假奓包叶提取物及其制备方法和用途

摘要

假奓包叶提取物及其制备方法和用途,由以下6个鞣花酸类化合物组成:Ⅰ.鞣花酸；Ⅱ.3，3＇，4＇-三甲基鞣花酸；Ⅲ.3，3＇-二甲基鞣花酸；Ⅳ.3，3＇4-三甲基鞣花酸-4＇-

说明书

技术领域

本发明涉及天然药物化学技术领域，具体是涉及一种从大戟科假奓包叶属植物假奓包叶（Discocleidion rufescens (Franch.) Pax et Hoffm.-Alchornea rufescens Franch.）全草中提取得到的活性部位提取物，制备工艺及其用途。

 

背景技术

以天然产物研究为基础，同时结合活性筛选从中草药中发现活性良好的先导化合物是创新药物开发的源泉。

假奓包叶（Discocleidion rufescens (Franch.) Pax et Hoffm.-Alchornea rufescens Franch.） 为大戟科（Euphorbiaceae L.）假奓包叶属（Discocleidion (Muell.-Arg.) Pax et Hoffm.）植物。假奓包叶属共有三种，分布于我国和琉球群岛，我国有Discocleidion rufescens (Franch.) Pax et Hoffm.一种，产于中部和西南部；该植物为乔木或灌木，生于路旁及干燥乱石滩中。根皮入药，具有清热解毒，泻水消积的功效，用于治疗水肿，食积和毒疮。

对假奓包叶化学成分的研究目前主要是通过柱层析色谱法，自假奓包叶中分离得到单体化合物，并通过光谱法确定所分得化合物的结构。采用柱层析进行了单体化合物的分离，并运用波谱学方法对所分得的化合物进行了结构鉴定。自假奓包叶地上部分分得7个化合物，通过光谱解析鉴定了其结构。分别为：鞣花酸类衍生物6个，为鞣花酸（Ellagic acid），3，3＇，4＇-三甲基鞣花酸 （3，3＇，4＇-trimethylellagic acid），3，3＇-二甲基鞣花酸 （3，3＇-di-O-methyl ellagic acid），3，3＇4-三甲基鞣花酸-4＇-O-β-D-葡萄糖苷（3，3＇，4-tri-O-methylellagic acid-4＇- O-β-D-glucopyranoside），3，3＇-二甲基鞣花酸-4＇-O-β-D-葡萄糖苷（3，3＇-di-O-methylellagic acid-4＇- O-β-D-glucopyranoside）；3，3＇-二甲基鞣花酸-4＇-O-β-D-木糖苷（3，3＇-di-O-methylellagic acid-4＇- O-β-D-xylopyranoside）；黄酮类化合物10个，分别为木樨草素（Luteolin），洋芹素（Apigenin），木樨草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（Luteolin-7-O-β-D-glucoside），木樨草素-7-O-新橙皮苷（Luteolin-7-O-neohesperidoside），Amentoflavone，洋芹素-4＇-O-β-D-葡萄糖苷 （Apigenin-4＇-O-β-D- glucoside），洋芹素-7-O-β-D-葡萄糖苷 （Apigenin-7-O-β-D- glucoside），洋芹素-7-O-新橙皮苷（Apigenin-7-O -neohesperidoside），槲皮素（Quercetin），5，7-二羟基-4＇-甲氧基黄酮（5，7-dihydroxy-4＇-methoxyflavone）；三萜类化合物3个，分别为无羁萜酮 （Fridelin），表无羁萜酮 （Epifriedelinol），蒲公英赛醇 （Taraxerol）；甾体类化合物3个，为胡萝卜苷（Daucosterol），豆甾醇（Stigmasterol），β-谷甾醇（β-Stitosterol）。香豆素化合物3个，为东莨菪内酯（Scopolin），伞形花内酯（Umbelliferon）；东莨菪苷（Scopolin）；对苯醌类化合物1个，为2，5-二甲酯基对苯醌（Dimethyl benzoquinone-2, 5 –dicarboxylate）；苯酚类化合物1个，为2-羟基苯甲酸（2-Hydroxybenzoic acid）；吡啶酮生物碱化合物1个，为蓖麻碱（ricinine）；酚酸类化合物5个，分别为香豆酸（p-Coumaricacid），阿魏酸（Ferulic acid），原儿茶酸（Vanillic acid），丹皮酚（Paeonol），没食子酸（Gallic acid）；其他类化合物2个，为脱镁叶绿素a（Pheophytin a）；13²S-羟基脱镁叶绿素a（13²S- hydroxypheophytin a）。

赵敏等筛选了该植物抗菌活性部位的最佳提取工艺[假奓包叶抗菌活性部位提取工艺研究，时珍国医国药，2009，20（9）：2339-2340]。但目前未见对该植物治疗老年痴呆症有效部位进行分离的报道。

 

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种从大戟科假奓包叶属植物假奓包叶（Discocleidion rufescens (Franch.) Pax et Hoffm.-Alchornea rufescens Franch.）全草中提取得到的活性部位提取物，以及制备工艺和用途。

技术方案：一种假奓包叶的提取物，由以下6个鞣花酸类化合物组成: Ⅰ. 鞣花酸；Ⅱ. 3，3＇，4＇-三甲基鞣花酸；Ⅲ. 3，3＇-二甲基鞣花酸；Ⅳ. 3，3＇4-三甲基鞣花酸-4＇-O-β-D-葡萄糖苷；Ⅴ. 3，3＇-二甲基鞣花酸-4＇-O-β-D-葡萄糖苷；Ⅵ. 3，3＇-二甲基鞣花酸-4＇-O-β-D-木糖苷。

上述假奓包叶提取物在制备抗老年痴呆药物中的应用。

一种制备假奓包叶提取物的方法，步骤为：称取假奓包叶全草为原料，晾干、粉碎，用体积百分浓度为70~95%的乙醇溶液提取3次，各次所用乙醇溶液的质量依次为假奓包叶全草原料质量的10倍、8倍和8倍，每次提取2小时，将三次的提取液用纱布过滤后合并；将上述合并后的提取液在低于80℃的温度下，减压浓缩回收乙醇至无醇味，得乙醇提取物；将上述乙醇提取物用蒸馏水稀释至密度为1.10-1.20 g/cm³，依次用沸程60-90℃的分析纯石油醚萃取5次、分析纯乙酸乙酯萃取5次、分析纯水饱和正丁醇萃取3次，然后分别将石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和水饱和正丁醇萃取液在低于80℃温度下进行减压浓缩，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物;将上述石油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取物后的水溶液部分，减压浓缩回收有机溶剂至无溶剂味，得到活性部位提取物。所得活性部位提取物在制备抗老年痴呆药物中的应用。

有益效果：本发明提供了一种从大戟科假奓包叶属植物假奓包叶（Discocleidion rufescens (Franch.) Pax et Hoffm.-Alchornea rufescens Franch.）全草中提取得到的活性部位提取物及其制备方法，该提取物可用于制备抗老年痴呆的作用的药物。

 

具体实施方式

 

实施例1：

假奓包叶全草（10.0Kg），晾干，粉碎后分别用95%药用级乙醇10倍量、8倍量、8倍量提取3次，每次2小时，提取液纱布过滤，合并三次提取液；低温（<80℃）减压回收乙醇至无醇味，得乙醇提取物；乙醇提取物用蒸馏水混悬，依次用石油醚5000mL×5次、乙酸乙酯4000mL×5次、水饱和的正丁醇5000mL×3次萃取；将上述石油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取物后的水溶液部分，减压低温（<80℃）浓缩回收有机溶剂至无溶剂味，得到活性部位提取物1.5Kg 。分别取95%乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、活性部位提取物分别进行神经细胞活性筛选，结果表明95%乙醇提取物、活性部位提取物均有很强的NGF诱导活性。

 

实施例2：活性部位的结构鉴定

假奓包叶的活性部位100g，以硅胶（0.063-0.200mm，250g）拌样，上硅胶柱（0.060-0.200mm）色谱分离，以二氯甲烷-甲醇-水（100∶0：0—100∶30：10）梯度洗脱，每200mL为一流份，共等到100部分；二氯甲烷-甲醇-水（100∶10：2）部分经硅胶柱（0.040-0.063mm）、ODS和Sephadex LH-20柱色谱分离，分得化合物Ⅰ（25mg），Ⅱ（30mg）；二氯甲烷-甲醇-水（100∶10：100）部分经硅胶柱（0.040-0.063mm）和、ODS柱色谱分离，分得化合物Ⅲ（30mg）；二氯甲烷-甲醇-水（100∶20：5）部分经硅胶（0.040-0.063mm）、ODS反复柱层析分离，分得化合物Ⅳ（25mg），Ⅴ（30mg），Ⅵ（25mg）。

通过光谱解析鉴定了化合物Ⅰ~化合物Ⅵ结构，分别为：Ⅰ. 鞣花酸；Ⅱ. 3，3＇，4＇-三甲基鞣花酸；Ⅲ. 3，3＇-二甲基鞣花酸；Ⅳ. 3，3＇4-三甲基鞣花酸-4＇-O-β-D-葡萄糖苷；Ⅴ. 3，3＇-二甲基鞣花酸-4＇-O-β-D-葡萄糖苷；Ⅵ. 3，3＇-二甲基鞣花酸-4＇-O-β-D-木糖苷。波谱数据如下：

表 1   ¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆, δ ppm) 化合物 Ⅰ～Ⅵ 数据

CⅠⅡⅢⅣⅤⅥ5-H7.137.497.507.647.547.505＇-H7.467.567.507.837.817.723-OMe 4.024.034.044.044.043＇-OMe 4.044.034.094.084.084-OMe   4.00  4＇-OMe 3.98    OH10.7810.8010.72 10.8510.85

表 2   ¹³C-NMR (100MHz，DMSO-d₆, δ ppm) 化合物 Ⅰ～Ⅵ 的数据

CⅠⅡⅢⅣⅤⅥ1, 1＇107.5110.9, 112.2112.0111.8,112.7111.0,114.0111.1,114.32, 2＇139.3141.2,140.5158.3140.7,141. 5140.7,141.4140.9,141.63, 3＇130.7139.9, 140.7111.6141.0140.0,141.5 140.1,141.9 4, 4＇148.5152.3, 153.5140.1151.7,154.1151.3,152.6151.3,152.65, 5＇110.0111.5,107.3152.0112.2,107.4111.4,111.8111.5,111.96, 6＇112.2111.7, 113.1111.3112.5,113.5111.7, 112.7111.9, 112.97, 7＇158.8158.0,158.2141.1157.9,158.1158.1,158.2158.2,158.33-OMe 60.960.961.361.061.03＇-OMe 61.260.961.661.661.64-OMe   56.7  4＇-OMe 56.6    糖  1＇＇   101.2101.2101.9    2＇＇   73.273.273.0    3＇＇   77.277.276.1    4＇＇   69.469.469.4    5＇＇   76.476.466.0    6＇＇   60.560.5 

实施例3：活性部位的抗老年痴呆作用的初步研究数据

分别取分别取95%乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、活性部位提取物进行神经细胞活性筛选，结果表明95%乙醇提取物、活性部位提取物均有很强的NGF诱导活性。

1、原理和方法

运用神经细胞体外模型试验，利用PC-12细胞，检测各部位的NGF诱导活性。

（1）PC 12 细胞  大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化的细胞株，它具有神经内分泌细胞的一般特征，现以广泛应用于神经生理及神经药理研究。

当用很低浓度的NGF培养PC 12 细胞，能被诱导分化成NGF依赖型的多巴胺能神经元。

（2）LDH ( Lactic dehydrogenase, 乳酸脱氢酶)   用于检测样品的细胞毒性。LDH在细胞培养液中含量越高，说明样品的细胞毒性越大。

（3）MTT法   采用此法测定各样品对PC 12 细胞的生长抑制作用，DMSO做空白对照。

（4）Tark A NGF的受体。 Tark B Brain-derived neurotrophic factor ( BDNF，与NGF有联系的神经营养因子)的受体。

表达Tark A的纤维原细胞（Fibroblast）只能靠NGF生存；表达Tark B的纤维原细胞（Fibroblast）只能靠BDNF生存。用样品代替NGF或BDNF培养细胞，细胞的存活率越高，证明样品的活性越高，即具有NGF诱导活性。

2、实验结果

 注：LDH为乳酸脱氢酶；Trk A在成纤维细胞依赖神经生长因子NGF存活的ED50值为25ng·mL^-1，Trk B在成纤维细胞依赖BDNF存活的ED50值为10ng·mL^-1；实验以DMSO为空白对照。

实施例4：黄酮类活性部位AD大鼠的初步药效学研究

1、材料与方法

1.1 动物：雄性SD大鼠，体重250±20g，由南京中医药大学实验动物中心提供。

1.2 药物制备：见实施例1，1.0g相当于100g原药材；阳性对照药都可喜，由法国施维雅研制（天津），批号868159（生产日期20080730）。

1.3 试剂：Aβ1～40购自Sigma公司，批号151-003-pc05。

1.4 分组：SD大鼠50只，随机分成正常组、模型组、阳性对照组、治疗Ⅰ组（假奓包叶活性部位1.0g·Kg^-1·d^-1）、治疗Ⅱ组（假奓包叶活性部位2.0g·Kg^-1·d^-1），每组10只。

1.5 造模方法：取模型组、阳性对照组、治疗Ⅰ组（假奓包叶活性部位1.5g·Kg^-1·d^-1）、治疗Ⅱ组（假奓包叶活性部位3.0g·Kg^-1·d^-1）造模。具体方法：各组大鼠给予3%戊巴比妥钠30mg·Kg^-1腹腔注射麻醉后，将鼠头固定于立体定位仪上保持前后囱在同一水平，剪开头皮，暴露前囱，按大鼠脑立体定位图谱进行定位，在前囱点后方1.2mm，中线旁开2.0mm，用牙科钻钻一小孔，垂直插入一小塑料管，深度为4.0mm（达侧脑室），将小管固定于大鼠头顶骨，局部撒复方新诺明药粉防止感染，缝合头皮，术后每天肌肉注射青霉素40万U/只。其中，造模组每天侧脑室内给予Aβ1～40，2μg/只，连续14d；末次注射后7d，即实验第21天，对50只大鼠进行学习记忆能力测试，以评价造模是否成功。

1.6 给药方法：造模成功后开始给药。治疗Ⅰ组、Ⅱ组分别每天给予大鼠假奓包叶水溶液1.5，3.0g·Kg^-1灌胃，正常组、模型组均给予等容量生理盐水灌胃；阳性对照组以都可喜混悬液每天100μg·g^-1灌胃，连续28d。

1.7 学习记忆能力测试：所有大鼠均在实验的第21，49d，以水迷宫实验中的平均逃避潜伏期（从起点至寻找到终点平台逃生所需时间）的长短以及进入盲端错误次数来进行各组大鼠学习和记忆能力的评价。第21d评价造模是否成功，第49 d评价各种施加因素对学习记忆能力的影响。

1.8 统计学处理：实验数据经SAS8.0统计软件包处理，分别采用t检验和q检验。

2、结果

2.1 各组大鼠学习记忆能力比较

注：* p<0.05，** p<0.01，与模型组比较。

 

注：* p<0.05，* *p<0.01，与模型组比较。

2.2 结论

表1，2显示，给予Aβ1～40注射造模的各组大鼠平均逃避潜伏期和进入盲端错误次数增加，与正常组比较，有显著统计学意义（p<0.01）；治疗结束后，治疗组大鼠平均逃避潜伏期和进入盲端错误次数均明显低于模型组，且与模型组相比，存在显著性统计学意义，提示假奓包叶活性部位能明显改善AD大鼠的学习记忆能力。