-约2％，更优选约0.3-约1.5重量％。 

助流剂是能预防结块并改善颗粒的流动特征的物质，使流动平滑且均匀。合适的助流剂包括二氧化硅和滑石。组合物中的助流剂的量可以占总组合物的约0.1％-约5重量％，优选约0.5-约2％。 

着色剂是能为组合物或剂型提供颜色的赋形剂。这样的赋形剂可以包括食品级染料和吸附在合适的吸附剂(例如粘土或氧化铝)上的食品级染料。着色剂的量可以占组合物的约0.1-约5重量％，优选约0.1-约1％。 

可以在″Remington′s Pharmaceutical Science″Mack Publishing Co.，Easton Pa中找到关于配制和施用本发明的化合物的技术，其完整内容在这里引作参考。包含至少一种本发明的化合物的合适的组合物可以是该化合物在合适的液体药物载体或任何其它制剂中的溶液，所述的其它制剂例如片剂，丸剂，膜片剂，包衣片剂，糖衣丸，胶囊，粉末和长效制剂，凝胶，糖浆，浆剂，悬浮液，乳状液，等。 

如本文所使用的，术语″治疗和/或预防″指逆转、减轻、抑制该术语应用的障碍或状况的进展或预防所述障碍或状况，或该障碍或状况的一种或多种症状。如本文所使用的，术语″治疗″指如上面定义术语治疗和/或预防的行为。优选地，治疗或施用的对象是人对象，更优选需要治疗的人对象。 

术语″有效量″或″治疗上有效量″指足以造成对象的状况或适应症和优选要治疗的状况或适应症的任何可观察到的或可检测的差异和优选改善的量。 

下面给出了鼠抗-MI F抗体的登记号： 

对于III.D.9mAb：HB-12220 

对于XIV.15.5mAb：HB-12221。 

优选地，″急性″状况(例如急性心肌梗塞)能与″慢性″状况(例如慢性充血性心力衰竭)区别开。 

当在本文中使用时，术语″抗体″合适地包括抗体-衍生的片段，Fab，Fab片段，Fab₂，CDR-衍生的区域，抗体-衍生的肽，和/或单链抗体，如本领域的普通技术人员已知的。Fab是优选的。 

当在本文中使用时，术语，″心脏功能障碍″可以合适地包括一种或多种选自下述的适应症：心脏功能障碍，心肌活性的紊乱，心肌活性的抑制，烧伤伴随的心脏功能障碍，急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，心脏抑制，和其组合。本领域具备普通技术的医生能够明白这些术语。 

下面给出了本发明的其它实施方案。 

A.用于治疗和/或预防对象的烧伤伴随的心脏抑制和/或心脏功能障碍的方法，其包括：给对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。 

B.治疗和/或预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的方法，其包括：给对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体，其中该烧伤伴随的心脏功能障碍包括心肌活性的紊乱或心肌活性的抑制或二者。 

C.治疗和/或预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的方法，其包括：给对象施用有效量的包含MIF抑制剂的组合物，其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF抗体。 

D.治疗和/或预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的方法，其包括：给对象施用有效量的包含至少一种MIF抑制剂的组合物，其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF抗体，且其中该抗体是单克隆抗体。 

E.治疗和/或预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的方法，其包括：给对象施用有效量的包含至少一种MIF抑制剂的组合物，其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF单克隆人源化抗体。 

F.治疗和/或预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的方法，其包括：给对象施用有效量的包含至少一种MIF抑制剂的组合物，其中通过至少一种选自下述的途径施用该组合物：肌肉内的注射，腹膜内的注射，皮下的注射，血管内的注射，和其组合。 

G.用于治疗和预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的药物组合物，其包含： 

至少一种抗-MIF抗体；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

H.用于治疗和预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的药物组合物，其包含： 

至少一种MIF抑制剂；和 

至少一种药学上可接受的载体，其中所述的MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF抗体。 

I.治疗和/或预防对象中的心脏抑制和/或心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-CD74抗体。 

J.治疗和/或预防对象中的心脏抑制和/或心脏功能障碍的方法， 该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-CD74抗体，其中该心脏功能障碍和/或心脏抑制包括心肌活性的紊乱或心肌活性的抑制，或二者。 

K.治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种抗-CD74抗体，其中该心脏功能障碍包含至少一种烧伤伴随的心脏功能障碍。 

L.治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种CD74抑制剂，其中该CD74抑制剂包含至少一种抗-CD74抗体。 

M.治疗和/或预防对象中的心脏功能障碍和/或心脏抑制的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种CD74抑制剂，其中该CD74抑制剂包含至少一种抗-CD74单克隆抗体。 

N.治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种CD74抑制剂，其中该CD74抑制剂包含至少一种抗-CD 74单克隆人源化抗体。 

O.治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-CD74抗体，其中通过至少一种选自下述的途径施用该组合物：肌肉内的注射，腹膜内的注射，皮下的注射，血管内的注射，和其组合。 

P.用于治疗和预防对象中的心脏功能障碍和/或心脏抑制的药物组合物，其包含： 

至少一种抗-CD74抗体；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

Q.用于治疗和预防对象中的心脏功能障碍的药物组合物，其包含： 

至少一种CD74抑制剂；和 

至少一种药学上可接受的载体， 

其中该CD74抑制剂包含至少一种抗-CD74抗体。 

R.用于改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-MIF抗体。 

S.改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种MI F抑制剂，其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF抗体。 

T.改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种MIF抑制剂， 

其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF单克隆抗体。 

U.改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种MIF抑制剂， 

其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF单克隆人源化抗体。 

V.改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体和至少一种抗-CD74抗体。 

W.改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的包含至少一种MIF抑制剂和至少一种CD74抑制剂的组合物，其中所述的CD74抑制剂包含至少一种抗-CD74抗体。 

X.改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的包含至少一种MIF抑制剂和至少一种CD74抑制剂的组合物，其中该CD74抑制剂包含至少一种抗-CD74单克隆抗体。 

Y.改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种MIF抑制剂和至少一种CD74抑制剂，且其中该CD74抑制剂包含至少一种抗-CD74单克隆人源化抗体。 

Z.改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-MIF抗体，其中 通过至少一种选自下述的途径施用该组合物：肌肉内的注射，腹膜内的注射，皮下的注射，血管内的注射，和其组合。 

AA.用于治疗和预防对象中的心脏功能障碍和/或心脏抑制的药物组合物，其包含： 

至少一种抗-MIF抗体；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

BB.用于治疗和预防对象中的心脏功能障碍和/或心脏抑制的药物组合物，其包含： 

至少一种抗-MIF抗体； 

至少一种抗-CD74抗体；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

CC.治疗和/或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种抗-TNFR抗体和至少一种抗-MIF抗体。 

DD.治疗和/或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种TNFR抑制剂和至少一种MIF抑制剂， 

其中该TNFR抑制剂包含至少一种抗-TNFR抗体和其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF抗体。 

EE.治疗和/或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种TNFR抑制剂和至少一种MIF抑制剂， 

其中该TNFR抑制剂包含至少一种抗-TNFR抗体和其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF抗体， 

其中该抗-TNFR抗体包含至少一种单克隆抗体。 

FF.治疗和/或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方 法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种TNFR抑制剂和至少一种MIF抑制剂， 

其中该TNFR抑制剂包含至少一种抗-TNFR抗体和其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF抗体， 

且其中该抗-TNFR抗体包含至少一种单克隆人源化抗体。 

GG.治疗和/或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种TNFR抑制剂和至少一种MIF抑制剂， 

其中该TNFR抑制剂包含至少一种抗-TNFR抗体，且其中该MI F抑制剂包含至少一种抗-MIF单克隆抗体。 

HH.治疗和/或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种TNFR抑制剂和至少一种MIF抑制剂， 

其中该TNFR抑制剂包含至少一种抗-TNFR抗体和其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF单克隆人源化抗体。 

II.治疗和/或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种TNFR抑制剂和至少一种MIF抑制剂， 

其中该TNFR抑制剂包含至少一种抗-TNFR单克隆人源化抗体，且其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF单克隆人源化抗体。 

JJ.用于治疗和预防对象中的心脏功能障碍和/或心脏抑制的药物组合物，其包含： 

至少一种抗-TNFR抗体； 

至少一种抗-MIF抗体。 

KK.用于治疗和预防对象中的心脏功能障碍的药物组合物，其包 含： 

至少一种TNFR抑制剂； 

至少一种MIF抑制剂；和 

至少一种药学上可接受的载体； 

其中该TNFR抑制剂包含至少一种抗-TNFR抗体。 

LL.用于治疗和预防对象中的心脏功能障碍的药物组合物，其包含： 

至少一种TNFR抑制剂； 

至少一种MIF抑制剂；和 

至少一种药学上可接受的载体； 

其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF抗体。 

MM.用于治疗和预防对象中的心脏功能障碍的药物组合物，其包含： 

至少一种TNFR抑制剂； 

至少一种MIF抑制剂；和 

至少一种药学上可接受的载体； 

其中该TNFR抑制剂包含至少一种抗-TNFR抗体，且其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF抗体。 

NN.用于治疗和预防对象中的心脏功能障碍的药物组合物，其包含： 

至少一种TNFR抑制剂； 

至少一种MIF抑制剂；和 

至少一种药学上可接受的载体； 

其中该TNFR抑制剂包含至少一种抗-TNFR单克隆抗体，且其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF单克隆抗体。 

OO.用于治疗和预防对象中的心脏功能障碍的药物组合物，其包含： 

至少一种TNFR抑制剂； 

至少一种MIF抑制剂；和 

至少一种药学上可接受的载体； 

其中该TNFR抑制剂包含至少一种抗-TNFR单克隆人源化抗体，且其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF单克隆人源化抗体。 

PP.治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。 

QQ.治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-MIF抗体， 

其中该心脏功能障碍包含选自下述的至少一项：心肌活性的紊乱，心肌活性的抑制，和其组合。 

RR.治疗和/或预防对象中的心脏功能障碍和/或心脏抑制的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的包含至少一种MIF抑制剂的组合物， 

其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF抗体。 

SS.治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的包含至少一种MIF抑制剂的组合物， 

其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-M1F单克隆抗体。 

TT.治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的包含至少一种MIF抑制剂的组合物， 

其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF人源化抗体。 

UU.药物组合物，其包含： 

治疗有效量的至少一种抗-MIF抗体；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

VV.药物组合物，其包含： 

至少一种MIF抑制剂；和 

至少一种药学上可接受的载体， 

其中该MIF抑制剂包含至少一种抗-MIF抗体。 

WW.鉴别MIF抑制剂的方法，该方法包括： 

使至少一个肌细胞暴露于MIF； 

检测至少一种MIF-相关的肌细胞活性； 

使肌细胞暴露于至少一种MIF和至少一种候选剂； 

检测在有候选剂存在的情况下至少一种MIF-相关的肌细胞活性；和 

检测候选剂是否能影响MIF-相关的肌细胞活性。 

XX.鉴别MIF抑制剂的方法，该方法包括： 

使至少一个肌细胞暴露于MIF； 

检测至少一种MIF-相关的肌细胞活性； 

使肌细胞暴露于至少一种MIF和至少一种候选剂； 

检测在有候选剂存在的情况下至少一种MIF-相关的肌细胞活性；和 

检测候选剂是否能影响MIF-相关的肌细胞活性， 

其中通过免疫化学测定MIF-相关的肌细胞活性。 

YY.鉴别MIF抑制剂的方法，该方法包括： 

使至少一个肌细胞暴露于MIF； 

检测至少一种MIF-相关的肌细胞活性； 

使肌细胞暴露于至少一种MIF和至少一种候选剂； 

检测在有候选剂存在的情况下至少一种MIF-相关的肌细胞活性；和 

检测候选剂是否能影响MIF-相关的肌细胞活性， 

其中通过Langendorff试验测定MIF-相关的肌细胞活性。 

ZZ.鉴别MIF抑制剂的方法，该方法包括： 

使至少一个肌细胞暴露于MIF； 

检测至少一种MIF-相关的肌细胞活性； 

使肌细胞暴露于至少一种MIF和至少一种候选剂； 

检测在有候选剂存在的情况下至少一种MIF-相关的肌细胞活性；和 

检测候选剂是否能影响MIF-相关的肌细胞活性， 

其中通过超声心动描记术测定有关的肌细胞活性。 

AAA.用于选自下述的至少一项的方法：治疗和/或预防有此需要 的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包括： 

给对象施用有效量的至少一种小分子MIF抑制剂和/或其盐。 

BBB.用于选自下述的至少一项的方法：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含： 

至少一种小分子MIF抑制剂和/或其盐；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

CCC.用于治疗和/或预防对象的烧伤伴随的心脏抑制和/或心脏功能障碍的方法，其包括： 

给对象施用有效量的至少一种小分子MIF抑制剂和/或其盐。 

DDD.治疗和/或预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的方法，其包括： 

给对象施用有效量的至少一种小分子MIF抑制剂和/或其盐， 

其中该烧伤伴随的心脏功能障碍包括心肌活性的紊乱或心肌活性的抑制或二者。 

EEE.治疗和/或预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的方法，其包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种小分子MIF抑制剂和/或其盐。 

FFF.治疗和/或预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的方法，其包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种小分子MIF抑制剂和/或其盐，其中通过至少一种选自下述的途径施用该组合物：肌肉内的注射，腹膜内的注射，皮下的注射，血管内的注射，和其组合。 

GGG.用于治疗和预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的药物组合物，其包含： 

至少一种小分子MIF抑制剂和/或其盐；和至少一种药学上可接受的载体。 

HHH.改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的至少一种小分子MIF抑制剂和/或其盐. 

III.改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种小分子MIF抑制剂和/或其盐， 

其中通过至少一种选自下述的途径施用该组合物：肌肉内的注射，腹膜内的注射，皮下的注射，血管内的注射，和其组合。 

JJJ.治疗和/或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种小分子MIF抑制剂和/或其盐。 

KKK.药物组合物，其对于选自下述的至少一项是有效的：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包含有效量的包括下述物质的组合： 

至少一种抗-TNFR抗体； 

至少一种抗-MIF抗体；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

LLL.药物组合物，其对于选自下述的至少一项是有效的：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包含有效量的包括下述物质的组合： 

至少一种抗-CD-74抗体； 

至少一种抗-MIF抗体；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

MMM.用于选自下述的至少一项的方法：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包括给对象施用有效量的包括下述物质的组合： 

至少一种抗-TNFR抗体； 

至少一种抗-MIF抗体；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

NNN.用于选自下述的至少一项的方法：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包括给对象施用有效量的包括下述物质的组合： 

至少一种抗-CD-74抗体； 

至少一种抗-MIF抗体；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

OOO.本发明的另一个实施方案涉及，给需要的对象施用有效量的一种或多种可溶性MIF受体和/或MIF受体拮抗剂(任选地在药学上可接受的载体中)，用于选自下述的至少一项：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合。 

PPP.本发明的另一个实施方案涉及，以任意的组合，给需要的对象施用有效量的一种或多种下述物质： 

小分子MIF抑制剂； 

可溶性MIF受体； 

MIF受体拮抗剂； 

抗-CD74抗体； 

抗-MIF抗体； 

抗-TNFR抗体；和 

任选地，药学上可接受的载体， 

用于选自下述的至少一项：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合。 

QQQ.本发明的另一个实施方案涉及组合物，其包含有效量的任意组合的一种或多种下述物质： 

小分子MIF抑制剂； 

可溶性MIF受体； 

MIF受体拮抗剂； 

抗-CD74抗体； 

抗-MIF抗体； 

抗-TNFR抗体；和 

任选地，药学上可接受的载体 

其中该组合物对于选自下述的至少一项是有效的：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合。 

RRR.本发明的另一个实施方案涉及，给需要的对象施用有效量的抗-TNFR抗体；和 

任选地，药学上可接受的载体， 

用于选自下述的至少一项：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合。 

SSS.本发明的另一个实施方案涉及组合物，其包含有效量的抗-TNFR抗体；和 

任选地，药学上可接受的载体， 

其中该组合物对于选自下述的至少一项是有效的：治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合。 

实施例

已经一般地描述了本发明，通过某些具体的实施例，可以得到进一步理解，在这里提供的实施例仅仅用于解释目的，无意进行限制，除非另有说明。 

实施例1 

抗体和细胞因子。分别在PBS和0.1％BSA的PBS溶液中，重配山羊抗-hMIF IgG和rhMIF(R&D Systems，Minneapolis，NIN)，等分试样，并保藏在-20℃，直到使用。将兔抗-山羊IgG-HRP(BioRad Corp.，Hercules，CA)保藏在4℃，直到使用。 

动物和实验设计。得到了6-10周龄的C57BL/6J和C 3H/HeJ小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)。在该研究中，使用了重325-360g的成年的Sprague-Dawley大鼠(Harlan Laboratories，Houston，TX)。可随意地得到购买的食物和自来水。所有动物方案都经过了德克萨斯大学西南医疗中心设立的动物保护咨询委员会的审阅和批准，且与NIH公开的管理动物应用的规则相符合。给C57BL/6J小鼠腹膜内地注射了4mg/kg大肠杆菌0111:B4LPS(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)，并通过CO₂窒息和随后的颈脱臼，在文件中指定的注射后的时间点处死。未注射的小鼠用作对照。在超声心动图研究中，在LPS攻击之前90分钟，腹膜内地注射(100ug，在200ul PBS中)了2种抗-MIF抗体(III.D.9和XIV.15.5，Rockland Immunochemicals，Inc.，Gilbertsville，PA)和它们的同种型对照(HB-49，Rockland Immunochemicals，Inc.，Gilbertsville，PA)。取出全心脏，并在液氮中快速冷冻，保藏在-80℃或在10％中性-缓冲的福尔马林中固定24小时，并置于70％乙醇中，用于免疫组织化学。 

实施例2 

蛋白提取和蛋白印迹。解冻心脏，并在含有1％NP40，0.5％脱氧胆酸，0.1％SDS，2mM EDTA和1mM PMSF的Tris-缓冲的盐水(TBS，50 mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5)中在冰上匀浆。使用Bio-Rad蛋白试验(Hercules，CA)，定量裂解物浓度。用Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA)，以1∶1稀释蛋白(20ug)，并在还原条件下，在18％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离。使用半干转移装置(Bio-Rad，Hercules，CA)，在15V将凝胶转移到PVDF膜(NEN，Boston，MA)上，进行15分钟。用含有0.5％脱脂奶粉的TBS/0.1％吐温-20(TBS-T)封闭膜30分钟，并与在TBS/0.1％吐温-20/5％脱脂奶中的山羊抗-hMIFI gG(1∶750)在4℃孵育过夜。用TBS-T洗涤膜3次、10分钟，在室温与兔抗-山羊IgG-HRP(1∶1000)孵育1小时，并用TBS-T洗涤4次、10分钟。在碱性条件下，将膜暴露于5ml鲁米诺+过氧化氢的混合物(SuperSignal West Pico，Pierce，Rockford，IL)5分钟，通过Kodak X-OMAT AR底片(Eastman Kodak Co.，Rochester，New York)，检测得到的化学发光反应。 

实施例3 

RNA提取，探针制备和RNA印迹。根据生产商的方案，用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)，从在冰上解冻的心脏提取总RNA，并通过分光光度计法定量。通过从MIF质粒(Research Genetics，Huntsville，AL)分离DNA(DNeasy Tissue Kit，Qiagen，Valencia，CA)，并随后用ECORI和NOTI限制酶(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)切割它，制备了MIF特异性的RNA印迹探针。在1.2％琼脂糖凝胶上分离所得到的DNA，纯化(GenElute琼脂糖旋转柱，Supelco，Bellefonte，PA)，使用Ready-To-Go标记珠(Amersham Pharmacia，Piscatany，NJ)，用5ul 32p-dCTP(3000Ci/mmol)(PerkinElmer，Boston，MA)进行标记，根据生产商的方案，在ProbeQuant微量柱(Amersham Pharmacia，Piscatany，NJ)中纯化。 

在1.2％琼脂糖凝胶上，在100V分离mRNA(10ug)1小时，并在转移电泳设备(TransPhor PowerLid，Hoefer Scientific Instruments，San Francisco)上，在100V转移到Hybond-N+膜(Amersham Phannacia，Buckingham，England)上1小时。使用GS Gene  Linker(Bio-Rad，Hercules，CA)，将RNA连接到膜上2分钟。在Perfect-Hyb Plus(Sigma，St.Louis，MO)中，在42℃预杂交膜4-5小时，然后与³²P标记的MIF DNA探针在42℃孵育过夜。在2X SSC/0.1％SDS中，在46℃洗涤膜2次、30分钟，在0.2X S SC/0.1％SDS中，在46℃洗涤膜2次、30分钟，通过Kodak X-OMAT AR底片(Eastman Kodak Co.，Rochester，New York)检测。然后，用放射性标记的β-肌动蛋白探测相同的膜，以确保等量的蛋白上样。 

实施例4 

免疫组织化学。在中性缓冲的福尔马林中固定组织，并用石蜡加工，随后，使用含有辣根过氧化物酶和二氨基联苯胺(DAB)色原的超-链霉抗生物素生物素系统(Signet Laboratories，Dedham，MA)，在室温，在BioTek Solutions Techmate^TM 1000自动化的免疫染色仪(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)上，进行免疫染色。使用已知的阳性对照组织(LPS攻击后的大鼠)，预先确定了最佳的一抗稀释度。在轮转切片机上，切3um的石蜡切片，固定到带正电荷的玻璃载玻片上(POP 100毛细管凹口载玻片，Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)，并风干过夜。然后，在二甲苯和乙醇中将切片脱去石蜡，用新鲜的3％过氧化氢淬火10分钟，以抑制内源组织过氧化物酶活性，并用去离子水冲洗。在未标记的封闭血清中孵育切片15分钟，以阻断二抗的非特异性结合，然后与在1％柠檬酸盐缓冲液(BioPath，Oklahoma City，OK)中稀释的兔抗-MIF(1∶400，Torrey Pines BioLabs，Inc.，Houston，TX)或作为阴性试剂对照的单独的缓冲液，孵育25分钟。在缓冲液中洗涤后，用生物素化的多价二抗溶液(含有山羊抗-兔免疫球蛋白)，孵育切片25分钟。接着，用缓冲液洗涤切片，在辣根过氧化物酶-缀合的链霉抗生物素-生物素复合物中孵育15分钟，再次在缓冲液中洗涤，然后用2次更换(每次5分钟)新鲜制备的DAB和H₂O₂在缓冲液中的混合物孵育，随后在缓冲液中、然后在水中洗涤。然后，用苏木精对切片复染，在等级系列的乙醇和二甲苯中脱水，并覆盖盖玻片。通过光学显微镜观察载玻片，并将与DAB的阳 性反应识别为暗褐色反应产物。 

实施例5 

测定对rMIF应答的心脏功能。在Langendorff试验中，使用了C 57BL/6J和C 3H/HeJ小鼠。简而言之，腹膜内地施用200U硫酸肝素20分钟后处死小鼠，立即取出心脏，并在Krebs-Hanseleit缓冲液(2mM NaHCO₃，118mM NaC l，4.7mM KCL，1.2mM KH₂PO₄，1.2mM MgSO₄，2.5mM CaCl₂，11.1mM葡萄糖，pH 7.4，其用脱盐的、去离子的水新鲜制备，并用95％O₂和5％CO₂(pO₂590mmHg，pCO₂38mmHg)充气)中置于冰上。将PE50导管插入主动脉中，以1.5ml/m(T 37℃)的恒定流速和100m l的再循环体积，用预过滤的、富氧的Krebs-Hanseleit缓冲液，以逆行的方式，通过主动脉根部，灌注心脏。将心脏置于水套室中，以维持恒定的温度和湿度。将PE60intramedic聚乙烯导管连接到插入左心室(LV)以测量LV压力的Statham压力传感器。使用插入LV肌肉的27G thertnistor针，监视温度。安装仪表后，使心脏稳定10分钟，不能达到稳定的压力或者该时间过程中发生持久的心律失常的心脏从研究中排除。稳定化后，用多通道的Grass 7D多道记录仪(Grass Instruments，Quincy，MA)，同时测量了LV压力和它的一阶导数(dP/dt)、心率和冠脉灌注。通过绘制峰收缩期LV压力和±dP/dt，，Ia，，值相对于冠状动脉血流速度的变化，确定了所有心脏的心脏功能。用或不用添加进灌注液中的20ng/ml RMIF，灌注了心脏。 

实施例6 

通过超声波心动描记术测定心脏功能障碍。使用M-模式测量，进行了评价心脏收缩功能的超声心动图。 

用5％异氟醚和2.5L/m O₂麻醉小鼠20秒(直到意识丧失)，然后用2％异氟醚和O₂麻醉平均12-15分钟。使用纱网固定3分钟后，使用 脱毛器，从胸部和上腹去除毛。诱导后约5-8分钟，在麻醉的小鼠上得到了超声心动描记术测量，使所有瞬时的心脏抑制通过。使 用吸入的异氟醚，已经报道了通过超声心动描记术检测到的这些瞬时的、最小的心脏功能变化，尽管已经报道FS(％)是稳定的。以随机的且盲的方式，以300-500帧/秒的帧频率，使用Hewlett-Packard Sonos 5500(Agilent Technologies；Edmonton，Alberta，Canada)，进行了心脏超声心动描记术。将12MHz线性转换器置于以一层US传递凝胶(Aquasonic 100，Parker Laboratories；Fairfield，NJ)为界面的左半胸廓上。二维胸骨旁短轴镜象平面引导着LV M-模式描图靠近乳头肌水平。将深度设定在2cm的最小值，扫描速度为150m/s。在Sony彩色打印机(UP-5200，Sony)上打印描图。 

实施例7 

M-模式测量。数据代表着至少2个独立扫描的平均值，每个代表着至少3个选择的搏动的平均值。将舒张末期定义为最大的LV心脏舒张尺寸，将收缩末期定义为后壁运动的峰值。如下从LV尺寸计算心脏收缩功能，作为缩短分数(FS)：FS(％)：LVED-LVES/LVED x 100，如图5A所示。 

实施例8 

统计学分析。将RNA印迹和蛋白印迹数据表达为平均值±标准误差并使用单向方差分析，进行统计学分析。使用Tukey方法，测定了实验和对照组之间的显著性(p≤0.05)。将通过Langendorff制品测定的心脏功能表达为平均值±标准误差，并使用重复测量方差分析，分别分析随治疗组和冠状动脉血流速度而变的LVP，+dP/dt_max，和-dP/dt_max中的每一个。使用采用Bonferroni方法的多重比较方法，确定组间的显著性差异(p＜0.05)。将通过超声心动图测定的心脏功能表达为缩短分数％(LVED-LVES/LVEP x 100)±标准偏差，并使用单向重复测量方差分析进行分析。使用Tukey检验，进行其它对比，以确定特定组之间的显著性差异(p＜0.05)。使用SigmaStat 2.03(SPSS Inc.，Chicago，IL)和Microsoft Excel(Microsoft Corp.，Seattle，WA)， 进行所有的统计学分析。 

实施例9 

MIF蛋白由心肌细胞在体内组成性地表达并对LPS攻击应答而释放。在基线对照条件下，在心脏组织上进行的免疫化学和蛋白印迹分析，证实了MIF在心脏细胞中的存在，包括心室的和心房的肌细胞(图1和2)。内毒素攻击后，免疫化学和免疫印迹分析证实了内毒素后心脏组织MIF的显著减少。该减少在12小时时是最突出的(75％减少)，但是到24小时恢复到接近基线对照水平。在心脏中的该表达方式类似于在肝和脾中观察到的(图2)，且与下述假说一致，即LPS攻击后，MIF是从组织内预形成的储存中释放。MIF从组织的释放，在4小时的免疫印迹上是明显的(图1)，这与内毒素暴露后血清水平的增加相关联(表1)。 

实施例10 

内毒素攻击后心肌的MIF mRNA表达。在特定的时间点从对照小鼠或LPS攻击的小鼠的心脏得到的RNA的RNA印迹分析表明，MIF mRNA在对照小鼠中组成性地表达，且在LPS攻击后，在全心脏制剂中不能检测到MIF mRNA浓度的显著变化(图3)。 

实施例11 

MIF诱导收缩和舒张心脏功能障碍。为了确定MIF是否能直接影响心脏功能，以接近在患有败血症性休克的人的血清中证实(20)的20ng/ml的浓度，用重组的MIF(rMIF)灌注了自发地搏动的正常小鼠心脏(Langendorff制品)。在来自C57BL/6J小鼠和C3H/HeJ小鼠的心 脏中，检测了对MIF的反应。C3H/HeJ小鼠对内毒素有抗性(41-43)，因此控制了下述可能性，即观察到的任何抑制可能是由于灌注液中的痕量内毒素。表2解释了2种小鼠株对用对照灌注液或含有20ng/ml重组MIF的灌注液以1.5ml/m进行的逆行主动脉灌注的反应。MIF的灌注能导致2种小鼠株中的LVP，+dP/dt_max，和-dP/dt_max的显著减少。图4解释了MIF在一定范围的冠状动脉血流速度内的作用。无论实验组的分配，所有心脏的收缩性能都有逐步的增加。MIF暴露的心脏和对照心脏的对比，揭示了功能曲线的向下漂移，表明20ng/ml rMIF引起的显著的收缩和舒张抑制(p＜0.05)。MIF的作用在内毒素敏感的(C57BL/6J)和内毒素抗性的(C 3H/HeJ)株中是统计学上相等的。同样地，在用rMIF灌注的C57BL/6J和C 3H/HeJ研究心脏之间在LVP，+dP/dt_max，和-dP/dt_max方面没有差异。 

实施例12 

抗-MIF抗体能在体内改善LPS-诱导的心脏抑制。为了确定在体内MIF对心脏功能障碍的发病机理的影响，在已经用抗-MIF单克隆抗体、同种型对照抗体预处理(90分钟前)或无治疗的LPS攻击的小鼠上，进行了连续的超声心动描记术(M-模式)(图5)。在LPS攻击后4小时，无论组分配，所有LPS攻击的小鼠的缩短分数％(FS％)类似地受抑制(FS％50％降低)。但是，在LPS攻击后8小时，与未接受治疗或接受同种型抗体对照的LPS攻击组相比，用抗-MIF单克隆抗体注射的小鼠表现出了统计学上显著的FS％恢复(图5)。在12，24和48小时，该增强的功能恢复一直持续。在攻击后48小时，抗-MIF处理的组的FS％接近总体恢复，而LPS攻击的组维持深深的抑制。在48小时中，假操作小鼠的FS％没有显著变化，表明麻醉或测试方案本身没有影响心脏功能。另外，在所有的时间点，注射同种型抗体对照的小鼠与用LPS攻击的动物相同，表明抗-MIF抗体作用的特异性。 

实施例13 

材料和方法 

抗体和细胞因子。使用多克隆的兔抗-大鼠MIF IgG(Torrey Pines BioLabs，Inc.，Houston，TX)，进行蛋白免疫印迹和免疫组织化学。以前已经证实，该抗体能与鼠MI F交叉反应，且如以前所述进行了制备(23)。使用多克隆的山羊抗-兔IgG-HRP(BioRad Corp.，Hercules，CA)作为用于蛋白免疫印迹的二抗，并保藏在4℃。在超声心动图研究中，使用了2种单克隆的小鼠抗-小鼠(和人)MIF IgG1抗体(XIV.15.5和III.D.9，Cytokine PharmaSciences，Inc.的赠品)和单克隆的小鼠IgG1同种型对照抗体(HB-49，Cytokine Pharma Sciences，Inc.的赠品)。以前已经证实了XIV.15.5和III.D.9克隆对MIF活性的体内中和。 

动物、实验设计和烧伤。将6-10周龄的雄性C57BL/6J小鼠 (Jackson Labs，Bar Harbor，ME)维持在特定无病原体的环境中。可随意地得到购买的食物和自来水。所有动物方案都经过了德克萨斯大学西南医疗中心设立的动物保护咨询委员会的审阅和批准，且与NIH公开的管理动物应用的规则相符合。对小鼠进行40％TBSA烧伤。简而言之，用异氟醚(1-2％)和2.5L/分钟氧麻醉了小鼠。然后，使用外科预备刀片和70％乙醇，从它们的背部和侧面去除毛。然后，将在沸水中加热至100℃的黄铜探针成对地(共8个探针表面区域)应用到动物的侧面和背部5秒。或者，假操作的小鼠接受了麻醉和剃毛，但是没有烧伤。去除麻醉后(氧继续)，烧伤后，腹膜内地注射含Buprenex的乳酸林格氏溶液(2cc LR+0.2cc Buprenex(＝0.05mg/kg))。然后，将小鼠置于在热灯下的各笼子中约1小时，并在研究的过程中置于加热板上并密切监视。通过CO₂窒息和随后的颈脱臼，在图中指定的时间点处死小鼠。在超声心动图研究中，在烧伤前90分钟，腹膜内地注射了单克隆的抗-MIF抗体(III.D.9和XIV.15.5)或同种型对照(HB-49)(100ug，在200ul PBS中)。取出全心脏，在液氮中快速冷冻，保藏在-80℃。在平行的实验中，将心脏在10％中性-缓冲的福尔马林中固定24小时，然后置于70％乙醇中，直到对它们进行加工处理用于免疫组织化学。通过眼眶后取血收集全血，收集并保藏血清。 

蛋白提取和蛋白印迹。在裂解缓冲液(10mM HEPES，2mM EDTA，0.1％Chaps，pH 7.4，每10ml缓冲液具有1个Complete Mini-EDTA-Free蛋白酶抑制剂混合片剂，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)中，在冰上匀浆保藏在-80℃的心脏。使用Bio-Rad蛋白试验(Hercules，CA)，定量蛋白浓度。然后，在还原条件下，在12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上，分离在Laemmeli样品缓冲液(Bio-Rad)中以1∶1比例稀释至10ul终体积的50ug总蛋白(裂解物)。在每个凝胶上运行预染色的SDS-PAGE标准品(Kaleidoscope Broad range，Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)，以确定检测的条带的大约分子量。使用Mini 转移装置(Bio-Rad，Hercules， CA)，在100V，将凝胶转移到PVDF膜(NEN，Boston，MA)上70分钟，并用冰袋冷却。用甲醇重新润湿膜，用100+ml水洗涤最少3次，在4℃封闭过夜(5％脱脂奶粉(Bio-Rad)/TBS/0.1％吐温-20(TBS-T)。然后，用兔抗-MIF一抗(1∶1250稀释)在室温、在5％牛奶/TBS-T中孵育膜2小时，并在TBS-T中洗涤1次、15分钟，然后在TBS-T中洗涤5次(每次5分钟)。然后，与HRP缀合的山羊抗-兔抗体在TBS-T(1∶5000)中在室温孵育1小时，洗涤2次、15分钟，然后在TBS-T中另外洗涤5次(每次5分钟)。为了显色，将5ml ECL试剂(SuperSignalWest Pico，Pierce，Rockford，IL)置于PVDF膜上5分钟，并通过Kodak X-OMAT AR底片(Eastman Kodak Co.，Rochester，New York)检测得到的化学发光反应。 

使用Scanjet 3400c(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)将X线照像底片转化成TIFF文件(8位灰度)，然后使用Quantity One软件(Bio-Rad，Hercules，CA，Ver.4.4.0，Build 36)，确定具有MIF的近似分子量的(12.5kD)的单一条带密度的定量，并以任意单位(A.U.)/mm²记录。 

免疫组织化学。在中性缓冲的福尔马林中固定组织，用石蜡处理，随后使用具有辣根过氧化物酶和二氨基联苯胺(DAB)色原的超-链霉抗生物素生物素系统(Signet Laboratories，Dedham，MA)，在室温，在BioTek Solutions Techmate^TM 1000自动化的免疫染色仪(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)上，进行免疫染色。使用已知的阳性对照组织(LPS攻击后的大鼠)，预测了最佳的一抗浓度。在轮转切片机上，切3um的石蜡切片，固定到带正电荷的玻璃载玻片上(POP 100毛细管凹口载玻片，Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)，并风干过夜。然后，在二甲苯和乙醇中将切片脱去石蜡，用新鲜的3％过氧化氢淬火10分钟，以抑制内源组织过氧化物酶活性，并用去离子水冲洗。在未标记的封闭血清中孵育切片15分钟，以阻断二抗的非特异性结合，然后用在1％柠檬酸盐缓冲液(BioPath，Oklahoma City，OK)中稀释的多克隆兔抗-大鼠MIF IgG(1∶400，Torrey Pines BioLabs， Inc.，Houston，TX)或作为阴性试剂对照的单独的缓冲液，孵育25分钟。对于每个时间点和每种器官，运行阴性试剂对照。在缓冲液中洗涤后，用生物素化的多价二抗溶液(含有山羊抗-兔免疫球蛋白)，孵育切片25分钟。接着，用缓冲液洗涤切片，在辣根过氧化物酶-缀合的链霉抗生物素-生物素复合物中孵育15分钟，再次在缓冲液中洗涤，然后用2次更换(每次5分钟)新鲜制备的DAB和H₂O₂在缓冲液中的混合物孵育，随后在缓冲液中、然后在水中洗涤。然后，用苏木精对切片复染，在等级系列的乙醇和二甲苯中脱水，并覆盖盖玻片。通过光学显微镜观察载玻片，并将与DAB的阳性反应识别为暗褐色反应产物。 

血清MIF水平的测定。根据生产商的说明书，使用Chemikine^TM大鼠/小鼠巨噬细胞抑制因子(MIF)EIA试剂盒(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)，测试了来自6只小鼠的血清的小鼠MIF。简而言之，将5ul标准品、样品或反应缓冲液(空白)一式三份地加入每个孔中。接着，将100ul稀释的MIF-HRP抗体缀合物加入每个孔中，在室温孵育2小时。然后，洗涤孔5次，加入100ul3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物，在室温在暗处孵育30分钟。将终止试剂加入每个孔中，温和地混合，在试验结束30分钟内，在ELISA平板读数器(EL 312e Microplate Reader，Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)上，在450nm(630nm背景)阅读ELISA。 

通过Luminex进行多种细胞因子检测。根据生产商的说明书，在Luminex xMAP^TM系统(Luminex Corp.，Austin，TX)上，使用小鼠细胞因子Ten-Plex抗体珠试剂盒(Biosource International，Inc.，Camarillo，CA)，检测了血浆炎性细胞因子(IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12，IFN-γ，TNF-α，和GM-CSF)浓度。将平板装载到Luminex XYP^TM平台上，将装置设定到取出50ul，将总事件设定到等于100/每珠组。在每个样品中，为每种细胞因子收集至少100个事件(大多数＞200)，以检测统计学上的显著性结果。使用Luminex^TMData Collector软件(Luminex Corp.，Austin，TX)，收集数据。 将在每次运行中使用的批特异性的重配的标准品的浓度输入软件，然后，使用MasterPlex^TM QT软件(Version 1.2.8.58，MiraiBio，Inc.，Alameda，CA)，从细胞因子特异性标准曲线外推未知样品的分析物浓度。将终浓度乘以2，以解释初始的稀释因子。对于所有的细胞因子，都没有检测到高于标准品曲线的样品。 

总RNA分离，MIF和β-肌动蛋白探针制备，和RNA印迹。将保藏在-80℃的心脏置于液氮填充的杵中，并用研钵磨成细粉。然后，将每种粉碎的心脏立即置于2ml Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，根据生产商的方案，分离总RNA，并通过分光光度计法进行定量。从使用Genelute HP质粒MidiPrep试剂盒(Sigma，St.Louis，MO)分离的含有MIF的质粒(Image Clone I.D.634910，Research Genetics，Huntsville，AL)，制备了MIF特异性的RNA印迹探针。通过EcoR I和NotI消化(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)制备了片段，使用GenElute琼脂糖旋转柱(Supelco，Bellefonte，PA)，在1.2％琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化和分离。β-肌动蛋白探针DNA片段购自Ambion(Austin，TX)。使用Strip-EZ^TM DNA探针合成试剂盒(Ambion，Austin，TX)，用5ul[α-³²P]dATP(3000Ci/mmol，10mCi/ml)(PerkinElmer，Boston，MA)标记了MIF和β-肌动蛋白探针，并根据生产商的说明书，在ProbeQuant微量柱(Amersham Pharmacia，Piscatany，NJ)中纯化。 

在1.2％琼脂糖凝胶上，在100伏特，分离RNA(10ug)1小时，并在转移电泳设备(TransPhor PowerLid，Hoefer Scientific Instruments，San Francisco)上，在1.5安培，转移到Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia，Buckingham，England)上70分钟。使用GS Gene Linker(Bio-Rad，Hercules，CA)，将RNA连接到膜上大约2分钟。在Perfect-Hyb Plus(Sigma，St.Louis，MO)中，在杂交烘箱(Sorvall Life Science，Inc.，Greensboro，NC)中，在68℃预杂交膜1小时。然后，加入剪切的、变性的鲑鱼或鲱鱼睾丸DNA(100ug/ml)1小时，随后加入大约0.1μg以＞5×10⁸cpm/ug标记的探针。 然后，在杂交烘箱中在68℃杂交印迹12小时，随后在68℃、在2X SSC，0.1％SDS中洗涤。将膜洗涤1小时，更换缓冲液，然后在68℃洗涤膜另外1小时。将膜包在莎纶膜中，24小时后，通过Kodak X-OMAT AR底片(Eastman Kodak Co.，Rochester，New York)检测mRNA。然后，以类似的方式，用放射性标记的β-肌动蛋白(0.1ug以＞5×10⁸cpm/ug标记的探针)(Ambion，Austin，TX)，重新探测同一膜。如上所述，进行蛋白印迹的密度测定法。β-肌动蛋白mRNA条带用作对照，针对它标准化MIF mRNA密度测定。 

通过Langendorff进行离体心脏功能测定。使用Langendorff试验方法，检测了小鼠心脏功能。简而言之，腹膜内地注射了200单位硫酸肝素，20分钟后处死小鼠。立即取出心脏，并在K rebs-Henseleit缓冲液(2mM NaHCO₃，118mM NaCl，4.7mM KCL，1.2mM KH₂PO₄，1.2mM MgSO₄，2.5mM CaCl₂，11.1mM葡萄糖，pH 7.4，其用脱盐的、去离子的水新鲜制备，并用95％O₂和5％CO₂充气(PO₂590mmHg，pCO₂ 38mmHg))中置于冰上。将PE50导管插入主动脉中，以1.5ml/min(T37℃，100ml再循环体积)的恒定流速，用预过滤的、富氧的Kreb s-Hanseleit缓冲液，以逆行的方式，通过主动脉根部，灌注心脏。将心脏置于水套室中，以维持恒定的温度和湿度。将连接到Statham压力传感器上的PE60intramedic聚乙烯导管插入左心室(LV)，以测量LV压力。使用插入LV肌肉的27Gthermistor针，监视温度。安装仪表后，使心脏稳定10分钟，从该研究中排除了不能达到稳定的压力或者该时间过程中发生持久的心律失常的心脏。稳定化后，用多通道的Grass 7D多道记录仪(Grass Instruments，Quincy，MA)，同时测量了LV压力和它的一阶导数(dP/dt)、心率和冠脉灌注。通过绘制峰收缩LV压力和±dP/dt_max值相对于冠状动脉血流速度的增加，确定了所有心脏的心室性能作为冠脉灌注的函数。 

通过超声心动描记术检测心脏功能障碍。 

使用M-模式测量，进行了评价心脏收缩功能的超声心动图。用5％异氟醚和2.5L/m O₂麻醉小鼠20秒(直到意识丧失)，然后用2％异氟 醚和O₂麻醉平均12-15分钟。固定3分钟后，使用 脱毛器和纱布，从胸廓和上腹去除毛。诱导后约5-8分钟，在麻醉的小鼠上得到了超声心动描记术测量。以随机的且盲的方式，以300-500帧/秒的帧频率，使用Hewlett-Packard Sonos5500(Agilent Technologies；Edmonton，Alberta，Canada)，进行了心脏超声心动描记术。将12MHz线性转换器置于以一层US传递凝胶(Aquasonic100，Parker Laboratories；Fairfield，NJ)为界面的左半胸廓上。二维胸骨旁短轴镜象平面引导着LV M-模式描图靠近乳头肌水平。将深度设定在2cm的最小值，扫描速度为150m/s。在Sony彩色打印机(UP-5200，Sony)上打印描图。 

M-模式测量。数据代表着来自至少2个独立扫描的9个选择的心动周期的平均值。将舒张末期定义为最大的LV心脏舒张尺寸，将收缩末期定义为后壁运动的峰值。如下从LV尺寸计算缩短分数％(FS％)，即心脏收缩功能的代替指标：FS(％)＝LVED-LVES/LVED×100，如图12所示。 

统计学分析。将RNA印迹和蛋白印迹数据表达为平均值±标准误差(SE)，并使用单向-方差分析(ANOVA)，进行统计学分析。使用Tukey方法，进行了多重比较方法，以测定组之间的统计显著性。将通过Langendorff制品(包括稳定数据)测定的心脏功能表达为平均值±SE，并使用重复测量-ANOVA，分别分析随治疗组和冠状动脉血流速度而变的每个LVP，+dP/dt_max，和-dP/dt_max。使用采用Bonferroni方法的多重比较方法，确定组间的显著性差异。将血清MI F水平表达为平均值±SE，并使用单向-ANOVA进行统计学分析，使用采用Bonferroni方法的多重比较方法确定组之间的显著性。将通过M-模式超声心动描记术测定的心脏功能表达为缩短分数％±SE，并使用单向重复测量-ANOVA进行分析。使用Tukey检验，进行其它对比，以确定特定组之间的显著性差异。所有分析的统计显著性都确定为p≤0.05。使用Sigma Stat 2.03(SPSS Inc.，Chicago，IL)和Microsoft Excel(Microsoft Corp.，Seattle，WA)，进行所有的统计学分析。 

结果-实施例13 

MIF蛋白在体内由心肌细胞组成性地表达并对烧伤应答而释放。在基线，细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)存在于心室和心房肌细胞中，如通过蛋白印迹和免疫组织化学所证实的(图7和8)。烧伤后，在8小时鉴别出了显著减少(2.1倍)，MIF的组织浓度到12小时恢复到基线水平(图7)。该表达方式在烧伤后的肝、脾和肺中是平行的(图8)，且与下述假设一致，即烧伤的介质能引起MIF的释放。 

烧伤后，全身的MIF和IL-6水平增加。在4小时，在血清中鉴别出了MIF的最大全身释放(2.2倍增加)，并到8小时恢复到基线水平(图9)。在12小时，鉴别出了最大血清I L-6水平，它到48小时恢复到基线水平。烧伤后，血清IL-12水平减少，在24小时时最少，到48小时恢复到基线水平。在血清中没有检测到测试的其它细胞因子(如在材料和方法中所列出的)。 

到烧伤后8小时，心脏中的MIF mRNA在心脏中显著增加。从假操作的小鼠或在烧伤后4，8，12，24和48小时的小鼠的心脏分离的总RNA，通过RNA印迹分析，检测了MIF mRNA的水平(图10)。MIF mRNA在心脏中组成性地表达，最初在8小时发生转录的显著增加，在剩余的检查时间进程中(48小时)，它受到上调(图10)。 

抗-MIF抗体能离体地改善LPS-诱导的心脏抑制。使用心脏功能的Langendorff分析，检测了来自经历了假操作、烧伤或用抗-MIF抗体预处理的烧伤的小鼠的心脏对1.5ml/分钟的逆行主动脉灌注的反应。经历烧伤后18小时，在小鼠中鉴别了LVP，+dP/dt_max，-dP/dt_max，DR，dP40，TPP，RT90和达到Max-dP/dt的时间的显著减少(表3)。到18小时，完全保护了经历烧伤的用抗-MIF(克隆III.D.9)预处理的小鼠(表3)，而用同种型对照处理的小鼠与单独的烧伤没有显著差异(未显示数据)。 

图11说明了烧伤或假操作后18小时来自假操作的小鼠、烧伤小鼠和用抗-MIF抗体预处理的烧伤小鼠在一定范围的冠状动脉血流速 度内的心脏功能。冠脉血流量的增加，导致了所有测试的心脏(组)的收缩性能的增加。经历烧伤的小鼠表现出了LVP，+dP/dt_max和-dP/dT_max功能曲线的向下漂移，证实了显著的收缩和舒张功能障碍(图11)。但是，当施用抗-MIF抗体时，不存在该功能障碍，没有鉴别出与假操作的小鼠的显著性差异(图11)。 

抗-MIF单克隆抗体治疗能在体内改善与烧伤相关的心脏抑制。在接受烧伤的小鼠和在烧伤前90分钟用2种抗-MIF抗体中的任一种、同种型对照或无治疗预处理的小鼠上，进行了连续的超声心动描记术(M-模式)(图12)。在4和8小时，所有烧伤处理的小鼠的缩短分数百分比(FS％)类似地抑制了21.4FS(56.2FS％-34.8FS％)，无论有无抗-MIF治疗。但是，在烧伤后12小时，与未接受治疗或接受同种型抗体对照的烧伤小鼠相比，注射了2种单克隆的抗-MIF抗体中的任一种的小鼠表现出了统计学上显著的FS％恢复(图12)。到24小时，治疗的小鼠的FS％与对照没有显著差异，表明完全保护了有关的心脏功能障碍。在48小时中，假操作的小鼠的FS％没有显著变化，表明测试方案和麻醉没有影响心脏功能。最后，接受同种型对照抗体的小鼠没有表现出与经历单独烧伤的动物的显著差异，表明抗-MIF抗体作用的特异性。 

实施例14 

为了确定在亚致死量的内毒素中毒模型中TNF-α信号转导在MIF分泌和其有关的心脏功能障碍中的作用，在实施例14中进行了下面的实验。 

材料和方法 

抗体和细胞因子。使用能与鼠MIF交叉反应的多克隆的兔抗-大鼠MIF IgG(Torrey Pines BioLabs，Inc.，Houston，TX)，进行蛋白免疫印迹和免疫组织化学。将多克隆的山羊抗-兔IgG-HRP(BioRadCorp.，Hercules，CA)用作蛋白免疫印迹的二抗。在超声心动图研究中，使用了2种单克隆的小鼠抗-小鼠(和人)MIFI gG1抗体(XIV.15.5和III.D.9，Cytokine PharmaSciences，Inc.，King of Prussia，PA的赠品)和单克隆的小鼠IgG1同种型对照抗体(HB-49，CytokinePharmaSciences，Inc.的赠品)。以前已经证实了XIV.15.5和III. D.9克隆对MIF活性的体内中和。用于中和TNF-α的重组人TNFR:Fc 是Immunex Corp./Amgen，Inc.，(Thousand Oaks，CA)的赠品。根据Bernhagen等的方法合成了重组人MIF并由Cytokine Pharmasciences，Inc.提供。 

动物和实验设计。得到了6-10周龄的无病原体的、成年的雄性C57BL/6J小鼠，并在大约12周龄时使用(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)。从Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)购买了B6：129PF1/J和B6：129S-Tnfrsfla^tm1 Imx Tnfrsflb^tm1 Imx小鼠(TNFR-/-)育种对，在基因分型后，使用20-24周(30-40克)的雄性后代。可随意获得无菌的购买的食物和水。所有动物方案都经过了德克萨斯大学西南医疗中心设立的动物保护咨询委员会的审阅和批准，且与NIH公开的管理动物应用的规则相符合。 

给小鼠腹膜内地注射了4mg/此大肠杆菌0111:B4LPS(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)，并通过CO₂窒息和随后的颈脱臼处死。未注射的小鼠用作对照。在超声心动图研究中，在LPS攻击之前90分钟，腹膜内地注射(100ug，在200ul PBS中)了2种抗-MIF抗体(III.D.9和XIV.15.5，Cytokine PharmaSciences，Inc.，King of Prussia，PA的赠品)和它们的同种型对照(HB-49，Cytokine PharmaSciences，Inc.的赠品)。在野生型小鼠中，在LPS攻击前75分钟，腹膜内地注射了 (rhTNFR:Fc)(5mg/kg或300ug在0.5ml PBS中)。 

取出全心脏，并在液氮中快速冷冻，保藏在-80℃或在10％中性-缓冲的福尔马林中固定24小时，并置于70％乙醇中，用于免疫组织化学。通过眼眶后取血收集全血，并使用分离管分离血清。将血清转移到无菌的有弹簧盖头的试管中，在-80℃冷冻，直到进行ELISA试验。 

血清MIF水平的测定。根据生产商的说明书，使用Chemikine^TM大鼠/小鼠巨噬细胞抑制因子(MIF)EIA试剂盒(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)，测试了来自6只小鼠的血清 中的小鼠MIF。简而言之，将5ul标准品、样品或反应缓冲液(空白)一式两份地加入每个孔中。将稀释的MIF-HRP抗体缀合物加入每个孔中(100ul)，在室温孵育2小时。然后，洗涤孔5次，加入TMB底物(100ul)，在室温在暗处孵育30分钟。将终止试剂加入每个孔中，温和地混合，在试验结束30分钟内，在ELISA平板读数器(EL 312eMicroplate Reader，Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)上，在450nm(630nm背景)读取ELISA。 

蛋白提取和蛋白印迹。在裂解缓冲液(10mM HEPES，2mM EDTA，0.1％Chaps，pH 7.4，每10ml缓冲液具有1个Complete Mini-EDTA-Free蛋白酶抑制剂混合片剂，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)中，在冰上匀浆保藏在-80℃的心脏。使用Bio-Rad蛋白试验(Hercules，CA)定量蛋白浓度，将在Laemmeli样品缓冲液(Bio-Rad)中稀释的50ug蛋白以1∶1比例加至10ul终体积，在还原条件下，在12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离。在每个凝胶上运行(10ul/泳道)预染色的SDS-PAGE标准品(Kaleidoscope Broad range，Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)，以确定检测的条带的大约分子量。使用Mini 电泳转移池(Bio-Rad，Hercules，CA)，在100V，将凝胶转移到PVDF膜(NEN，Boston，MA)上70分钟，并用冰袋冷却。随后，用甲醇重新润湿膜，用100ml水洗涤最少3次，在4℃封闭过夜(5％脱脂奶粉(Bio-Rad)/TBS/0.1％吐温-20(TBS-T)。然后，用兔抗-MIF一抗(1∶1250稀释)在室温、在5％牛奶/TBS-T中孵育膜2小时。在TBS-T中洗涤膜1次、15分钟，然后洗涤5次(每次5分钟)。然后，用HRP缀合的山羊抗-兔抗体(1∶5000稀释)在TBS-T中在室温孵育膜1小时。然后，洗涤膜2次、15分钟，然后另外洗涤5次(每次5分钟)。然后，用5ml ECL试剂(SuperSignal West Pico，Pierce，Rockford，IL)使膜显色5分钟，并通过Kodak X-OMAT AR底片(Eastman Kodak Co.，Rochester，New York)检测得到的化学发光反应。 

使用Scanjet 3400c(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)将X 线底片转化成TIFF文件(8位灰度)，然后使用Quantity One软件(Bio-Rad，Hercules，CA，Ver.4.4.0，Build 36)确定具有MIF近似分子量(12.5kD)的单一条带密度的定量，并以任意单位(A.U.)/mm²记录。 

免疫组织化学。在中性缓冲的福尔马林中固定组织，用石蜡处理，随后使用具有辣根过氧化物酶和二氨基联苯胺(DAB)色原的超-链霉抗生物素生物素系统(Signet Laboratories，Dedham，MA)，在室温，在BioTek Solutions Techmate^TM 1000自动化的免疫染色仪(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)上，进行免疫染色。在轮转切片机上，切3um的石蜡切片，固定到带正电荷的玻璃载玻片上(POP 100毛细管凹口载玻片，Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)，并风干过夜。然后，在二甲苯和乙醇中将切片脱去石蜡，用新鲜的3％过氧化氢淬火10分钟，以抑制内源组织过氧化物酶活性，并用去离子水冲洗。在未标记的封闭血清中孵育切片15分钟，以阻断二抗的非特异性结合，然后用在1％柠檬酸盐缓冲液(BioPath，Oklahoma City，OK)中稀释的兔抗-MIF(1∶400，Torrey Pines BioLabs，Inc.，Houston，TX)或作为阴性试剂对照的单独的缓冲液，孵育25分钟。在缓冲液中洗涤后，用生物素化的多价二抗溶液(含有山羊抗-兔抗体)，孵育切片25分钟。接着，用缓冲液洗涤切片，在辣根过氧化物酶-缀合的链霉抗生物素-生物素复合物中孵育15分钟，再次在缓冲液中洗涤，然后用2次更换(每次5分钟)新鲜制备的DAB和H₂O₂在缓冲液中的混合物孵育，随后在缓冲液中、然后在水中洗涤。然后，用苏木精对切片复染，在等级系列的乙醇和二甲苯中脱水，并覆盖盖玻片。通过光学显微镜观察载玻片，并将与DAB的阳性反应识别为暗褐色反应产物。 

总RNA分离，MIF和β-肌动蛋白探针制备，和RNA印迹。将保藏在-80℃的心脏置于液氮填充的杵中，并用研钵磨成细粉。然后，将每种粉碎的心脏立即置于2ml Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，根据生产商的方案，分离总RNA，并通过分光光度计法进行定量。从使用Genelute HP质粒MidiPrep试剂盒(Sigma，St.Louis，MO) 分离的含有MI F的质粒(Image Clone I.D.634910，Research Genetics，Huntsville，AL)，制备了MIF特异性的RNA印迹探针。通过EcoRI和NotI消化(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，制备了片段，使用GenElute琼脂糖旋转柱(Supelco，Bellefonte，PA)，在1.2％琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化和分离。β-肌动蛋白探针DNA片段购自Ambion(Austin，TX)。使用Strip-EZ^TM DNA探针合成试剂盒(Ambion，Austin，TX)，用5ul[α-³²P]dATP(3000Ci/mmol，10mCi/ml)(PerkinElmer，Boston，MA)标记了MI F和β-肌动蛋白探针，并根据生产商的说明书，在ProbeQuant微量柱(AmershamPharmacia，Piscatany，NJ)中纯化。 

根据生产商的方案，以1∶3的样品：装载染料比例，将分离的总RNA(10ug)与甲醛装载染料(Ambion，Inc.)组合。每个凝胶具有与样品(10ug)平行跑胶的0.24-9.5kB RNA梯度(Invitrogen Corp.)。在电泳前，将样品和RNA梯度置于65℃10分钟，在1.2％琼脂糖凝胶上，在100伏特，以1XTAE缓冲液(Ambion，Inc.)分离1小时，并在转移电泳设备(TransPhor PowerLid，Hoefer ScientificInstruments，San Francisco)上，在0.5X TAE中，在1.5安培，转移到Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia，Buckingham，England)上70分钟。使用GS Gene Linker(Bio-Rad，Hercules，CA)，将RNA连接到膜上大约2分钟。在Perfect-Hyb Plus(Sigma，St.Louis，MO)中，在杂交烘箱(Sorvall Life Science，Inc.，Greensboro，NC)中，在68℃，用剪切的、变性的鲑精DNA(100ug/ml)预杂交膜1小时。然后，通过加热至90℃10分钟，制备了探针(10ul探针与100ul 10mM EDTA)，随后向杂交缓冲液中加入大约0.1μg以＞5×10⁸cpm/ug标记的探针。然后，在68℃杂交印迹12小时，随后在68℃、在2XSSC，0.1％SDS中洗涤。将膜洗涤1小时，更换缓冲液，然后在68℃洗涤膜另外1小时。将膜包在莎纶膜中，24小时后，通过KodakX-OMAT AR底片(Eastman Kodak Co.，Rochester，New York)检测mRNA。然后，以类似的方式，用放射性标记的β-肌动蛋白(0.1ug 以＞5×10⁸cpm/ug标记的探针)(Ambion，Austin，TX)，重新探测同一膜。如上所述，进行蛋白印迹的密度测定法。β-肌动蛋白mRNA条带用作对照，针对它标准化MIF mRNA密度测定。 

通过Langendorff进行离体心脏功能测定。使用Langendorff试验方法，检测了小鼠心脏功能。简而言之，腹膜内地注射了200单位硫酸肝素，20分钟后处死小鼠。立即取出心脏，并在Krebs-Henseleit缓冲液(2mM NaHCO₃，118mM NaCl，4.7mM KCL，1.2mM KH₂PO₄，1.2mM MgSO₄，2.5mM CaCl₂，11.1mM葡萄糖，pH 7.4，其用脱盐的、去离子的水新鲜制备，并用95％O₂和5％CO₂充气(PO₂590mmHg，pCO₂38mmHg))中置于冰上。将PE 50导管插入主动脉中，以1.5ml/m(恒定温度37℃，100m l再循环体积)的恒定流速，用预过滤的、富氧的Krebs-Hanseleit缓冲液，以逆行的方式，通过主动脉根部，灌注心脏。将心脏置于水套室中，以维持恒定的温度和湿度。将连接到Statham压力传感器上的intramedic聚乙烯导管(PE60)插入左心室(LV)，以测量LV压力。使用插入LV肌肉的27Gthermistor针，监视温度。安装仪表后，使心脏稳定10分钟，从该研究中排除了不能达到稳定的压力或者该时间过程中发生持久的心律失常的心脏。稳定化后，用多通道的Grass 7D多道记录仪(Grass Instruments，Quincy，MA)，同时测量了LV压力和它的一阶导数(dP/d t)、心率和冠脉灌注。通过绘制峰收缩LV压力和±dP/dt_max值相对于冠状动脉血流速度的增加，确定了所有心脏的随着冠脉灌注而变化的心室性能。用或不用添加进灌注液中的20ng/ml rMIF，灌注了心脏。 

通过超声心动描记术检测心脏功能障碍。 

使用M-模式测量，进行了评价心脏收缩功能的超声心动图。用5％异氟醚和2.5L/m O₂麻醉小鼠20秒(直到意识丧失)，然后用2％异氟醚和O₂麻醉平均12-15分钟。固定3分钟后，使用 脱毛器和纱布，从胸廓和上腹去除毛。诱导后约5-8分钟，在麻醉的小鼠上得到了超声心动描记术测量。以随机的且盲的方式，以300-500帧/秒的帧频率，使用Acuson Sequoia^TM Model C256(Siemens Medical  Solutions，USA，Inc.，Mountain View，CA)，进行了心脏超声心动描记术。将15MHz线性转换器(15L8，Siemens Medical Solutions，USA，Inc.)置于以一层超声传递凝胶(Aquasonic 100，Parker Laboratories；Fairfield，NJ)为界面的左半胸廓上。二维胸骨旁短轴镜象平面引导着LV M-模式描图靠近乳头肌水平。将深度设定在2cm的最小值，扫描速度为200m/s。 

M-模式测量。数据代表着来自至少2个单独扫描的9个选择的心动周期的平均值。将舒张未期定义为最大的LV舒张尺寸，将收缩未期定义为后壁运动的峰值。如下从LV尺寸计算缩短分数％(FS％)，即心脏收缩功能的代替指标：FS(％)＝LVED-LVES/LVED × 100，如图18所示。 

通过Luminex进行多种细胞因子检测。根据生产商的说明书，在Luminex xMAP^TM系统(Luminex Corp.，Austin，TX)上，使用小鼠细胞因子Ten-Plex抗体珠试剂盒(Biosource International，Inc.，Camarillo，CA)，检测了血浆炎性细胞因子(I L-1β，I L-2，I L-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12，IFN-γ，TNF-α，和GM-CSF)浓度。将平板装载到Luminex XYP^TM平台上，将装置设定到取出50ul，将总事件设定到等于100/每珠组(大多数收集了200)。使用Luminex^TM Data Collector软件(Luminex Corp.，Austin，TX)，收集数据。将在每次运行中使用的批特异性的重配的标准品的浓度输入软件，然后，使用MasterPlex^TM QT软件(Version 1.2.8.58，Mirai Bio，Inc.，Alameda，CA)，从细胞因子特异性的标准曲线外推未知样品的分析物浓度。将终浓度乘以2，以解释初始的稀释因子。对于所有的细胞因子，都没有检测到高于标准品曲线的样品。 

统计学分析。将RNA印迹和蛋白印迹数据表达为平均值±标准误差(SE)，并使用单向-方差分析(ANOVA)，进行统计学分析。使用Tukey方法，进行了多重比较方法，以测定组之间的统计显著性。将通过Langendorff制品测定的心脏功能(包括稳定数据)表达为平均值±SE，并使用重复测量-ANOVA，分别分析随治疗组和冠状动脉血流速度 而变的每个LVP，+dP/dt_max，和-dP/dt_max。使用采用Bonferroni方法的多重比较方法，确定组间的显著性差异。将血清MIF水平表达为平均值±SE，并使用单向-ANOVA进行统计学分析，使用采用Bonferroni方法的多重比较方法，确定组之间的显著性。将通过M-模式超声心动描记术测定的心脏功能表达为缩短分数％±SE，并使用单向重复测量-ANOVA进行分析。使用Tukey检验，进行其它对比，以确定特定组之间的显著性差异。所有分析的统计显著性都确定为p≤0.05。使用SigmaStat 2.03(SPSS Inc.，Chicago，IL)和Microsoft Excel(Microsoft Corp.，Seattle，WA)，进行所有的统计学分析。 

结果-实施例14 

野生型小鼠、用 预处理的野生型小鼠和SNFR-/-小鼠中的血清MIF水平。LPS攻击后，在野生型小鼠中，MIF的血清水平在8小时达到最大(约1.5倍基线)(图13A)。当用LPS攻击TNFR-/-小鼠时，在12小时时达到最大的血清MIF水平(约1.7倍基线)(图13B)。在用 预处理(60分钟)并用LPS攻击的野生型小鼠中，在24小时时鉴别出了最大血清MIF水平(约2.3倍基线)(图13C)。 

LPS攻击后，未从TNFR-/-小鼠的心脏、脾或肝中释放出心脏MIF。在心脏、肝和脾上进行的蛋白印迹和免疫组织化学分析证实，在TNFR-/-小鼠或用 预处理的野生型小鼠中，在任何时间都没有发生以前记载的在LPS攻击后的野生型小鼠中的释放，二者都阻止了TNF-α信号转导(图14和15)。 

LPS攻击后，在TNFR-/-小鼠中没有调制心脏MIF转录。检测从用LPS攻击的TNFR-/-小鼠的心脏组织分离的总RNA中的MIF mRNA，证实了LPS攻击后没有上调MIF的转录(图16)，而这以前已经在野生型小鼠中在48小时鉴别出。 

MIF在TNFR-/-小鼠中具有与在野生型小鼠中相同程度的直接心脏抑制作用。为了确定MIF是否能独立于TNF地直接影响心脏功能，以接近记载(25)的在败血症性休克患者中的血清水平的20ng/ml的浓 度，用重组人MIF(rMIF)灌注了自发地搏动的正常小鼠心脏(Langendorff制品)。已经证实，在Langendorff灌注研究中使用的人MIF与鼠MIF具有大约90％同源性，且具有跨物种的生物功能。 

表4证实了TNFR-/-小鼠、C57BL/6小鼠和TNFR-/-小鼠的背景株对用对照灌注液或含有20ng/ml rMIF的灌注液以1.5ml/分钟进行逆行主动脉灌注的反应。rMI F的灌注能导致2种小鼠株中的LVP，+dP/dt_max，-dP/dt_max和dp40(mm Hg/sec)的显著减少，而其它参数(达到max±dP/dt的时间，CPP，CVR，和HR)不受影响。图18解释了rMIF在一定范围的冠状动脉血流速度内的作用。无论实验组的分配如何，冠脉(血流速度)增加都导致心脏的收缩性能逐步的增加。MIF攻击的心脏表现出功能曲线的向下漂移，导致了20ng/ml引起的显著的收缩(+dP/dt)和舒张(-dP/dt)功能曲线(p＜0.05)。 

在LPS攻击后24-48小时，在TNFR-/-小鼠中，抗-MIF抗体对MIF的中和能导致完全保护。为了确定在体内在心脏功能障碍的发病机理中TNF信号转导对MIF的影响，在(90分钟前)用2种抗-MIF单克隆抗体中的任一种、同种型对照抗体或无治疗预处理的LPS攻击的TNFR-/-小鼠上，进行了连续的超声心动描记术(M-模式)(图17)。在LPS攻击后4，8和12小时，无论组分配如何，与基线(45.9+/-0.002FS％)相比，所有LPS攻击的小鼠的缩短分数百分比(FS％)类似地降低(27.7+/-0.01FS％)(图17B，C，E)。但是，在LPS攻击后24小时，与接受LPS或LPS和同种型抗体的LPS攻击组相比，用2种单克隆的抗-MIF抗体中的任一种处理的小鼠表现出了统计学上显著的FS％恢复(图17)。该增强的功能恢复一直持续到48小时，这时功能完全恢复，而接受同种型对照的LPS攻击的小鼠仍然明显受到抑制(图17D，17E)。在48小时中，未处理的对照TNFR-/-小鼠的FS％没有显著变化，表明测试方案没有影响心脏功能。 

野生型小鼠和TNFR-/-小鼠中的血清细胞因子释放。由于已经证实，除了LPS攻击后早期的TNF-α外，其它的炎性细胞因子(即IL-1β，IL-6)在心脏功能障碍中起作用，我们检测了野生型和TNFR-/-小鼠中 的炎性因子的血清水平(图19)。在该图中，在野生型小鼠中的TNF-α，IL-1β的释放不明显，因为这些细胞因子在TNFR-/-小鼠中的显著增加(在LPS攻击后4小时，比野生型增加至31.2(4934/158pg/ml)倍和94.7(7099/75pg/ml)倍)，如图19A和19B所示。同样地，与野生型小鼠相比，TNFR-/-小鼠中的IL-12也增加(1.7(5128/2937pg/ml)倍)(图19C)，而IFN-γ水平减少了3.6(210/58pg/ml)倍(图19D)。在野生型和TNFR-/-小鼠中，IL-10和IL-6类似地增加，尽管TNFR-/-小鼠中每种细胞因子的延迟都减少了(图19E和19F)。与野生型小鼠相比，在4小时时，TNFRKO小鼠中的IL-6水平是8.5倍(7099/835pg/ml)。在野生型和TNFR-/-小鼠中，都鉴别出了GM-CSF的全身增加，时间反应是接近相同的(图19G)。LPS攻击后，在野生型或TNFR-/-小鼠中，细胞因子IL-2，IL-4和IL-5没有表现出可忽略的调制。 

MIF中和后，野生型小鼠中的血清细胞因子释放。在该研究中测试的10种细胞因子中，MIF中和抗体(LPS攻击前)仅仅在野生型小鼠中影响了LPS攻击后的血清IFN-γ和IL-10水平的调制(增加或减少)(图20)。更具体地，在LPS攻击后8小时的IFN-γ释放峰(图19C)减弱了3倍(210/69pg/ml)(图20A)。LPS攻击后，在野生型小鼠中，在48小时达到峰值的IL-10在野生型小鼠中的延迟释放减弱了2.9倍(244/84pg/ml)(图20B)。 

实施例15 

动物：随意供给购买的食物和自来水，饲养来自Charles River的C57BL/6小鼠(12-15周龄)。所有动物方案都经过了德克萨斯大学西南IACAC的审阅和批准，且与NI H公开的管理动物应用的规则相符合。 

冠状动脉结扎：用1-1.5％异氟烷麻醉小鼠，然后进行冠状动脉结扎。在手术前施用阿托品(0.75mg/kg，肌肉内地施用)，利多卡因(1mg/kg，肌肉内地施用)，和盐水(1ml，腹膜内地)。使用固定在小鼠嘴上的定制面罩和小动物通气机(Harvard Apparatus，InC.，Holliston，MA)，进行通气。在第4个肋间隙的左胸廓作切口(约5mm)，进行心包切开术，暴露出左心室。在左心耳下大约2mm，使用8-0普罗纶封闭左冠状动脉。随后，逐层关胸，通过注射器抽气，恢复胸内的负压。手术后施用一次丁丙诺啡(0.10mg/kg)以缓解疼痛。相同地进行假操作，不进行冠状动脉结扎。 

抗-MIF抗体：在超声心动图研究中，使用了单克隆的抗-小鼠MIF IgG1抗体(III.D.9，Cytokine PharmaScience，Inc.的赠品)和单克隆的IgG1同种型对照抗体(HB-49，Cytokine PharmaScience，Inc.的赠品)。以前的研究已经证实了体内MI F活性的中和。图21-25显示了在该实施例中得到的结果。图21对比了在只用LAD和抗-MIF+LAD进行LAD结扎后的心脏功能(缩短分数)。图22显示了只用LAD和抗-MIF+LAD，在LAD之前的抗-MIF治疗的效果。图23显示了几个治疗组在LAD后48小时的心脏功能数据。图24显示了用预先的和延迟的抗-MI F治疗，LAD后48小时的血清肌钙蛋白浓度。图25显示了结扎后2周的血清肌钙蛋白I和MIF浓度。 

实施例16 

LPS攻击后，MIF由心肌细胞分泌，并直接介导晚期发作的(＞6小时)心脏功能障碍。在免疫细胞中，最近确定CD74是MIF受体，其能通过ERK1/2胞内信号转导途径发挥作用。为了确定CD74是否能介导败血症中MIF-诱导的心脏功能障碍，我们进行了下述攻击：1)用LPS 攻击野生型小鼠(C57BL/6)；2)用抗-CD74单克隆中和抗体预处理的野生型小鼠；并用LPS攻击，和3)用LPS(4mg/kg)攻击CD74敲除的小鼠。进行连续的超声心动描记术，并确定缩短分数(FS％)。在24小时，与对照(FS％＝58±1％)相比，在施用LPS的野生型小鼠中观察到了显著的功能障碍(FS％＝31.6±3.3％)。在抗-CD74抗体处理的和CD74敲除的用LPS攻击的小鼠中，与单独施用LPS的野生型小鼠相比，心脏功能显著改善(FS％分别是49±3.6％和53.3±2.4％，p＜0.05)。由于从未记载在心脏中表达CD74，我们进行了免疫印迹和组织化学，这证实了CD74组成性地存在于心脏细胞膜上和细胞溶质中；且在LPS攻击后受到实质性调节(在12小时几乎缺乏-＞4倍减少)。图26-30和表达5-7。这些数据首次证实，CD74能在心肌细胞上表达，且是心脏功能障碍的关键介质。 

表5 

凝胶名：CD74系列1(原始1-D图象) 

背景扣除方法：局部 

数据单位：强度(INT) 

实施例17 

冠状动脉结扎：用1-1.5％异氟烷麻醉小鼠，然后进行冠状动脉结扎。在手术前施用阿托品(0.075mg/kg，肌肉内地施用)，利多卡因(1mg/kg，肌肉内地施用)，和盐水(1ml，腹膜内地)。使用固定在小鼠嘴上的定制面罩和小动物通气机(Harvard Apparatus，Inc.，Holliston，MA)，进行通气。在第4个肋间隙的左胸廓作切口(约5mm)，进行心包切开术，暴露出左心室。在左心耳下大约2mm，使用8-0普罗纶封闭左冠状动脉。随后，逐层关胸，通过注射器抽气，恢复胸内的负压。每天以在25微升DMSO中的200mg/kg的剂量，腹膜内地施用(R)-3-(4-羟苯基)-4，5-二氢-5-异 唑啉醋酸甲酯(″ISO-1″，″CPSI-26″或对羟苯酚-异 唑啉甲酯)，进行2周。手术后施用一次丁丙诺啡(0.10mg/kg)用于缓解疼痛。相同地进行假操作，不进行冠状动脉结扎。结果如图31所示。 

缩写：ABC转运蛋白，ATP结合盒转运蛋白；FS％，缩短分数％；IL-10，白介素-1β；IRAK，IL-1受体-相关的激酶-M；LPS，脂多糖；MDA，丙二醛；MIF，(巨噬细胞)迁移抑制因子；Tlr-4，toll-样受体-4；CLP，盲肠结扎和穿刺； 重组人TNFR:Fc(可溶性TNF受体，其能在体内中和TNF活性)的商品名；IL-1β，白介素-1β；TNF-α，肿瘤坏死因子-α；TNFR-/-，TNF-α受体I/受体II敲除的小鼠。 

在本文中(上面和下面)引用的每篇文献的整体都在这里为所有目的引作参考。 

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显然，根据上面的教导，可以对本发明进行许多改进和变化。因此，应当理解，在所附权利要求书的范围内，可以以与在此具体描述不同的方式实现本发明。 

具体地，本申请公开了如下优选的实施方式： 

项目1.药物组合物，其能有效地用于选自下述的至少一项：治疗或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗或预防有此需要的对象中的烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包含： 

有效量的至少一种抗-MIF抗体；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

项目2.项目1的药物组合物，还包含至少一种CD74抑制剂。 

项目3.项目2的药物组合物，其中所述的CD74抑制剂包含至少一种抗-CD74抗体。 

项目4.药物组合物，其能有效地用于选自下述的至少一项：治疗或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗或预防有此需要的对象中的烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包含： 

有效量的至少一种抗-CD74抗体，和 

至少一种药学上可接受的载体。 

项目5.药物组合物，其能有效地用于选自下述的至少一项：治疗或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗或预防有此需要的对象中的烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包含： 

有效量的至少一种抗-TNFR抗体； 

有效量的至少一种抗-MIF抗体；和 

至少一种药学上可接受的载体。 

项目6.治疗或预防对象中的心脏功能障碍的方法，所述的方法包括： 

给所述的对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。 

项目7.项目6的方法，其中所述的心脏功能障碍选自：心肌活性的紊乱，心肌活性的抑制，和其组合。 

项目8.治疗或预防对象中的烧伤伴随的心脏功能障碍的方法，所述的方法包括： 

给所述的对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。 

项目9.项目8的方法，其中所述的烧伤伴随的心脏功能障碍选自：心肌活性的紊乱，心肌活性的抑制，和其组合。 

项目10.治疗或预防对象中的心脏功能障碍的方法，所述的方法包括： 

给所述的对象施用有效量的至少一种抗-CD74抗体。 

项目11.改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，所述的方法包括： 

给所述的对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。 

项目12.用于选自下述的至少一项的方法：治疗或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗或预防有此需要的对象中的烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包括：给有此需要的对象施用有效量的至少一种抗-TNFR抗体；和 

任选地，至少一种药学上可接受的载体。 

项目13.鉴别MIF抑制剂的方法，所述的方法包括： 

将至少一个肌细胞暴露于至少一种MIF； 

检测至少一种MIF-相关的肌细胞活性； 

将所述的肌细胞暴露于所述的MIF和至少一种候选剂； 

检测在有所述候选剂存在的情况下所述MIF-相关的肌细胞活性；和 

检测所述的候选剂是否能影响所述MIF-相关的肌细胞活性。 

项目14.治疗或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方法，该方法包括： 

给所述对象施用有效量的至少一种抗-TNFR抗体和有效量的至少一种抗-MIF抗体。 

项目15.治疗或预防对象中的心脏功能障碍的方法，所述的方法包括： 

给所述的对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。 

项目16.治疗或预防对象中的烧伤伴随的心脏功能障碍的方法，所述的方法包括： 

给所述的对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-MIF抗体 和至少一种药学上可接受的载体。 

项目17.治疗或预防对象中的心脏功能障碍的方法，所述的方法包括： 

给所述的对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-CD74抗体和至少一种药学上可接受的载体。 

项目18.改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，所述的方法包括： 

给所述的对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-MIF抗体和至少一种药学上可接受的载体。 

项目19.治疗或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方法，所述的方法包括： 

给所述的对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-TNFR抗体，至少一种抗-MIF抗体，和至少一种药学上可接受的载体。 

项目20.用于选自下述的至少一项的方法：治疗或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗或预防有此需要的对象中的烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包括给所述的对象施用有效量的至少一种选自下述的试剂：小分子MIF抑制剂，其盐，其前药，和其组合。