双特异性抗体和与治疗或诊断剂缀合的地高辛配基的复合物

摘要

本发明涉及a)针对靶蛋白的双特异性抗体和抗体片段和b)与治疗或诊断剂缀合的地高辛配基的复合物，其生产方法，其作为治疗或诊断剂的递送平台的用途，包含所述抗体的药物组合物及其用途。

说明书

发明领域

本发明涉及a)针对靶蛋白的双特异性抗体和抗体片段和b)与治疗或 诊断剂缀合的地高辛配基(digoxigenin)的复合物，其生产方法，其作为 治疗或诊断剂的递送平台的用途，包含所述抗体的药物组合物及其用途。

发明背景

分子医学需要与靶细胞特异性和有效相互作用的试剂。在药物开发中， 将功能性治疗或诊断剂有效体内递送至靶组织或细胞仍然是最大的障碍之 一。一种方法是将有效负载(payload)连接至特异性靶向细胞的递送载体， 例如连接至抗体。必须以良好的稳定性连接有效负载，以确保特异性靶向 和避免有效负载的非特异性全身释放。然而，为了能够进入细胞，理想地 在靶细胞上或靶细胞内释放有效负载。在缀合物开发中，在循环中的良好 稳定性与在靶上的有效释放的结合是主要的瓶颈。大多数现有技术水平的 缀合物不是由一种确定的分子类型组成，而是在不同位置连接不同量的有 效负载的分子混合物。这些缀合物的主要缺点是，需要针对每种抗体和每 种有效负载制定缀合程序；因此不能容易的交换有效负载，而且共价键可 能引起免疫原性。

最近，开发了很多重组抗体类型，例如，通过融合例如IgG抗体类型 和单链结构域得到的四价双特异性抗体(见例如Coloma，M.J.，等人， Nature Biotech 15(1997)159-163；WO 2001/077342；和Morrison，S.L.， Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。也开发了一些其它的新类型， 其中不再保留抗体的核心结构(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)，例如能够结 合两个或多个抗原的双抗体、三抗体或四抗体、微型抗体(minibody)和 一些单链类型(scFv，Bis-scFv)(Holliger P，等人，Nature Biotech 23 (2005)1126-1136；Fischer N.，Léger O.，Pathobiology 74(2007)3-14； Shen J，等人，Journal of Immunological Methods 318(2007)65-74；Wu， C.等人，Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。

双特异性抗体能够同时结合2种不同的靶，并因此也能够递送多种有 效负载至靶组织或细胞。迄今为止，已经描述了特异性针对某些细胞靶的 双特异性抗体。然而此方法具有一个主要的缺点，即其需要针对希望用于 诊断和治疗用途的每一种试剂产生抗体。

US 7’429’381公开了两步预靶向法，其中首先对细胞施用特异性针 对HSG半抗原和细胞表面蛋白质的双特异性抗体，然后将其用于捕获螯合 了治疗或诊断阳离子或治疗或诊断剂的HSG半抗原。HSG半抗原是小分子， 例如杀虫剂、药物、激素和毒素，其通常是没有免疫原性的，除非连接了 某些大分子，例如蛋白质。然而，在两步预靶向法中使用双特异性抗-HSG 半抗原抗体具有一些限制。

主要的缺点是方法的复杂性，其包括2种单独试剂的制备和给药，及随 后的时间选择和比例问题。另外，不可能分析得到的双特异性抗体和治疗 或诊断剂的复合物。因此难以预测药理学性能、化学计量和由双特异性抗 体捕获的治疗或诊断剂的可能的降解产物。

另外，目前使用的缀合物不能应用于大多数治疗剂，因为缀合经常导 致减少或消除的治疗剂活性或导致抗体结合能力的不希望的改变。

因此，需要治疗和诊断剂的非常确定、有效和特异性的递送平台，其 能够在靶上有效释放有效负载并可被广泛应用。

发明概述

本发明涉及以下二者的复合物

a)特异性针对地高辛配基和靶蛋白的双特异性抗体，其包含结合地高 辛配基的第一抗原结合位点和结合靶蛋白的第二抗原结合位点，和

b)地高辛配基，其中地高辛配基与选自肽、小化合物、放射性标记的 小化合物和成像试剂的治疗或诊断剂缀合。

在一个实施方案中，双特异性抗体的特征包含

a)由2条全长抗体重链和2条全长抗体轻链组成的单特异性二价抗体， 其中每条链仅包含一个可变结构域，

b)2个肽接头，

c)2种单特异性单价单链抗体，每种抗体由抗体重链可变结构域、抗 体轻链可变结构域、和在所述抗体重链可变结构域和所述抗体轻链可变结 构域之间的单链接头组成；

在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于，所述特异性结合DIG 的抗原结合位点包含SEQ ID NO.3，具有S49A、I57A和A60P突变的SEQ ID  NO.3、或SEQ ID NO.2作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 5或SEQ. ID NO.1作为轻链可变结构域。

在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于，所述特异性结合DIG 的抗原结合位点包含SEQ.ID NO.4或SEQ.ID NO.36作为重链Fd片段 (V_H和CH₁)，和包含SEQ.ID NO.6作为L链。

在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于，抗体是人源化的。

在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于，靶蛋白是细胞表面抗 原。优选地，细胞表面抗原是肿瘤抗原。在一个实施方案中，靶蛋白是Her2。 在一个实施方案中，靶蛋白是IGF1R。在一个实施方案中，靶蛋白是CD22。

在一个实施方案中，复合物的特征在于，治疗或诊断剂是肽。

在一个实施方案中，复合物的特征在于，治疗或诊断剂是小化合物。

在一个实施方案中，复合物的特征在于，小化合物是放射性标记的。

在一个实施方案中，复合物的特征在于，治疗或诊断剂是成像试剂。

本发明的另一个实施方案是，根据本发明的复合物在递送治疗或诊断 剂至靶细胞或组织中的用途。

本发明的另一个实施方案是，根据本发明的复合物在靶向癌症治疗中 的用途。

本发明的另一个实施方案是，根据本发明的复合物在靶向放射疗法中 的用途。

本发明的另一个实施方案是，用于靶向癌症治疗的权利要求1-14中任 一项的复合物。

本发明的另一个实施方案是，用于靶向放射疗法的权利要求1-14中任 一项的复合物。

本发明的另一个实施方案是，权利要求1-14中任一项的复合物在制造 用于靶向癌症治疗的药物中的用途。

本发明的另一个实施方案是，权利要求1-14中任一项的复合物在制造 用于靶向放射疗法的药物中的用途。

本发明的另一个实施方案是，根据本发明用于细胞或组织成像的用途。

本发明的另一个实施方案是包含根据本发明的复合物的组合物。在一 个实施方案中，组合物是诊断组合物。在一个实施方案中，组合物是药物 组合物。

本发明的另一个实施方案是，药物组合物在靶向癌症治疗中的用途。

本发明的另一个实施方案是，药物组合物在靶向放射疗法中的用途。

发明详述

本发明提供了制备双特异性抗体或抗体片段的方法，以及使用它们的 方法，特别是它们作为治疗和诊断剂的递送平台的用途，以及包含所述抗 体的药物组合物和诊断工具。

优选的实施方案包括针对靶蛋白和地高辛配基的双特异性抗体或抗体 片段，其包含结合地高辛配基(称为“Dig”或“DIG”)的第一抗原结合位 点和结合靶蛋白的第二抗原结合位点。将双特异性抗体或抗体片段的所述 结合位点分别称为“<靶蛋白>”(或简称“<靶>”)和“<Dig>”。

此外，本发明涉及包含结合地高辛配基的第一抗原结合位点和结合靶 蛋白的第二抗原结合位点的单克隆双特异性抗体和抗体片段，编码这样的 抗体和抗体片段的DNA，和表达DNA的载体。优选地，所述双特异性抗体 是人源化和嵌合抗体。

本发明的一个实施方案是结合地高辛配基和靶蛋白的双特异性抗体， 其包含结合地高辛配基的第一抗原结合位点和结合靶蛋白的第二抗原结合 位点，其包含

a)由2条全长抗体重链和2条全长抗体轻链组成的单特异性二价抗体， 其中每条链仅包含一个可变结构域，

b)2个肽接头，

c)2种单特异性单价单链抗体，每种抗体由抗体重链可变结构域、抗 体轻链可变结构域、和在所述抗体重链可变结构域和所述抗体轻链可变结 构域之间的单链接头组成；

优选地，所述单链抗体与单特异性二价抗体重链的相同末端(C-和N- 末端)，或可选地与单特异性二价抗体轻链的相同末端(优选C-末端)连 接，更优选地与单特异性二价抗体重链的相同末端(C-和N-末端)连接。

在一个实施方案中，a)中的所述单特异性双价亲本抗体是人抗体，优 选重组人抗体。

优选地，b)中的所述肽接头是具有至少10个氨基酸长度的氨基酸序 列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝 氨酸，(x＝3和n＝3，4，5或6)或(x＝4和n＝2，3，4或5)，优选x ＝4和n＝2或3，更优选x＝4，n＝2。

优选地，c)中的所述单链接头是具有至少15个氨基酸长度，更优选 至少20个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述单链接 头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3和n＝4，5或6)或(x＝ 4和n＝3，4或5)，优选x＝4和n＝4或5，更优选x＝4，n＝4。

优选地，c)中的所述2种单特异性单价单链抗体包含抗体重链可变结 构域SEQ ID NO.3，具有S49A、I57A和A60P突变的SEQ ID NO.3，或 SEQ ID NO.2，抗体轻链可变结构域SEQ ID NO 5或SEQ.ID NO.1，和 在所述抗体重链可变结构域和所述抗体轻链可变结构域之间的单链接头。 优选地，c)中的所述2种单特异性单价单链抗体包含SEQ.ID NO.4或 SEQ.ID NO.36作为重链Fd片段(V_H和CH₁)，和包含SEQ.ID NO.6作为 L链。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于， 所述特异性结合DIG的抗原结合位点包含SEQ ID NO.3，具有S49A，I57A 和A60P突变的SEQ ID NO.3、或SEQ ID NO.2作为重链可变结构域，和 包含SEQ ID NO 5或SEQ.ID NO.1作为轻链可变结构域。在另一个实施 方案中，所述特异性结合DI G的抗原结合位点包含SEQ.ID NO.4或SEQ. ID NO.36作为重链Fd片段(V_H和CH₁)，和包含SEQ.ID NO.6作为L链。

如本文使用的，术语“突变”指在根据本发明的抗体的CDR和/或可变 区中的一个或多个氨基酸取代。术语“具有S49A，I57A和A60P突变”涉 及在SEQ ID NO.3的重链可变结构域中的3个取代(根据Kabat编号)。

此外，所述单链抗体优选地是二硫化物稳定的。通过在单链抗体的可 变结构域之间引入二硫键实现这样进一步的单链抗体的二硫化物稳定，并 在例如WO 94/029350，Rajagopal，V.，等人，Prot.Engin.Vol.10(12) 1453-59(1997)；Kobayashi，H.，等人，Nuclear Medicine & Biology，Vol. 25，387-393(1998)；或Schmidt，M.，等人，Oncogene 18，1711-1721 (1999)中描述。

在另一个实施方案中，发明的抗体包含人源化的地高辛配基结合模块， 其包含至少一个能够结合地高辛配基的单链可变片段(scFv)。所述scFv 优选地包含通过接头连在一起的一条人源化V_L和一条人源化V_H链。在另一 个实施方案中，所述抗体还包含由2条重链组成的Fc区，所述重链提供2 或3个恒定结构域。

在优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含基于与靶蛋白结合 的全长抗体的结构，通过肽接头将2个(任选地二硫化物稳定的)结合地 高辛配基的单链可变片段(scFv)与其连接。在另一个实施方案中，所述 抗体包含具有2个地高辛配基结合位点的人源化IgG。

可以多种形式将地高辛配基结合模块连接至细胞靶向实体。例如，为 此不仅可应用“经典的”抗体片段和抗体衍生模块，例如Fab或Fv，而且 可应用以前在文献中已描述的单结构域的类似抗体的实体。除了与H链的 C末端融合以外，如在实施例中描述的其他形式也是本发明的一部分。

在本发明的一个实施方案中，所述靶蛋白是细胞表面或细胞内抗原， 优选地所述靶蛋白是细胞表面或细胞内的肿瘤相关抗原。

在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含结合地高辛配基的 第一抗原结合位点和结合Her2的第二抗原结合位点。优选地，所述特异性 结合Her2和地高辛配基的双特异性抗体包含SEQ.ID NO.7或SEQ.ID NO. 8的重链，和SEQ.ID NO.9的轻链。

在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含结合地高辛配基的 第一抗原结合位点和结合IGF1R的第二抗原结合位点。优选地，所述特异 性结合IGF1R和地高辛配基的双特异性抗体包含SEQ.ID NO.10或SEQ.ID  NO.11的重链，和SEQ.ID NO.12的轻链。

在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含结合地高辛配基的 第一抗原结合位点和结合CD22的第二抗原结合位点。优选地，所述特异性 结合CD22和地高辛配基的双特异性抗体包含SEQ.ID NO.13的重链，和 SEQ.ID NO.14的轻链。优选地，所述特异性结合CD22和地高辛配基的 双特异性抗体包含SEQ.ID NO.13或55的重链，和SEQ.ID NO.14或 56的轻链。

在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含结合地高辛配基的 第一抗原结合位点和结合CD33的第二抗原结合位点。优选地，所述特异性 结合CD33和地高辛配基的双特异性抗体包含SEQ.ID NO.59的重链，和 SEQ.ID NO.60的轻链。

在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含结合地高辛配基的 第一抗原结合位点和结合VEGFR1的第二抗原结合位点。优选地，所述特异 性结合VEGFR1和地高辛配基的双特异性抗体包含SEQ.ID NO.51的重链， 和SEQ.ID NO.52的轻链。

在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含结合地高辛配基的 第一抗原结合位点和结合Her2(Lieberman)的第二抗原结合位点。优选地， 所述特异性结合Her2(Lieberman)和地高辛配基的双特异性抗体包含SEQ. ID NO.53的重链，和SEQ.ID NO.54的轻链。

在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含结合地高辛配基的 第一抗原结合位点和结合LeY的第二抗原结合位点。优选地，所述特异性 结合LeY和地高辛配基的双特异性抗体包含SEQ.ID NO.57的重链，和 SEQ.ID NO.58的轻链。

在本发明的一个优选的实施方案中，使用所述双特异性抗体作为治疗 或诊断剂的有效负载递送载体。治疗或诊断剂与地高辛配基缀合，从而通 过本发明的双特异性抗体的抗原结合位点连接以形成根据本发明的复合 物。此复合物是确定和稳定的，并特异性递送有效负载至靶细胞或组织。 由于地高辛配基化的治疗或诊断剂以非共价的方式与双特异性抗体连接， 有效负载在循环时稳定地与其递送载体结合，而且在内化后能被有效释放。 地高辛配基的缀合不影响大多数治疗或诊断剂的活性。双特异性抗体没有 包含异常的共价附加物并因此排除了任何免疫原性风险。因此，此简单的 缀合程序可用于多种有效负载分子与仅一种抗体的组合；例如肽、蛋白质、 小分子、成像试剂和核酸，如在以下特定实施方案和实施例的描述中详细 说明的。地高辛配基化的诊断或治疗剂与包含Dig结合模块的双特异性抗 体衍生物的复合物可赋予诊断或治疗剂(例如诊断或治疗蛋白质、肽或小 分子)良好的生物物理行为和改进的PK参数。此外，这样的复合物能够将 递送的载荷靶向展示双特异性抗体变体识别的抗原的细胞。

使用通常使用的特异性针对地高辛配基的诊断剂，可在患者中容易地 监控地高辛配基化的治疗或诊断有效负载分子的命运，例如使用如用于检 测地高辛配基和地高辛配基过量治疗的Tina定量地高辛配基法的测定 (Roche/Hitachi，No.12218623001和US#7100001)。通过临床认可的多 克隆抗地高辛配基抗体(例如在上述测定中包含这样的抗体)，可清除游 离的地高辛配基或与双特异性抗体连接的过量的地高辛配基化的治疗或诊 断有效负载分子。

在一个实施方案中，在有效负载的细胞特异性递送之后在体内再次装 载双特异性抗体。

在优选的实施方案中，双特异性抗体包含特异性针对地高辛配基的第 一抗原结合位点和特异性结合细胞表面或细胞内肿瘤相关抗原的第二抗原 结合位点。因此，负载治疗或诊断剂的双特异性抗体被特异性递送至靶细 胞或组织，优选递送至肿瘤。

双特异性抗体作为靶向细胞/组织的特异性递送平台的上述用途可用 于多种不同的有效负载，特别是下面详细说明的有效负载。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体被用作治疗和/或诊断肽或蛋白 质的有效负载递送载体。肽或蛋白质有效负载的连接可增强抗体的治疗效 力，例如在癌症治疗中的毒素缀合物。治疗和/或诊断肽或蛋白质与地高辛 配基缀合，并因此通过抗体-半抗原相互作用连接至上述双特异性抗体。此 确定和稳定的复合物特异性递送肽或蛋白质有效负载至靶细胞或组织，然 后肽或蛋白质有效负载在靶细胞内释放。

在一个优选的实施方案中，地高辛配基化肽或蛋白质与下述双特异性 抗体连接，其具有特异性针对地高辛配基的第一抗原结合位点和特异性针 对靶蛋白，优选细胞表面抗原或细胞内抗原的第二抗原结合位点，优选地 所述细胞表面或细胞内抗原是肿瘤相关抗原。在一个优选的实施方案中， 这些复合物由一种人源化的<靶蛋白>-<Dig>IgG组成，在其两个高亲和力 Dig结合位点上结合两个地高辛配基化肽(每个位点结合一个)。尽管被 地高辛配基化以及与抗体复合，所述肽保留良好的生物学活性。此外，本 发明的双特异性抗体的特异性和活性不受地高辛配基化肽的连接的影响。 在复合的地高辛配基化肽的存在下，双特异性抗体衍生物的细胞表面靶结 合位点保留其结合特异性和亲和力。优选地，所述靶蛋白是Her 2。在另 一个优选的实施方案中，所述靶蛋白是IGFR1。在另一个优选的实施方案 中，所述靶蛋白是CD22。

在地高辛配基化肽或蛋白质与本发明的双特异性抗体结合后，所述肽 或蛋白质保留其完整的生物学活性。令人惊讶地发现，本发明的重组人源 化双特异性抗体和抗体片段改进了治疗肽的PK和稳定性。

优选的地高辛配基化肽的非限制性实例是Dig-蜂毒素(Mellitin)， Dig-Fam5B，Dig-INF7，Dig-FallV1和DigFallV2。

在本发明的一个方面，双特异性抗体用于递送细胞毒性肽至表达抗原 的肿瘤细胞。因此本发明为靶向癌症治疗提供了特异性递送平台。

在一个优选的实施方案中，双特异性抗体被用作治疗或诊断小分子的 有效负载递送载体。在一个优选的实施方案中，这些复合物由一种人源化 的<靶蛋白>-<Dig>IgG组成，在其两个高亲和力Dig结合位点上结合两个 地高辛配基化化合物(每个位点结合一个)。尽管被地高辛配基化以及与 抗体复合，所述化合物保留生物学活性。在复合的Dig-化合物的存在下， 双特异性抗体衍生物的细胞表面靶结合位点保留其结合特异性和亲和力。

在一个优选的实施方案中，地高辛配基化小分子与双特异性<靶蛋白 >-<Dig>抗体衍生物连接。因此产生确定和稳定的分子复合物，其在靶细胞 内释放有效负载。

在一个优选的实施方案中，所述小分子是地高辛配基化的且与下述双 特异性抗体连接，其包含结合地高辛配基的第一抗原结合位点和结合靶蛋 白的第二抗原结合位点。优选地，所述靶蛋白是肿瘤细胞标记物。在一个 优选的实施方案中，所述靶蛋白是Her2。在另一个优选的实施方案中，所 述靶蛋白是IGFR1。在另一个优选的实施方案中，所述靶蛋白是CD22。

在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体被用作地高辛配基化的 细胞毒性分子的有效负载递送载体。优选地，所述细胞毒性分子因此被特 异性递送至表达抗原的肿瘤细胞。因此本发明为靶向癌症治疗提供了特异 性递送平台。

在一个优选的实施方案中，双特异性抗体被用作地高辛配基化的放射 性同位素或与地高辛配基化小分子连接的放射性同位素的有效负载递送。 因此本发明为放射疗法提供了特异性递送平台。地高辛配基化的放射性同 位素或与地高辛配基化小分子连接的放射性同位素显示了有效的组织渗 透、快速清除，并仅在由<靶>-<Dig>双特异性抗体覆盖的细胞(靶组织/ 肿瘤)上保留。这能够特异性靶向并避免治疗放射性同位素的全身性非特 异性释放。在一个优选的实施方案中，用地高辛配基化的放射性同位素或 与地高辛配基化小分子连接的放射性同位素在体内“再次装载”与靶细胞 或组织结合的双特异性抗体。在一个优选的实施方案中，本发明的双特异 性抗体用于递送地高辛配基化的放射性同位素或与地高辛配基化小分子连 接的放射性同位素至患病组织。优选地，所述患病组织是肿瘤。

在一个优选的实施方案中，双特异性抗体被用作成像试剂的有效负载 递送载体。用于成像，良好的信号背景比是理想的，这需要良好的组织渗 透以及良好的组织靶向。抗体显示了良好的稳定性和良好的靶向，但只有 中等的组织渗透。这些缺点现在被克服了。

在一个优选的实施方案中，地高辛配基化的荧光底物和含有重组Dig 结合模块的双特异性抗体衍生物的复合物用于携带靶抗原的组织或细胞的 特异性成像。在优选的实施方案中，这些组织或细胞在体内成像。这些复 合物由一种人源化的<靶>-<Dig>IgG组成，在其两个高亲和力Dig结合位 点上结合两个地高辛配基化底物(每个位点结合一个)，所述底物可通过 成像技术显像。在一个优选的实施方案中，成像化合物是荧光体。在另一 个优选的实施方案中，所述成像化合物是放射性标记的化合物。尽管被地 高辛配基化以及与抗体复合，成像化合物保留其性能。在一个优选的实施 方案中，所述成像化合物是Cy5。在复合的Dig-化合物的存在下，双特异 性抗体衍生物的细胞表面靶结合位点保留其结合特异性和亲和力。在一个 优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含结合地高辛配基的第一抗原结 合位点和结合靶蛋白的第二抗原结合位点。优选地，所述靶蛋白是肿瘤细 胞标记物。在一个优选的实施方案中，所述靶蛋白是Her2。在另一个优选 的实施方案中，所述靶蛋白是IGFR1。在另一个优选的实施方案中，所述 靶蛋白是CD22。

地高辛配基化成像化合物显示了有效的组织渗透、快速清除，并仅在 由<靶>-<Dig>双特异性抗体覆盖的细胞(靶组织/肿瘤)上保留。这能够进 行有效的时间解析的成像，和评估肿瘤血管生成或肿瘤血管生成中的变化。 在一个优选的实施方案中，用地高辛配基化的染料在体内“再次装载”与 靶细胞或组织结合的双特异性抗体。在一个优选的实施方案中，本发明的 双特异性抗体用于患病组织的成像。优选地，所述患病组织是肿瘤。

本发明的另一个方面是特异性靶向和递送核酸至和进入靶组织和靶细 胞，这是目前的技术未能良好解决的一个主要瓶颈。迄今为止描述的大多 数核酸递送实体不是由单一的确定分子组成，而是由分子或微粒的混合物 组成。然而，在治疗应用中需要同质的确定实体。在一些实例中显示了抗 体或抗体片段介导的核酸递送(例如Lieberman等人，Antibody mediated  in vivo delivery of small interfering  RNAs via cell-surface  receptors，Nature Biotechnology[1087-0156]Song yr：2005vol：23 pg：709)，但仍面临严峻的技术障碍。最引人注目的是特异性靶向和递送 双链RNA分子(dsRNA)至和进入靶组织和靶细胞。双链核糖核酸(dsRNA) 分子已显示通过被称为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调控机制阻止基因 表达。可将dsRNA与抗体以良好的稳定性缀合，以确保特异性靶向并避免 全身性非特异性释放。另一方面，必须在靶细胞上或其内释放dsRNA以使 其能够进入细胞。靶向dsRNA通常积累在内体中，其需要从内体逃逸以发 挥活性。然而，仍需要发现用于靶向dsRNA的有效的无毒的非免疫原性内 体逃逸机制。

现在，通过使用本发明的双特异性抗体作为核酸的有效负载递送载体， 克服了这些缺点。因此本发明为靶向的基因治疗和靶向的RNAi递送提供了 特异性递送平台。

在一个优选的实施方案中，地高辛配基化核酸和含有重组Dig结合模 块的双特异性抗体衍生物的复合物用于将核酸特异性靶向表达抗原的细 胞。这样的复合物能够将肽靶向展示由双特异性抗体变体识别的抗原的细 胞。这些复合物由一种人源化的<靶>-<Dig>IgG组成，在其两个高亲和力 Dig结合位点上结合两个地高辛配基化核酸(每个位点结合一个)。尽管 被地高辛配基化以及与抗体复合，核酸保留其功能。另外，在复合的地高 辛配基化核酸的存在下，双特异性抗体衍生物的细胞表面靶结合位点保留 其结合特异性和亲和力。优选地，地高辛配基化核酸与双特异性<靶>-<Dig> 抗体变体的复合物可用于将核酸特异性靶向表达靶抗原的细胞。因此，核 酸选择性地处理通过表面抗原识别的细胞，因此在表达抗原的细胞中增强 了核酸引起的活性(例如RNAi或核酸介导的细胞毒性)。在一个实施方案 中，通过另外应用靶向内体的调节剂进一步增强这些活性。优选地，不仅 将核酸特异性递送至表达抗原的细胞，而且使核酸内化到靶细胞中。由于 地高辛配基化核酸以非共价的方式与本发明的双特异性抗体连接，有效负 载(即核酸)在内化后被释放。在优选的实施方案中，这样的靶抗原是肿 瘤细胞标记物。在一个优选的实施方案中，所述靶抗原是Her2。在另一个 优选的实施方案中，所述靶抗原是IGFR1。在另一个优选的实施方案中， 所述靶抗原是CD22。

在优选的实施方案中，核酸是DNA，在另一个优选的实施方案中，所 述核酸是dsRNA。在一个优选的实施方案中，所述双链RNA用于抑制靶基 因的表达。

将地高辛配基与核酸连接的方法和用于其表征的分析方法是本发明的 一部分。

为了介导其活性(例如通过siRNA特异性破坏mRNA)，治疗或诊断核 酸必须进入其靶细胞的细胞质。递送特异性核酸活性的一个重要因素是， 不仅将分子递送至细胞，而且必须将足够量的核酸转移至这些细胞的细胞 质。为此，这些分子必须穿越生物膜至少1次。由于生物制剂不易透过膜， 为了有效递送核酸活性，此步骤是必须克服的瓶颈。克服此瓶颈的方式可 为膜渗透、蛋白质跨膜易位、或可能涉及膜破坏过程的内体逃逸或小泡逃 逸机制。

在一个优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体被用作核酸的有效 负载递送模块，在所述核酸上连接内体功能调节子或内体逃逸/破坏模块。 优选地，所述内体逃逸模块包含肽。

在一个优选的实施方案中，这样的内体逃逸模块包含动态多聚缀合物 (DPC)。DPC是化学实体，在细胞结合和内化后导致siRNA的内体逃逸 (Rozema DB et.al.，Dynamic PolyConjugates for targeted in vivo  delivery of siRNA to hepatocytes.Proceedings of the National  Academy of Sciences of the United States of America；2007 Aug 7；104(32)：12982-7PMID：17652171)。这样的DPC由PBAVE(丁基氨基乙 烯基醚的聚合物)支架组成，使用双官能团的马来酰胺酸连接(maleamate  linkage)在支架上可逆地连接PEG分子。在所述马来酰胺酸连接中可使用 羧化的二甲基马来酸(CDM)。使用PEG单元屏蔽PBAVE的内体裂解的正电 荷。在PBAVE上还连接siRNA负载(例如通过可逆的二硫键)。将得到的递 送载体称为siRNA动态多聚缀合物，因为siRNA、屏蔽基团(和另外的靶 向配体)以可逆的方式缀合在聚合物上。导致siRNA的细胞质递送的这样 的DPC的内体裂解性能是通过其化学环境引起的：在成熟中的内吞溶酶体 (endolysome)中的pH的降低引起CDM-PEG的释放，暴露PBAVE的正电荷， 其进而介导内体裂解。

因此，在一个优选的实施方案中，组合DPC的内体裂解特征和双特异 性地高辛配基递送系统的特异性靶向性质。优选地，这些复合物由一种人 源化的<靶>-<Dig>IgG组成，其在其两个高亲和力Dig结合位点上结合两 个地高辛配基化的与DPC缀合的核酸(每个位点结合一个)。

在一个实施方案中，与地高辛配基化核酸复合的双特异性抗体用于成 像分析。在此实施方案中，用地高辛配基和可检测的标记物同时标记核酸。 因此有可能通过显微镜或其他成像技术显现靶向表达抗原的细胞的核酸的 定位。优选地，所述可检测的标记物是荧光标记物。在一个实施方案中， 在细胞中，即体外显现核酸的定位。在另一个优选的实施方案中，在体内 显现核酸的定位。

特异性针对地高辛配基的多克隆抗体广泛用于诊断测定。然而，从这 些杂交瘤来源的抗体中不能产生理想的稳定小片段和融合蛋白。因此，需 要重组人源化或嵌合<Dig>或<Dig>融合蛋白作为诊断试剂。在本发明的一 个实施方案中，本发明的双特异性抗体或片段被用作诊断工具和试剂。这 些双特异性抗体或片段包括但不限于特异性针对地高辛配基的功能性重组 人IgG、Fab片段，scFv和二硫化物稳定的Fv。优选地，双特异性抗体或 抗体片段识别地高辛配基化的化合物或分子，例如，但不限于，地高辛配 基化的蛋白质、肽或核酸。在优选的实施方案中，所述双特异性抗体或片 段与酶、蛋白质A、(链霉)抗生物素或融合蛋白缀合以用于诊断测定。

多克隆<Dig>(Fab)在治疗中被用于抵消地高辛配基过量。现存的产品 可能是相当不确定的并很可能具有免疫原性。本发明的双特异性抗体或抗 体片段特异性结合地高辛配基，并且是非常确定的，具有低免疫原性或不 具有免疫原性。在一个实施方案中，重组人源化或嵌合<Dig>或<Dig>片段 被用作洋地黄毒苷(Digitoxin)解毒剂。

如本文使用的，“抗体”指包含抗原结合位点的结合蛋白质。如本文使 用的，术语“结合位点”或“抗原结合位点”表示抗体分子的与配体实际 结合的区域。在本发明的一个实施方案中，每个结合位点包含抗体重链可 变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)，优选地由抗体轻链可变结构 域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)组成的配对形成。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体包含单链可变片段(scFv)。

抗体特异性指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体 是单特异性的。根据本发明的“双特异性抗体”是具有2种不同的抗原结 合特异性的抗体。当抗体具有超过一种特异性时，识别的表位可与单个抗 原或与超过一种抗原相关。本发明的抗体特异性针对2种不同的抗原，即 地高辛配基作为第一抗原和靶蛋白作为第二抗原。

如本文使用的，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点 的抗体，每一个结合位点与相同抗原的相同表位结合。

如在本申请中使用的，术语“价”表示在抗体分子中存在的结合位点 的特定数目。类似地，术语“二价”、“四价”和“六价”表示在抗体分子 中分别存在2个结合位点、4个结合位点和6个结合位点。根据本发明的 双特异性抗体至少是“二价”的，并可为“三价”或“多价”的(例如“四 价”或“六价”)。

本发明的抗体具有2个或多个结合位点并且是双特异性的。即，所述 抗体可为双特异性的，甚至在超过2个结合位点的情况下(即抗体是三价 或多价的)。本发明的双特异性抗体包括，例如多价单链抗体、二抗体和三 抗体，以及具有全长抗体的恒定结构域结构的抗体，其上通过一个或多个 肽接头连接另外的抗原结合位点(例如，单链Fv，VH结构域和/或VL结构 域，Fab或(Fab)2)。抗体可为来自一个物种的全长抗体，或为嵌合的或 人源化的。在具有超过2个抗原结合位点的抗体中，只要蛋白质具有针对 2个不同抗原的结合位点，一些结合位点可为相同的。即，尽管第一结合 位点特异性针对地高辛配基，第二结合位点特异性针对靶蛋白。

类似天然抗体，本发明的抗体的抗原结合位点一般包含6个互补决定 区(CDR)，其为抗原结合位点的亲和力提供不同的程度。存在3个重链可 变结构域CDR(CDRH1，CDRH2和CDRH3)和3个轻链可变结构域CDR(CDRL1， CDRL2和CDRL3)。通过与编译的氨基酸序列数据库比较确定CDR和框架区 (FR)的范围，在所述数据库中已根据序列间的变异性确定了这些区域。 在本发明的范围内也包括由较少的CDR组成的功能性抗原结合位点(即， 其中通过3、4或5个CDR确定结合特异性)。例如，低于6个CDR完整集 合数目的CDR即可足以用于结合。有时，VH或VL结构域就足够了。

在某些实施方案中，本发明的抗体还包含一种或多种免疫球蛋白类型 的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白类型包括IgG，IgM，IgA，IgD，和IgE 同种型，并且在IgG和IgA的情况下，包括其亚型。在优选的实施方案中， 本发明的抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构，但具有4个抗原结合位 点。这是通过将2个完整的特异性结合DIG的抗原结合位点(例如单链Fv) 与特异性结合靶蛋白的完整抗体的N-或C-端重或轻链连接实现的。4个抗 原结合位点优选地包含对于2种不同的结合特异性各有2个结合位点。

如本文使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有 单一氨基酸组成的抗体分子制剂。

术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其包含来自一种来源或物种的可变 区，即结合区，和来源于不同的来源或物种的恒定区的至少一部分，通常 通过重组DNA技术制备。优选包含鼠类可变区和人恒定区的嵌合抗体。本 发明包含的另一种优选的“嵌合抗体”形式是这样的嵌合抗体，其中恒定 区相比原始抗体已被修饰或改变以产生根据本发明的性能，特别是有关 C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的性能。这样的嵌合抗体也被称为“类 别转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免 疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的表达产物。产生嵌合抗体 的方法包括常规的重组DNA和基因转染技术，这是本领域熟知的。见，例 如Morrison，S.L.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984) 6851-6855；US 5,202,238和US 5,204,244。

术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中框架或“互补决定区”(CDR) 已被修饰，从而包含与原来的免疫球蛋白相比不同特异性的免疫球蛋白的 CDR。在优选的实施方案中，将鼠类CDR移植进人抗体的框架区以制备“人 源化抗体”。见，例如Riechmann，L.，等人，Nature 332(1988)323-327； 和Neuberger，M.S.，等人，Nature 314(1985)268-270。特别优选的CDR 与上面在嵌合抗体中提及的识别抗原的那些代表序列一致。本发明包含的 “人源化抗体”的其他形式是这样的抗体，其中原始抗体的恒定区已被另 外修饰或改变以产生根据本发明的性能，特别是有关C1q结合和/或Fc受 体(FcR)结合的性能。

如本文使用的，术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白 序列的可变和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中熟知的(van Dijk，M.A.， 和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。 也可在能够在免疫后产生人抗体的完整库或选集并缺乏内源免疫球蛋白产 生的转基因动物(例如小鼠)中产生人抗体。将人种系免疫球蛋白基因阵 列转移进这样的种系突变小鼠将导致在抗原攻击后产生人抗体(见，例如 Jakobovits，A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555； Jakobovits，A.，等人，Nature 362(1993)255-258；Bruggemann，M.，等 人，Year Immunol.7(1993)33-40)。也可在噬菌体展示文库中产生人抗 体(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388； Marks，J.D.，等人，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等人和 Boerner，等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole，P.J.，等人， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)； 和Boerner，P.，等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。如在根据本发 明的嵌合和人源化抗体中已经提到的，如本文使用的术语“人抗体”也包 含这样的抗体，其在恒定区中被修饰以产生根据本发明的性能，特别是有 关C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的性能，例如通过“类别转换”，即 Fc部分的改变或突变(例如从IgG1至IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。

如本文使用的，术语“重组人抗体”旨在包括所有的通过重组手段制 备、表达、创造或分离的人抗体，例如从宿主细胞(例如NS 0或CHO细胞) 或从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)中分离的抗体，或使用 转染进宿主细胞的重组表达载体表达的抗体。这样的重组人抗体具有重排 形式的可变和恒定区。根据本发明的重组人抗体已经历了体内体细胞超变。 因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其尽管源自人 种系VH和VL序列并与其相关，但可能不天然存在于体内的人抗体种系库 中。

如本文使用的，“可变结构域”(轻链(VL)的可变结构域，重链(VH) 的可变结构域)表示直接涉及抗体与抗原结合的每对轻和重链。人轻和重 链的可变结构域具有相同的一般结构，且每个结构域包含4个序列大幅保 守的框架(FR)区，通过3个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接FR。 框架区采用β-折叠构象，且CDR可形成连接β-折叠结构的环。每条链中的 CDR通过框架区维持其三维结构并与其他链中的CDR一起形成抗原结合位 点。抗体重和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发 挥特别重要的作用，并因此提供了本发明的另一个目的。

术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”当在本文中使用时指抗体 中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含“互补决定区”或称“CDR”的 氨基酸残基。“框架”或“FR”区是除了本文定义的高变区残基以外的可变 结构域。因此，抗体的轻和重链从N-至C-端包含FR1，CDR1，FR2，CDR2， FR3，CDR3，和FR4结构域。每条链上的CDR3通过这样的框架氨基酸分隔开。 特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区域。根据Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991) 的标准定义确定CDR和FR区。

如本文使用的，术语“结合”或“特异性结合”指抗体与抗原表位在 体外测定中，优选在使用表达野生型抗原的CHO细胞的基于细胞的ELISA 中的结合。结合指10-8M或更低，优选10-13M to 10-9M的结合亲和力 (KD)。可通过BIAcore测定(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden) 研究抗体与抗原或FcγRIII的结合。结合亲和力通过术语ka(抗体/抗原 复合物中抗体的结合速率常数)、kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义。

如本文使用的，术语“连接的”特定地指抗体-半抗原相互作用，通过 此相互作用使地高辛配基化的治疗或诊断有效负载与本发明的双特异性抗 体非共价地结合。

如本文使用的，术语“小分子”或“小化合物”指合成的或天然存在 的有机或无机分子，其一般具有低于10,000克/摩尔的分子量，任选地低 于5,000克/摩尔，和任选地低于2,000克/摩尔。

如本文使用的，术语“肽”指通过一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基 酸的α-氨基之间的酰胺形成产生的任意聚合化合物。如本文使用的，术语 “蛋白质”指超过约50个残基的特定序列多肽。

如本文使用的，术语“核酸”指由核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸组成的寡聚物或聚合物，或可与天然存在的核酸以类似2个天然 存在的核酸的序列特异性方式(例如可参与Watson-Crick碱基配对相互作 用)杂交的通过合成产生的化合物(例如，在美国专利号5,948,902和其 中引用的参考中描述的PNA)。非天然存在的核酸是包含不天然存在的核 碱基序列的寡聚物或聚合物，或包含天然存在的核碱基、糖或糖间连接的 功能等同物的类别，如肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA) 或甘油核酸(GNA)。此术语包括包含天然存在的核酸核碱基腺嘌呤(A)、 鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的寡聚物，以 及包含碱基类似物或修饰的核碱基的寡聚物。核酸可源自多种天然来源， 例如病毒、细菌和真核DNA和RNA。其他核酸可源自合成来源，并包括被 制造用作研究试剂、诊断剂或潜在和确定的治疗剂的多种寡核苷酸中的任 一种。所述术语包括包含单链核酸或双链核酸的寡聚物。

术语“表位”包括任意能够特异性结合抗体的任意多肽决定簇。在某 些实施方案中，表位决定簇包括具有化学活性的表面分子基团，例如氨基 酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，和在某些实施方案中，表位决定簇可能具 有特定的三级结构特征，和或特定的电荷特征。表位是抗原被抗体结合的 区域。在某些实施方案中，当抗体优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合 物中的其靶抗原时，将其称为特异性结合抗原。

在本发明的一个实施方案中，双特异性抗体包含全长抗体作为支架。 术语“全长抗体”表示，抗体由2条“全长抗体重链”和2条“全长抗体 轻链”组成。“全长抗体重链”是从N-端至C-端方向由抗体重链可变结构 域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体铰链区、抗体恒定结构域2(CH2)、 抗体恒定结构域3(CH3)和任选地，在IgE亚类抗体的情况下，抗体恒定 结构域4(CH4)组成的多肽。“全长抗体轻链”是从N-端至C-端方向由 抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽。全 长抗体链通过CL-结构域和CH1结构域之间的和全长抗体重链的铰链区之 间的多肽间的二硫键连接。

根据本发明的抗体的结合位点可分别由2个可变结构域对，即一个重 链可变结构域和一个轻链可变结构域形成。抗体中的最小结合位点决定区 是重链CDR3区。

在二硫化物稳定的单链抗体的一个实施方案中，根据本发明的抗体包 含的单链抗体的可变结构域之间的二硫键独立地选自下述位置，以用于每 一种单链抗体的：

i)重链可变结构域第44位至轻链可变结构域第100位，

ii)重链可变结构域第105位至轻链可变结构域第43位，或

iii)重链可变结构域第101位至轻链可变结构域第100位。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含的单链抗体的可变结构域 之间的二硫键在重链可变结构域第44位和轻链可变结构域第100位之间。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含的单链抗体的可变结构域 之间的二硫键在重链可变结构域第105位和轻链可变结构域第43位之间。

在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体的特征在于，所述单特 异性二价抗体是人IgG1亚类，或具有L234A和L235A突变的人IgG1亚类。

在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体的特征在于，所述单特 异性二价抗体是人IgG2亚类。

在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体的特征在于，所述单特 异性二价抗体是人IgG3亚类。

在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体的特征在于，所述单特 异性二价抗体是人IgG4亚类，或具有另外的S228P突变的IgG4亚类。

在另一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于

——由单特异性二价抗体的2对重和轻链可变结构域分别形成2个抗 原结合位点，并结合相同的表位，

——通过一种单链抗体的重和轻链可变结构域分别形成另外的2个抗 原结合位点，

——单链抗体通过肽接头分别连接一条重链或一条轻链，其中每个抗 体链末端仅连接单链抗体。

如本发明中使用的术语“肽接头”表示，具有优选地为合成来源的氨 基酸序列的肽。这些根据本发明的肽接头用于将不同的抗原结合位点和/ 或最终包含不同抗原结合位点的抗体片段(例如单链Fv、全长抗体、VH 结构域和/或VL结构域、Fab、(Fab)2和Fc部分)连接在一起以形成根 据本发明的双特异性抗体。肽接头可包含一个或多个以下表1中所列的氨 基酸序列，以及其他任意选择的氨基酸。

表1-肽接头氨基酸序列

如本发明中使用的术语“单链接头”表示，具有优选地为合成来源的 氨基酸序列的肽。这些根据本发明的肽接头用于连接VH和VL结构域以形 成单链Fv。单链接头可包含一个或多个以下表2中所列的氨基酸序列，以 及其他任意选择的氨基酸。

表2-单链接头氨基酸序列

由于其化学和物理性质，例如分子量和包括二级修饰的结构域结构， 抗体的下游加工是非常复杂的。例如，不仅对于配制的药物，而且对于下 游加工(DSP)中的中间体，需要浓缩的溶液以实现小体积，从而用于经济 的操作和应用储存。但随着抗体浓度的增加，可观察到形成聚集物的倾向。 这些聚集的抗体与分离的抗体相比具有受损的特征。现在发现，通过在与 单特异性二价亲本抗体连接的单链抗体的重和轻链可变结构域之间引入二 硫键可减少根据本发明的抗体的聚集。此改进的稳定性不仅可用于生产过 程中，而且可用于抗体的储存。在一个实施方案中，根据本发明的抗体包 含的单链抗体的可变结构域之间的二硫键独立地选自下述位置，以用于每 一种单链抗体：

i)重链可变结构域第44位至轻链可变结构域第100位，

ii)重链可变结构域第105位至轻链可变结构域第43位，或

iii)重链可变结构域第101位至轻链可变结构域第100位。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含的单链抗体的可变结构域 之间的二硫键在重链可变结构域第44位和轻链可变结构域第100位之间。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含的单链抗体的可变结构域 之间的二硫键在重链可变结构域第105位和轻链可变结构域第43位之间。

如在本申请中使用的术语“恒定区”表示除了可变区以外的抗体的结 构域的总和。恒定区不直接涉及抗原的结合，但展示了多种效应功能。取 决于其重链恒定区的氨基酸序列，将抗体分类为：IgA，IgD，IgE，IgG和 IgM，且其中一些还可被分为亚类，例如IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4，IgA1 和IgA2。对应不同抗体类型的重链恒定区分别被称为α，δ，ε，γ和μ。 在所有5类抗体中可发现的轻链恒定区被称为κ(kappa)和λ(lambda)。

如在本申请中使用的术语“源自人源的恒定区”表示IgG1，IgG2，IgG3， 或IgG4亚类的人抗体的重链恒定区，和/或恒定的轻链κ或λ区。这样的 恒定区是现有技术中熟知的，并例如被Kabat，E.A.，(见例如Johnson，G. 和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat，E.A.，等 人，Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788)描述。尽管IgG4 亚类的抗体显示了减少的Fc受体(FcγRIIIa)结合，其他IgG亚类的抗体显 示了有力的结合。然而如果Pro238，Asp265，Asp270，Asn297(丢失Fc 碳水化合物)，Pro329，Leu234，Leu235，Gly236，Gly237，Ile253，Ser254， Lys288，Thr307，Gln311，Asn434，和His435残基被改变，其也提供减少 的Fc受体结合(Shields，R.L.，等人，J.Biol.Chem.276(2001) 6591-6604；Lund，J.，等人，FASEBJ.9(1995)115-119；Morgan，A.， 等人，Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434)。在一个实施方案 中，根据本发明的抗体与I gG1抗体相比具有减少的FcR结合。因此，单特 异性二价亲本抗体具有与IgG4亚类或与IgG1或IgG2亚类的FcR结合有关 的S228，L234，L235和/或D265突变，和/或包含PVA236突变。在一个实 施方案中，在单特异性二价亲本抗体中的突变是S228P，L234A，L235A， L235E和/或PVA236。

根据本发明的抗体通过重组手段产生。因此，本发明的一个方面是编 码根据本发明的抗体的核酸，另一个方面是包含所述编码本发明的抗体的 核酸的细胞。重组产生的方法是现有技术中众所周知的，并包含在原核和 真核细胞中的蛋白质表达以及随后的抗体的分离和通常纯化至可药用的纯 度。为了在宿主细胞中表达上述抗体，通过标准方法将编码各个修饰的轻 和重链的核酸插入表达载体。在合适的原核或真核宿主细胞例如CHO细胞、 NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大 肠杆菌细胞中进行表达，然后从细胞(上清或裂解后的细胞)中回收抗体。 重组产生抗体的一般方法是现有技术中熟知的并例如在Makrides，S.C.， Protein Expr.Purif.17183-202(1999)；Geisse，S.，等人，Protein  Expr.Purif.8271-282(1996)；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16 151-161(2000)；Werner，R.G.，Drug Res.48870-880(1998)的综述文 章中描述。

通过常规的免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟基磷 灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基中适当地分离双特异性抗 体。使用常规程序易于分离和测序编码单克隆抗体的DNA和RNA。杂交瘤 细胞可作为这样的DNA或RNA的来源。一旦被分离，可将DNA插入表达载 体，然后将表达载体转染进宿主细胞，例如HEK 293细胞、CHO细胞或骨 髓瘤细胞(否则其不产生免疫球蛋白)，以在宿主细胞中得到重组单克隆抗 体的合成。

通过引入合适的核苷酸变化至抗体DNA，或通过核苷酸合成制备双特 异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)。然而，仅可在非常有限的范围中 (例如如上所述的范围)进行这样的修饰。例如，所述修饰不改变上述抗 体的特征，例如IgG同种型和抗原结合，但可改进重组生产的产量、蛋白 质稳定性或便于纯化。

如本申请中使用的术语“宿主细胞”表示可被改造以产生根据本发明 的抗体的任意类型的细胞系统。在一个实施方案中，使用HEK293细胞和 CHO细胞作为宿主细胞。如本文使用的，措辞“细胞”、“细胞系”和“细 胞培养物”可互换使用，且所有这些名称都包括后代。因此，词语“转化 体”和“转化细胞”包括原代对象细胞和源自其的培养物，而无论传代的 次数。也应当理解，由于故意或偶然突变，所有后代的DNA含量不一定精 确地相同。包括具有与最初筛选的转化细胞的功能或生物学活性相同的变 体后代。

例如，Barnes，L.M.，等人，Cytotechnology 32 109-123(2000)； Barnes，L.M.，等人，Biotech.Bioeng.73 261-270(2001)描述了NS0 细胞中的表达。例如，Durocher，Y.，等人，Nucl.Acids.Res.30E9(2002) 描述了瞬时表达。Orlandi，R.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 3833-3837(1989)；Carter，P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 4285-4289(1992)；和Norderhaug，L.，等人，J.Immunol.Methods 204 77-87(1997)描述了可变结构域的克隆。Schlaeger，E.-J.，和 Christensen，K.，in Cytotechnology 30 71-83(1999)和Schlaeger， E.-J.，in J.Immunol.Methods 194191-199(1996)描述了优选的瞬时 表达系统(HEK 293)。

适用于原核生物的对照序列包括例如启动子，任选地操纵子序列，和 核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多聚腺苷酸化信号。

当核酸被置于和另一个核酸序列的功能关系中时，其是“有效连接的”。 例如，前序列或分泌前导的DNA与多肽的DNA是有效连接的，如果前者被 表达为参与多肽分泌的前体蛋白；启动子或增强子与编码序列是有效连接 的，如果启动子或增强子影响编码序列的转录；或核糖体结合位点与编码 序列是有效连接的，如果前者所处的位置能够促进翻译。一般地，“有效连 接”指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导的情况下，是连续的和 依读框的。然而，增强子不需要是连续的。通过在便利的限制酶位点的连 接反应实现连接。如果这样的位点不存在，依照常规操作使用合成的寡核 苷酸衔接子或接头。

通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl条带、柱层析、琼脂糖凝胶电 泳和其他本领域熟知的技术进行抗体的纯化以去除细胞成分或其他污染 物，例如其他细胞核酸或蛋白质。见Ausubel，F.，等人，编Current Protocol s in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley  Interscience，New York(1987)。已完善建立了不同方法并广泛用于蛋白 质纯化，例如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如蛋白质A或蛋白质G亲 和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨 乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附(例如使用β-巯基乙醇和其他SH 配体)、疏水相互作用或芳香族吸附层析(例如使用苯基-琼脂糖凝胶、 aza-arenophilic树脂或间位-氨基苯硼酸)、金属螯合物亲和层析(例如 使用Ni(II)-和Cu(II)亲和材料)、大小排阻层析和电泳方法(例如凝胶电 泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.Appl.Biochem.Biotech.75 93-102(1998))。

本发明的一个方面是包含根据本发明的复合物或抗体的药物组合物。 本发明的另一个方面是包含根据本发明的抗体的药物组合物，所述抗体与 地高辛配基化治疗或诊断剂连接(即根据本发明的复合物)。在另一个方面， 本发明提供了组合物，例如药物组合物，其包含与根据本发明的地高辛配 基化治疗或诊断剂连接的抗体(即根据本发明的复合物)和配制在一起的 药物载体。

本发明的另一个方面是所述药物组合物用于癌症的治疗。

本发明的另一个方面是根据本发明的抗体在制造用于治疗癌症的药物 中的用途。

本发明的另一个方面是治疗患有癌症的患者的方法，通过对需要这样 的治疗的患者施用与根据本发明的地高辛配基化治疗或诊断剂连接的抗 体。

如本文使用的，“药物载体”包括生理上相容的任意和所有溶剂、分散 介质、涂料、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，等等。优选地，载体 适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或 输注)。

可通过本领域已知的多种方法施用本发明的组合物。熟练技术人员将 理解，施用途径和/或模式将依赖希望的结果而变化。为了通过特定施用途 径施用本发明的化合物，可能需要用避免其失活的材料覆盖化合物，或与 所述材料共同施用化合物。例如，可在合适的载体中，例如脂质体或稀释 剂中对受试者施用化合物。可药用的稀释剂包括盐溶液和水性缓冲液。药 物载体包括无菌水溶液或分散液和无菌粉末，用于临时制备无菌的可注射 的溶液或分散液。用于药物活性物质的这样的介质和试剂的用途是本领域 已知的。

如本文使用的短语“胃肠外施用”和“胃肠外地施用”指除了肠施用 和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并包括但不限于静脉内、肌 肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮 下、表皮下、关节内、包囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射 和输注。

这些组合物也可包含佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。 可通过上文中的灭菌程序和通过包含多种抗菌和抗真菌剂，例如对羟基苯 甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等等双重保证避免微生物的存在。也可 能希望在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠等等。另外，可通过包含 延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶实现可注射的药物形式的延长吸 收。

与选择的施用途径无关，通过本领域技术人员已知的常规方法将本发 明的化合物(可以合适的水化形式使用)和/或本发明的药物组合物配制为 可药用的剂量形式。

可改变在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，从而在 特定患者、组合物和施用模式中得到有效达到希望的治疗反应且对患者无 毒的有效成分的量。选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素， 包括使用的本发明的特定组合物的活性、施用途径、使用时间、使用的特 定化合物的排泄率、治疗的持续时间、与使用的特定化合物组合使用的其 他药物、化合物和/或材料、治疗患者的年龄、性别、体重、病情、整体健 康和既往病史和医学领域中熟知的类似因素。

组合物必须是无菌和液体，从而使所述组合物可通过注射器递送。除 了水以外，载体优选地是等渗的缓冲盐溶液。

例如，可通过使用例如卵磷脂的涂料，在分散液的情况下维持需要的 颗粒大小和通过使用表面活性剂维持合适的流动性。在许多情况下，优选 地在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露醇和山梨醇，和氯化 钠。

如本文使用的术语癌症指增生性疾病，例如淋巴瘤、淋巴细胞性白血 病、肺癌、小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、 皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门 区癌、胃癌(stomach cancer，gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子 宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金病、 食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软 组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细 胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、全 脊髓(spinal axis)肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星细 胞瘤、施万细胞瘤(schwanoma)、室管膜细胞瘤(ependymona)、成神经 管细胞瘤(medulloblastoma)、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文肉 瘤，包括任意上述癌症的难以医治形式，或一种或多种上述癌症的组合。

如本文使用的，措辞“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使 用，且所有这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化细胞” 包括原代对象细胞和源自其的培养物，不管传代的次数。也应当理解，由 于故意或偶然突变，所有后代的DNA含量不一定精确地相同。包括具有与 所筛选的最初的转化细胞的功能或生物学活性相同的变体后代。旨在表示 不同名称的地方，通过上下文是显而易见的。

如本文使用的，术语“转化”指将载体/核酸转移进宿主细胞的过程。 如果使用没有坚固的细胞壁障碍的细胞作为宿主细胞，通过例如Graham 和Van der Eh，Virology 52 546ff(1978)描述的磷酸钙沉淀法进行转染。 然而，也可使用其他将DNA引入细胞的方法，例如通过核注射或通过原生 质体融合。如果使用原核细胞或包含实质的细胞壁构造的细胞，一种转染 方法是例如使用氯化钙的钙处理，如Cohen，F.N，等人，PNAS.69(1972) 7110ff描述。

如本文使用的，“表达”指核酸转录为mRNA的过程和/或转录的mRNA (又称转录物)随后被翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。将转录物和编码 的多肽统称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，在真核细胞中的 表达可包括mRNA的剪接。

“载体”是核酸分子，特别是自我复制的核酸分子，其将插入的核酸 分子转移进宿主细胞和/或在宿主细胞之间传递插入的核酸分子。此术语包 括主要用于将DNA或RNA插入细胞(例如，染色体整合)的载体，主要用 于复制DNA或RNA的复制载体，和用于转录和/或翻译DNA或RNA的表达载 体。也包括提供多于一种上述功能的载体。

“表达载体”是多核苷酸，当其被引入合适的宿主细胞时，可被转录 和翻译为多肽。“表达系统”通常指合适的宿主细胞，其中包含可用于生产 希望的表达产物的表达载体。

附图简述：

图1：从<DIG>杂交瘤19-11中分离的mRNA。

图2：从19-11mRNA产生的PCR片段。

图3：预测的鼠类<DIG>Fv的结构。

图4：预测的人源化<DIG>Fv的结构。

图5：人源化<DIG>IgG的纯化。a)人源化<DIG>IgG的图解模型，b)： 还原型SDS-PAGE，c)HP-大小排阻层析。

图6：人源化<IGF1R><Dig>双特异性变体的纯化。a)人源化<IGF1R> <Dig>双特异性抗体的图解模型，b)：还原型SDS-PAGE，c)HP-大小排阻 层析(1mg/ml)。

图7：人源化<Her2><Dig>双特异性变体的纯化。a)人源化<Her2> <Dig>双特异性抗体的图解模型，b)：还原型SDS-PAGE，c)HP-大小排阻 层析(1mg/ml)。

图8：a)人源化<Dig>IgG的图解模型，b)人源化<IGF1R><Dig>双特 异性抗体的图解模型，c)人源化<Her2><Dig>双特异性抗体的图解模型， d)以蛋白质产量表示表达水平(在这些未优化的瞬时表达实验中每升细胞 培养物上清的纯化蛋白mg数)。

图9：在二硫化物稳定前和后，人源化<Her2><Dig>双特异性抗体的 表达水平、聚集和稳定性。a)<Her2><Dig>-2320(未稳定的)图解模型b) <Her2><Dig>-2321(二硫化物稳定的)图解模型c)在二硫化物稳定前和 后，人源化<Her2><Dig>双特异性抗体的表达水平、聚集和稳定性。

图10：重组人源化<Dig>IgG抗体和杂交瘤来源的鼠类<Dig>19-11 抗体与地高辛配基化抗原的结合。通过表面等离子共振(SPR)技术使用 Biacore T100或Biacore 3000仪器分析结合性能。a)人源化<Dig>IgG 抗体。DIG-BP4与hu<DIG>IgG的结合，KD＝＜76pM b)人源化<Dig>IgG 抗体。Eg5-siRNA-DIG与hu<DIG>IgG的结合，KD＝12nMc)人源化<Dig> IgG抗体。Eg5-siRNA-(2x)DIG与hu<DI G>I gG的结合，KD＝8pM d)杂交 瘤来源的鼠类<Dig>19-11抗体。DIG-BP4的结合，KD＝33nM e)杂交瘤 来源的鼠类<Dig>19-11抗体。Eg5-siRNA-DIG的结合，KD＝269pM f)杂 交瘤来源的鼠类<Dig>19-11抗体。Eg5-siRNA-(2x)DIG的结合，KD＝17pM。

图11：重组人源化<Her2><Dig>双特异性抗体与地高辛配基化抗原的 结合。通过表面等离子共振(SPR)技术使用Biacore T100或Biacore 3000 仪器分析结合性能。a)DIG-BP4的结合，KD＝68pM b)Eg5-siRNA-DIG 的结合，KD＝35nM c)Eg5-siRNA-(2x)DIG的结合，KD＝162pM。

图12：重组人源化<Dig>二硫化物稳定的scFV融合蛋白与DIG-RNA酶 (人和牛)的结合。通过表面等离子共振(SPR)技术使用Biacore T100 或Biacore 3000仪器分析结合性能。

图13：重组鼠类44-100稳定的<Her2><Dig>双特异性抗体与地高辛 配基化抗原的结合。通过表面等离子共振(SPR)技术使用Biacore T100 或Biacore 3000仪器分析结合性能。a)Eg5-siRNA-DIG的结合，KD＝467 pM c)Eg5-siRNA-(2x)DIG的结合，KD＝40pM。

图14：肽-地高辛配基复合物的结构。

图15：蜂毒素，Fallv1和Fallv2肽及其DIG修饰变体的生物学活性。 a)用Dig-蜂毒素处理的H322M，b)用蜂毒素处理的H322M c)用FALLv1 处理的H322M d)用Dig-FALLv1处理的H322M e)用FALLv2处理的H322M f)用Dig-FALLv2处理的H322M。

图16：与地高辛配基化肽复合的IgG保留了对细胞表面抗原的结合特 异性和亲和力，不依赖结合的顺序。a)DIG-INF7和IGF1R至<IGF1R><Dig> 的加成结合，b)DIG-FALL和IGF1R至<IGF1R><Dig>的加成结合。

图17：通过应用双特异性抗体衍生物和地高辛配基化肽的复合物，特 异性递送肽至表达抗原的细胞。a)图解结构b)FALLv1b)Fam5b。

图18：地高辛配基化阿霉素的产生和组成。

图19：地高辛配基化阿霉素-<Her2>-<Dig>双特异性抗体复合物的大 小排阻层析指示，地高辛配基化阿霉素的装载和载荷分子的同质性。a)层 析：1：Her2Dig Doxo(1∶0)2：Her2Dig Doxo(1∶0.5)，3：Her2Dig Doxo (1∶1)，4：Her2Dig Doxo(1∶2)，5：Her2Dig Doxo(1∶3)，6：Her2Dig Doxo(1∶5).7：Her2Dig Doxo(0∶1)，b)分析。

图20：地高辛配基化阿霉素-<IGF1R>-<Dig>双特异性抗体复合物特异 性靶向IGF1R阳性细胞。a)用阿霉素处理的H322M，b)用DIG-阿霉素处 理的H322M c)用装载了DIG-阿霉素的<IGF1R><Dig>2321处理的H322M。

图21：地高辛配基化阿霉素-<Her2>-<Dig>双特异性抗体复合物特异 性靶向Her2阳性细胞。a)用阿霉素处理的KPL4，b)用DIG-阿霉素处理 的KPL4c)用装载了DIG-阿霉素的<Her2><Dig>2321处理的KPL4。

图22：地高辛配基化阿霉素的特异性靶向和内体积累。以5.0μg/ml 孵育120’。a)单独的阿霉素，b)Di g-阿霉素，c)<IGF-1R>-Dig>Dig- 阿霉素。

图23：地高辛配基化Cy5的结构。

图24：地高辛配基化Cy5-<Her2>-<Dig>双特异性抗体复合物的大小排 阻层析指示，地高辛配基化Cy5的装载和载荷分子的同质性。a)层析图： 1：Her2Dig Cy5(1∶0)2：Her2 Dig Cy5(1∶0.5)，3：Her2 Dig Cy5(1∶1)， 4：Her2Dig Cy5(1∶2)，5：Her2 Dig Cy5(1∶3)，6：Her2 Dig Cy5(1∶5). 7：Her2Dig Cy5(0∶1)，b)分析。

图25：与连接地高辛配基化Cy5的<CD22>-<Dig>抗体孵育的Raji或 Ramos细胞的FACS分析。a)CD22阳性Raji细胞。DIG-Cy5组合与双特异 性<CD22>-WT<Dig>一抗结合得非常好(单峰)。多峰：Raji Cy5DIG，单独 的Raji细胞。b)CD22阳性Ramos细胞。单独的二级实体(Cy5DI G)仅显 示少量背景且与CD22WT-DIG的组合具有更强烈的偏移(单峰)，指示与细 胞的特异性结合。

图26：使用连接地高辛配基化Cy5的双特异性<Her2>-<Dig>抗体的肿 瘤成像：a)双特异性<Her2>-<Dig>抗体的图解结构，b)<Her2Dig>^digCy5， 静脉内注射后24小时的NIRF。

图27：使用连接地高辛配基化Cy5的双特异性<IGF1R>-<Dig>抗体的 肿瘤成像：a)双特异性<IGF1R>-<Dig>抗体的图解结构，b)<IGF1R-DIG-hu2> +DIG-Cy5，c)DIG-Cy5。

图28：使用连接地高辛配基化Cy5的双特异性<Her2>-<Dig>抗体的肿 瘤成像。a)图解结构b)在注射<Her2>-<Dig>抗体2321后48小时注射地 高辛配基化Cy5。Y-轴：平均NIRF信号强度/实验时间(1/ms)。

图29：地高辛配基化核酸的图解结构。B：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、 尿嘧啶、脱氧胸苷；X：OH，H；Y：O，S；R：RNA序列。

图30：对双特异性靶向模块和荧光标记的核酸的大小排阻层析分析。 a)图解结构b)层析谱。

图31：地高辛配基化siRNA的生物学活性。a)Eg5-siRNA介导的Eg5 mRNA击倒(knockdown)，IC50＝0.016nM。y-轴：％表达，x-轴：s iRNA 浓度(nM)；b)DIG-Eg5-siRNA介导的Eg5mRNA击倒，IC50＝0.035nM。 y-轴：％表达，x-轴：siRNA浓度(nM)；c)DIG-Eg5-Cy5-siRNA介导的Eg5 mRNA击倒，IC50＝0.013nM。y-轴：％表达，x-轴：siRNA浓度(nM)；d) Eg5siRNA介导的细胞毒性，在用Eg5siRNA转染的KPL-4中测量，IC50＝28 nM，y-轴：活细胞数，x-轴：siRNA浓度(nM)；e)DIGEg5siRNA介导的 细胞毒性，在用DIG Eg5siRNA转染的KPL-4中测量，IC50＝4nM，y-轴： 活细胞数，x-轴：siRNA浓度(nM)；f)DIG-Eg5-Cy5siRNA介导的细胞毒 性，在用DIG-Eg5-Cy5siRNA转染的KPL-4中测量，IC50＝215nM，y-轴： 活细胞数，x-轴：siRNA浓度(nM)；g)Eg5siRNA介导的对KPL4细胞的 细胞毒性；用50ng相应的siRNA转染KPL4细胞，左栏：未处理的，中栏： Eg5-siRNA，右栏：DIG-Eg5-siRNA。显示了活细胞百分比。

图32：地高辛配基化siRNA和靶抗原同时结合至双特异性 <Her2>-<Dig>抗体。Biacore分析。

图33：a)用连接地高辛配基化和Cy5标记的siRNA的<CD22>-<Dig> 抗体孵育的Raji细胞的FACS分析。相比单独的DIG-siRNA-Cy5/单独的 Raji细胞(10²的双峰)，与DIG-siRNA-Cy5组合的CD22WT-DIG抗体在Raji 细胞上显示了非常明显的阳性信号(5x10³的单峰)。b)用连接地高辛配 基化和Cy5标记的siRNA的<CD22>-<Dig>抗体孵育的Ramos细胞的FACS 分析。二级实体(DIG-siRNA-Cy5)没有显示背景(双峰，同单独细胞一起)， 而CD22WT DIG是阳性的(单峰)。

图34：连接双特异性<Her2>-<Dig>抗体的siRNA的特异性体外靶向。 顶部：在37℃孵育30’后，在KPL4细胞中的表面结合的Ab-siRNA复合物 的实例。a)Eg5siRNA_CY5，b)赫塞汀抗κAlexa 488，c)重叠；中部： 在37℃孵育30’后，在MDAMB468细胞中的表面结合的Ab-siRNA复合物的 实例。d)Eg5siRNA_CY5，e)赫塞汀抗κAlexa 488，f)重叠；底部： 在37℃孵育过夜后，在KPL4细胞中的表面结合的Ab-siRNA复合物的实例。 g)Eg5siRNA_CY5，h)赫塞汀-DIG_hu2-SS，i)转铁蛋白j)重叠。

图35：连接双特异性<IGFR1>-<Dig>抗体的siRNA的特异性体外靶向。 a)-d)在37℃孵育10’后，在H322M中的表面结合的Ab-siRNA复合物。 a)Eg5siRNA检测(cy5)，b)<IGF1R>-<DIG>检测(alexa)c)转铁蛋白， d)细胞核；e)-h)：在37℃孵育1小时后，在H322M中内化的Ab-siRNA 复合物。e)Eg5siRNA检测(cy5)，f)<IGF1R>-<DIG>检测(alexa)，g) 转铁蛋白，h)细胞核。

图36：连接双特异性<Her2>-<Dig>抗体的siRNA的特异性体内靶向。 a)双特异性抗体的图解结构，b)注射后24小时的NIRF图。 <Her2Dig>^digdsDNA^Cy5

图37：连接双特异性<IGFR1>-<Dig>抗体的siRNA的特异性体内靶向。 a)双特异性抗体的图解结构，b)NIRF图。

图38：a)在内化后从靶向模块中分离siRNA。A：<IgG>-<DIG>，B： Eg5siRNA_CY5C：重叠b)在内化后从靶向模块中分离DIG标记的eGFP。 上行：在冰上2小时，下行：在37℃过夜。A：eGFP，B：IgG，C：重叠c) 在内化后共价连接的siRNA没有从靶向模块中分离。上行：在冰上1小时， 下行：在37℃过夜。A：siRNA，B：IgG，C：重叠。d)在内化后共价连接 的没有柠檬黄(Citrine)从靶向模块中分离。上行：在冰上2小时，下行： 在37℃过夜。A：柠檬黄，B：IgG，C：重叠。

图39：通过双特异性<IGFR1>-<Dig>抗体-地高辛配基化siRNA复合物 将siRNA活性特异性靶向靶细胞。在表达IGF1R的H322M细胞中的Eg5mRNA 水平(％和Eg5/GAPHD比例)。A：50nM<IGF1R-Dig>Dig-Eg5siRNA XnM <IGF1R-Dig>Dig-INF7肽B：50nM<IGF1R-Dig>Dig-Eg5siRNA XnM <IGF1R-Dig>Dig-INF7肽C：50nM<IGF1R-Dig>Dig-LUCsiRNA XnM <IGF1R-Dig>Dig-INF7肽D：50nM<IGF1R-Dig>XnM<IGF1R-Dig>Dig-INF7 肽。

图40：<IGFR1>-<Dig>/<CD22>-<Dig>抗体-地高辛配基化DPC复合 物的抗原功能。a)H322M，Igf1R阳性。仅H322M缀合物显示了约2*10²的峰。在10¹的多峰：<IGFR1>-<Dig>抗体、仅有H322M二抗、H322<DIG>、 H322M同种型和仅H322M细胞。b)Raji，CD22阳性。仅Raji缀合物 (<CD22>-<Dig>-地高辛配基化DPC复合物)显示了约2*10¹的峰。多峰： <CD22>-<Dig>抗体、仅Raji二抗，Raji<DIG>、Raji同种型和仅Raji细 胞。

图41：将<IGFR1>-<Dig>抗体-地高辛配基化DPC复合物特异性靶向靶 细胞。1：Dig-DPC+<IGFR1>-<Dig>双特异性2：DPC(无DIG)+ <IGFR1>-<Dig>双特异性3：Dig-DPC+<IGFR1>-<Dig>双特异性。A：DPC， B：抗体C：抗体DPC核。

图42：将<Her2>-<Dig>抗体-地高辛配基化DPC复合物特异性靶向靶 细胞。用DIG-DPC Cy3<Her2>-<Dig(上行)和没有抗体的DIG-DPC Cy3 (下行)静脉内注射具有KPL4的SCID米色小鼠，显示了24小时后的NIRF。

图43：将与双特异性抗体复合的DIG-eGFP特异性靶向表达同源抗原 的肿瘤。a)单峰：LeY-DIG双特异性抗体，多峰：仅DIG，仅二抗，仅同 种型和仅细胞。b)单峰：LeY-DIG双特异性抗体，多峰：1∶3LeY/DIG-GFP， 1∶2LeY/DIG-GFP和仅细胞。

图44：DIG标记的蛋白质eGFP可用于监控靶细胞结合的双特异性抗体 的内吞作用。a)MCF71∶2LeY/DIG-GFP灰色峰：37℃，黑色峰：4℃b)MCF7 1∶3LeY/DIG-GFP灰色峰：37℃，黑色峰：4℃

图45：<Dig>Fab片段的晶体，和实验测定的鼠类亲本抗体的地高辛 配基结合区的结构。(a)晶体学数据收集和模型改进统计学，b)在抗原的 存在下(带状表示，L链为蓝色，H链为绿色)，结合DIG部分(用颜色编 码的棍模型)的鼠类抗DIG Fab的复合物。在具有标记的CDR环的CDR上 放大(图B)。DIG部分附近的最终2F₀F_C电子密度图显示为以1σ计数 (countered)的蓝色网格。虚线指示接头朝向Cy5的方向。图C显示了结 合DI G的鼠类Fab的静电表面电势。(c)排列在结合口袋处的残基以棍模 型绘出。参与跟DIG的氢键相互作用的残基以棍模型表示。氢键表列出了 残基对(partner)和距离(单位为)。

图46：a)鼠类抗DIG Fab的表面图b)鼠类抗DIG Fab的带状图。c) 和d)表面等离子共振(Biacore)实验显示序列优化的人源化抗Dig模块 的结合特异性和改进的亲和力。c)优化前的<DIG>，KD＝12nM，d)：在VH 49，57，60(Kabat)处的优化。KD＝1nM。

图47：a)基于全长IgG作为主分子的双和多特异性形式。

b)由较小的抗体片段和蛋白质结构域组成的双和多特异性形式。采用 胶原蛋白三螺旋(CTH)构象和半胱氨酸结序列(NCI)的合成的胶原蛋白 样肽(GPP)x10可用于共价连接胶原蛋白三聚构建体。

c)靶-链霉抗生物素Dig融合蛋白

d)-x)表面等离子共振(Biacore)和FACS实验显示完全保留了包含 不同形式的地高辛配基结合模块的实体的结合特异性。

d)和e)IGF-1R结合的Biacore分析：浓度系列1，5625；3，125；6，25； 12，5；25；50nM.d)：<IGF1R-DIG>4421(30nM)KD＝5nM.e) <IGF1R-DIG-DIG>2321_4421(16nM)KD＝2nM。

f)双特异性<DIG>抗体的结合和亲和力的总结。

g)-i)<IGF1R>scFv-(G4s)3-G4T-<DIG>scFv-His6(25nM)结合的 Biacore分析。g)图解结构，h)：AKH-6110nM+DIGsiRNA 50nM+sIGF1R 25nM

i)：DIGsiRNA 50nM+sIGF1R 25nM+AKH-61 10nM

j)IGF1R结合的FACS分析，灰色峰：H322MAKH60+抗His+抗小鼠， 黑色峰：H322MAKH60+抗小鼠

k)DIG结合的FACS分析

l)-m)<IGF1R>scFv-His6-<IGF1R>scFv-His6--<DIG>scFv-CTH (25nM)结合的BiaCore分析。

l)图解结构。

n)AKH-68/6610nM+DIGsiRNA 50nM+sIGF1R 25nM

m)：DIGsiRNA 50nM+sIGF1R 25nM+AKH-68/6610nM

o)IGF1R结合的FACS分析。单峰：AKH-68/66+抗His+抗小鼠，多 峰：AKH-68/66+抗小鼠，抗His(+抗小鼠)，小鼠同种型y-轴：相对最 大值的％

p)DIG结合的FACS分析。浅灰色峰：DIG-Cy5，深灰色峰：AKH-68/66 +DIG-Cy5，黑色峰：人同种型y-轴：相对最大值的％

q)-s)结合靶链霉抗生物素Dig融合蛋白的BiaCore分析。q)图解结 构，r)AKH-4210nM+sIGF1R 25nM+生物素-siRNA 50nM.s)：sIGF1R 25nM+DIGsiRNA 50nM+生物素-siRNA 50nM，于AKH-42上，10nM

t)IGF1R结合的FACS分析。单峰：AKH-42+抗His+抗小鼠，多峰： AKH-42+抗小鼠，抗His(+抗小鼠)，小鼠二抗y-轴：相对最大值的％

u)DIG结合的FACS分析。单峰：AKH-42+抗His+DIG-Cy5，多峰： DIG-Cy5，仅细胞。

v)-x)结合<HER2>scFv-PExII-<DIG>scFv-His6(25nM)的BiaCore 分析。v)图解结构，w)BiaCore分析，x)BiaCore分析，放大。

图48：用<Dig>双特异性抗体进行地高辛配基化阿霉素的靶向实验。

a)和b)：用指示浓度的阿霉素(图48a)或地高辛配基化阿霉素(图 48b)处理MDA-MB-468(Her2+/-)细胞48小时。

c)-e)：用<Her2>-<Dig>-Dig-Dox或<IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox复合物 处理H 322M(IGF1R+++)(图48c))KPL-4(Her2+++)(图48d))，和 MDA-MB-468(Her2+/-)(图48e))细胞48小时。通过应用CellTiter Glo 发光细胞活力测定(Promega，Madison，WI)评估细胞活力。

图49：a)和b)地高辛配基化Cy5/<Her2>-<Dig>双特异性抗体复合物 的大小排阻层析指示装载率为2∶1(DIG-Cy5：<Her2>-<Dig>)c)和d)SEC 的评估

图50：a)实验设定和放大未解旋(non-deconvoluted)的天然质谱 以测定载体与装载的有效负载的比例。Eg5-s iRNA-(2x)Dig(上图)和 Eg5-siRNA-(1x)Dig(下图)与<Her2-Dig>的结合b)天然质谱指示，每个 靶向载体装载2个或更少的有效负载。应用单地高辛配基化核酸，观察到 装载的靶向载体包含多于1个但不超过2个有效载体/载体。应用双地高辛 配基化核酸导致检测到增加的具有较低装载率的分子，即大多数载体装载 1个有效负载。这表示装载率为1个Dig/Dig结合实体。

图51：a)和b)半抗原介导的有效负载递送的载体，用于递送至不同细 胞表面抗原的c)靶向VEGFR2的载荷，d)-g)：表面等离子共振实验显示， 完全保留了细胞表面靶向和地高辛配基结合模块的结合特异性和亲和力。 d)Her2和s iRNA至<Her2-DIG-hu2>的结合，e)<CD33>-<DIG>至人CD33-Fc 融合体(配体)的结合和DIG-siRNA的另外结合f)抗CD22抗体至固定的 CD22/Fc的结合g)DIG-siRNA和LeY-HAS至<LeY>-<DIG>的加成结合h) <CDCP1>-<DIG>的结合。

图52：a)和b)显示了MCF7细胞的FACS分析结果a)用 DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5和CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5复合 物处理b)用DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5和 LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5复合物处理(下图)。LeY-DIG导致 DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5在靶细胞上的显著积累。c)显示了在指示的 时间点用DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5， CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5或 LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5处理的MCF7细胞的Eg5/GAPDH mRNA 水平。在所有组中可见RNAi，但DharmaFECT的非特异性粘性影响了LeY-DIG 的特异性。

图53：显示了用增加浓度的DIG-DPC-siRNA-Cy3处理的(25，50，100， 150nM，图53a)或用增加浓度的LeY-DIG/DIG-DPC-siRNA-Cy3复合物处 理的(25，50，100，150nM图53b)MCF7细胞的FACS分析结果。LeY-DIG 导致DIG-DPC-siRNA-Cy3在靶细胞上的显著积累。c)显示了用增加浓度的 DIG-DPC-AhaI或CD22-DIG/DIG-DPC-AhaI复合物处理的MCF7细胞的 AhaI/GAPDH mRNA水平。d)显示了用增加浓度的CD22-DIG/DIG-DPC-AhaI， VEGFR2-DIG/DIG-DPC-AhaI或LeY-DIG/DIG-DPC-AhaI复合物处理的MCF7 细胞的AhaI/GAPDH mRNA水平。e)显示了与DIG-DPC-GL3或复合物 CD22-DIG/DIG-DPC-GL3或LeY-DIG/DIG-DPC-GL3相比，用增加浓度的 DIG-DPC-AhaI或复合物CD22-DIG/DIG-DPC-AhaI或LeY-DIG/DIG-DPC-AhaI 处理的MCF7细胞的AhaI/GAPDH mRNA水平。f)将靶向特异性因子对时间 作图，指示当用LeY-DIG/DIG-DPC-AhaI处理MCF7细胞4-8小时时达到最 高的特异性。

图54：a)和b)：通过SEC-MALLS测量的DIG-DPC-siRNA AHAI(图54a) 和LeY-DIG/DIG-DPC-siRNA AHAI(图54b)的分子量范围。黑色曲线：通 过LS检测器产生的信号；而灰色线：从LS和RI检测器的信号生成的分子 量；生成的分子量仅是近似值，因为精确的DIG-DPC-siRNA AHAI的dn/dc 值未知并估计为0.146，这是PEG的dn/dc值。c)和d)：通过SEC-MALLS 测量的DIG-DPC-siRNA AHAI(图54c)和LeY-DIG/DIG-DPC-siRNA AHAI(图 54d)的流体力学半径范围。黑色曲线：通过LS检测器产生的信号；点线： 从QELS检测器的信号生产的流体力学半径。加入LeY-DIG导致LeY-DIG 和DIG-DPC-siRNA AHAI的复合物的形成。

图55：(a)半抗原介导的有效负载递送的载体，包含用于复合有效负 载的不同实体b)-d)表面等离子共振实验显示，保留了细胞表面靶向的 结合特异性和亲和力以及生物素结合模块的功能。

图56：(a)由<Dig>双特异性抗体、地高辛配基化siRNA和包含siRNA 结合模块的转染辅助实体组成的复合物。(b)凝胶移动测定证明包含 siRNA结合模块的转染辅助实体与地高辛配基化siRNA复合，及与双特异 性靶向实体形成“超复合物(supercomplex)”。(c)使用通过结合siRNA 和具有转染功能的肽/蛋白质模块辅助的靶向递送特异性减少AhaI mRNA。

图57：在用与<靶-Dig>双特异性抗体复合的DIG标记的siRNA-脂纳米 颗粒处理后，siRNA介导的在MCF-7细胞中的mRNA击倒。在与用<靶-DIG> 双特异性抗体预孵育的DIG标记的siRNA-脂纳米颗粒孵育12小时后，在 表达LeY抗原但不表达CD22的MCF-7乳腺癌细胞中测定AHA1mRNA水平(相 对GAPDH)。y-轴：相对的AHA1-mRNA浓度/[％]。

实施例

实施例1：从小鼠杂交瘤细胞克隆19-11中分离和表征编码鼠类<Dig>IgG1κ的VH和VL结构域的cDNA

设计、产生、优化和表征重组<Dig>抗体、抗体片段和融合蛋白的先决 条件是获得蛋白质和(DNA)序列信息。因此，必须产生杂交瘤细胞克隆 19-11的“原始”鼠类<Dig>抗体的VH和VL结构域的此信息。下面需要进 行的实验步骤是(i)从产生<Dig>的19-11杂交瘤细胞中分离RNA，(ii) 将此RNA转化为cDNA，然后转化为含有VH和VL的PCR片段，和(iii) 将这些PCR片段整合进质粒载体用于在大肠杆菌中增殖，并测定其DNA(和 推断的蛋白质)序列。

从19-11杂交瘤细胞中制备RNA：

应用Rneasy试剂盒(Qiagen)从5x10e6表达抗体的杂交瘤细胞(克隆 19-11)中制备RNA。简而言之，将沉淀的细胞在PBS中洗一次并沉淀，然 后在500μl RLT-Puffer(+β-ME)中重悬以裂解。使细胞通过Qiashredder (Qiagen)完全裂解，并然后如制造商的手册描述的进行基质介导的纯化程 序(ETOH，RNeasy柱)。在最后一次洗涤步骤后，在50ul无RNA酶的水中 从柱上回收RNA。通过定量1∶20稀释的样品的A260和A280测定回收的 RNA的浓度。通过在甲酰胺-琼脂糖凝胶(见Maniatis手册)上的变性RNA 凝胶电泳分析分离的RNA样品的完整性(质量，降解程度)。图1中显示了 这些RNA凝胶电泳的实例。分离的条带代表完整的18s和28s核糖体RNA。 这些条带的完整性(和约2∶1的强度比)指示RNA制备物的良好质量。以 等份在-80℃冷冻和储存来自19-11杂交瘤细胞的分离的RNA。

通过RACE PCR产生编码19-11VH和VL的DNA片段

通过应用FirstChoice Kit(Ambion)试剂盒使用描述的用于标准 5’-RLM RACE方案的反应从19-11RNA制备物中制备用于随后的(RACE-) PCR反应的cDNA。在PCR反应中使用Pwo DNA聚合酶。为此，使用10ug 19-11 RNA或对照RNA(来自小鼠胸腺)，并如描述的处理以整合5’RACE衔接子。 我们不需要使用“外部PCR”反应并直接进行“内部PCR”：这包括组合由 5’RACE内部引物(来自试剂盒)和C-κ或CH1特异性引物组成的引物对。 用于扩增VL区的cκ引物序列是5’- TTTTTTGCGGCCGCCctaacactcattcctgttgaagctc-3’(SEQ.ID.No.15)。 用于扩增VH区的CH1引物序列是5’-TTTTTTGCGGCCGCGTAC ATATGCAAGGCTTACAACCACAATCC-3’(SEQ.ID.No.16)。对这些引物组合， 60℃的退火温度是合适的，且已使用了在55和65℃(梯度PCR)之间的温度 进行PCR(94℃0.5分钟，55-65℃1分钟-72℃1分钟，35个循环，以 在72℃延伸10分钟结束)。通过出现分离的600bp至800bp的DNA片段表 明包含抗体VH或VL区的DNA片段的成功的特异性扩增。图2显示了从 19-11RNA得到的这些确定的DNA片段。这些DNA片段包含<Dig>杂交瘤细 胞19-11的VH和VL编码序列。

将编码19-11VH和VL的DNA片段克隆进质粒并测定其DNA和蛋白质序列

通过琼脂糖凝胶提取分离编码VH和VL的PCR片段，并随后通过标准 分子生物学技术(Maniatis手册)纯化。通过严格按照制造商的说明书使 用pCR bluntII topo试剂盒(Invitrogen)将Pwo产生的纯化的PCR片段插 入pCR bluntII topo载体。将Topo连接反应物转化进大肠杆菌Topo10- 单次感受态细胞。之后，在LB-卡那霉素琼脂板的菌落中鉴定包含具有含 VL或VH的插入物的载体的大肠杆菌克隆。随后从这些菌落制备质粒，并 通过用EcoRI的限制性消化确认在载体中存在预期的插入物。因为载体骨 架包含在插入物两侧的EcoRI限制性识别位点，通过具有约800bp(对VL 而言)或600bp(对VH而言)的EcoRI可释放的插入物确定含有插入物的 质粒。通过在多个VH和VL克隆上的自动化DNA测序测定19-11VL和VH 的DNA序列和推断的蛋白质序列。<Dig>克隆19-11的VL序列在Seq.ID. NO.1中描述，且<Dig>克隆19-11的VH序列在Seq.ID.NO.2中描述。

实施例2：mu<Dig>19-11的VH和VL结构域的人源化

抗体序列的人源化的目的是，产生保留鼠类来源的原始抗体的全部功 能但不含有(或仅含有极少的或无关的)被人免疫系统识别为“外源”的 序列或结构的分子。可应对此挑战的不同程序是现有的且已公开的 (Almagro JC，Fransson J Humanization of antibodies.Frontiers in  bioscience：a journal and virtual library；2008Jan 1；13：1619-33， Hwang WY，Foote J Immunogenicity of engineered ant ibodies.Methods (San Diego，Calif.)；2005May；36(1)：3-10)。

抗体的可变区的功能通过二级和三级(和四级)结构确定，然而所述 结构的形成基于VH和VL的一级结构(及相邻和相互作用的实体)。因此， 人源化的主要挑战是(完全)保留结构确定的功能，尽管需要在某些位置 改变一级蛋白质序列。因此，有关抗体的重要功能区域(CDR区)的结构 信息对支持人源化是非常重要的。为了产生人源化的mu<Dig>19-11衍生 的变体，我们组合了以下基于实验性的动物实验(wet-lab)程序以及电脑 模拟程序。从(i)电脑模拟预测mu<Dig>19-11的抗原结合位点开始，我 们能够(ii)电脑模拟预测具有高度的类人性(human-likeness)以及高 概率地保留全部功能的hu<Dig>变体。最后(iii)我们实验测定了含有和 不含抗原的<Dig>抗体(片段)的(X光)结构，以验证和改进我们的电脑 模拟模型。

mu<Dig>19-11的抗原结合位点的电脑模拟模型

我们的mu<Dig>19-11Fv区的电脑模拟结构模型的基础是从实验测定 的VH和VL mRNA序列(在实施例1中描述，Seq.ID.NO.1和Seq.ID.NO. 2)推断的蛋白质序列。通过鼠类抗体的Fv结构域的同源建模和能量最小 化的组合，电脑模拟产生由这些序列编码的蛋白质的结构模型。为此，在 PDB(蛋白质数据库)上分别检索了用于同源建模的CDR和框架序列的同源 性。对每一个CDR和对框架叠加更同源的结构。随后从轻和重链二者的不 同部分构建了模型，然后对复合物进行(能量)最小化。从我们的同源建 模程序中得到的mu<Dig>19-11Fv区的结构模型在图3中显示。预测的 结构的一点相当特别的特征是，具有似乎深入延伸进VH-VL界面的显著的 腔。形成此狭窄的腔的主要决定簇是VH的长CDR3环。所述腔的内部排列 有甲硫氨酸(更深的残基)、2个丝氨酸、2个脯氨酸、少量酪氨酸(侧面 壁)。可以合理的推测，被此抗体识别的抗原地高辛配基以类似半抗原的方 式结合进此深腔。

在抗原的存在下，鼠类抗-Dig Fv区的结合区的结晶和X光结构测定

为了能够进一步优化抗地高辛配基抗体的人源化VH和VL序列，我们 实验测定了亲本(鼠类)抗体的结构。为此，使用熟知的现有技术方法(木 瓜蛋白酶消化)，通过纯化IgG的蛋白酶消化产生Fab片段。通过蛋白酶A 层析(其去除Fc)从剩余的Fc片段上分离Fab片段，之后进行大小排阻 层析(Superdex200HiLoad 120ml 16/60凝胶过滤柱，GE Healthcare， Sewden)以去除蛋白质片段。

为了结晶，在20mM His-HCl，140mM NaCl，pH 6.0中的纯化Fab 和Cy5标记的地高辛配基(DIG-3-cme-dea-Cy5＝DIG-Cy5/粉末)与地高 辛配基化的荧光染料Cy5(Dig-Cy5)复合。在结晶设置前浓缩蛋白质溶液。 为形成复合物，在20mM His-HCl，140mM NaCl，pH 6.0中溶解DIG-Cy5， 并以5∶1的最终摩尔比例加入至浓缩的蛋白质溶液中。在混合1μl蛋白 质溶液(24mg/ml)和1μl含有60％(v/v)2-甲基-1，3-丙二醇(MPD)/0.1 M醋酸钠pH 4.6/5mM CaCl₂的储存(reservoir)液后，在25℃使用 悬滴气相扩散法得到与DIG-Cy5复合的鼠类Fab结晶。在液氮中速冻晶体， 晶体不需要任何其他的冷冻保护。

在2009年9月11日，在X06SA(SLS，Villingen，Switzerland)收 集与DIG-Cy5复合的鼠类Fab的衍射数据。使用XDS[Kabsch，W.， Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of  initially unknown symmetry and cell constants.JAppl Cryst，1993. 21：p.916-24]整合和测量数据。复合物的晶体属于P4₂2₁2空间群，具有 c＝123.696，α＝β＝γ＝90°和分辨率的衍射。

使用BALBES程序[Long，F.，等人，BALBES：a  molecular-replacement pipeline.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr， 2008.64(Pt 1)：p.125-32.]通过产生基于具有PDB ID 3cfd，2a6d， 2a6j[Debler，E.W.，等人，Deeply inverted electron-hole  recombination in a luminescent antibody-stilbene complex.Science， 2008.319(5867)：p.1232-5.，Sethi，D.K.，等人，Differential  epitope positioning within the germline antibody paratope enhances  promiscuity in the primary immune response.Immunity，2006.24(Sethi， D.K.，等人，Differential epitope positioning within the germline  antibody paratope enhances promiscuity in the primary immune  response.Immunity，2006.24(4)：p.429-38)：p.429-38.]的结构的 检索模型通过分子替换解析结构。总共2个Fab分子可能位于不对称单元 中。通过使用COOT程序[Emsley，P.和K.Cowtan，Coot：model-building  tools for molecular graphics.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr， 2004.60(Pt 12Pt 1)：p.2126-32.]建立人工模型和使用PHENIX程序 [Zwart，P.H.，等人，Automated structure solution with the PHENIX suite.Methods Mol Biol，2008.426：p.419-35.]的优化，完成和优化 最初的模型。在第一轮优化之后，出现了DIG-Cy5的DIG部分的不同的电 子密度。从PDB ID 1lke[Korndorfer，I.P.，S.Schlehuber，和A.Skerra， Structural mechanism of specific ligand recognition by a lipocalin  tailored for the complexation of digoxigenin.J Mol Biol，2003. 330(2)：p.385-96.]得到DIG的模型，并通过在线工具PRODRG [Schuttelkopf，A.W.和D.M.van Aalten，PRODRG：a tool for  high-throughput crystallography of protein-ligand complexes.Acta  Crystallogr D Biol Crystallogr，2004.60(Pt 8)：p.1355-63.]产生 DIG的优化参数。将DIG模型置于用于最终的优化步骤的电子密度中。有 关优化统计学见图45a。使用PYMOL程序[DeLano，W.L.，The PyMOL  Molecular Graphics System.2008.]作图。

实验结构测定的结果在图45b中显示。得到的晶体形式在不对称单元 中包含2个独立的DIG-Cy5：抗-DIG Fab复合物，且2个复合物的原子模型 均可以建立。DIG-Cy5的DIG部分在不对称单元中的2个Fab分子中均非 常有序，尽管其似乎在不对称单元的一个分子中被结合的更紧密(相比另 一个分子)。DI G被结合在位于CDR中部的L链和H链交界的口袋中。DIG 的O32原子指向口袋的底部，且与Cy5的接头位于口袋外面并指向溶剂。 除了DIG以外，可观察到与Cy5的接头的第一个C原子的清楚的2F0-FC电 子密度(在图45b中的图B)。由于接头的灵活性，在电子密度图中看不到 接头的其余部分和Cy5。此无序指示，接头没有与蛋白质连接，并足够长 以允许不同性质和大小的分子例如染料、siRNA等等与DIG连接且不影响 DIG被抗体识别。

有趣地是，结合口袋不是如预期的用于如DIG的疏水分子的那样完全 疏水，而是包含一些正电荷电势(图45b中的图C)。由4个酪氨酸残基(57， 59，109，110)以及重链的A33，W47，P61，P99和M112勾勒出结合口袋。 在口袋的形成中涉及来自轻链的残基Q89，S91，L94，P96和F98。可能的 氢键配偶体轻链的N35和Y36形成口袋的底部但不被DI G触及(图45c中 的图A)。

在DIG结合中仅涉及一个直接的氢键并在DIG的O32和轻链的Q89之 间形成。其他2个氢键不是直接的而是由水分子介导的。O12与Y109的羰 基氧和重链的S 35的侧链相互作用(图45c中的图B)。在O14和S91(L 链)的骨架羰基氧之间形成第四个氢键，但也是由水分子介导的。在不对 称单元的2个分子中的氢键数和长度的比较指示，在第二个复合物中，DIG 不能完全进入口袋。在1个分子中，DIG部分陷入口袋相对深并形成4个 氢键。第二个DIG结合较松，其不像另一个分子中的那样深入口袋，且仅 形成3个比在另一个分子中弱的氢键(图45c中的图C)。

在分辨率上的结合区的实验测定结果使得能够表征配体与其抗 体的结合模式。其进一步确认，此结构与我们通过一级序列的电脑模拟分 析预测的结构模型大体上类似(见上)。获得亲本抗体的可变区的电脑模拟 建模的结构以及实验测定的“真实”结构是详细建模和通过蛋白质工程进 一步改进重组地高辛配基结合模块的先决条件。

保留全部功能的mu<Dig>19-11人源化变体的确定

通过应用基于CDR嫁接和引入另外的调节结合特异性和亲和力的突变 的程序，确定代表预期的VH和VL结构域的氨基酸序列。此程序的基础原 理是，为人种系的每个与小鼠序列不同的氨基酸分配一个“分值”。通过氨 基酸改变对抗原识别能力或复合物稳定性的假定的影响确定此分数。基于 其较低的分数及其相对高的使用选择人种系。在此人源化程序中包含 TEPITOPE分析(预测T细胞表位)，目的是在得到的人源化分子中具有少 量或没有T细胞表位。当分数太高时(指示高概率的负干扰)，可能需要用 (原始的)鼠类序列替换通过此程序最初确定的“人”序列。这最常用于 CDR或CDR周围区序列中的氨基酸改变。在有些情况下，“回复突变”为鼠 类残基不仅是CDR所必需的，而且也是框架所必需的，以维持稳定性和功 能。

我们选择的得到的hu<Dig>变体是基于人框架VH3_11和VL1_39的组 合，并具有高度类人性。对VL，不需要在人VK1_39和人IGKJ4-01/02种 系的j元件的框架中整合任何回复突变。这导致高度的人特征和相对低的 TEPITOPE警报数。VH变体来源于人VH3_23种系和人J IGHJ6-01-2。在人 VH3_11种系上建立变体J。此外，使用我们的评分方法，我们能够在CDR 中引入1个人氨基酸以提高人特征和降少TEPITOPE警报数。人源化VH(和 Fd片段)的蛋白质序列在Seq.ID.NO.3和Seq.ID.NO.4中描述，且 人源化VL(和L链)的蛋白质序列在Seq.ID.NO.5和Seq.ID.NO.6 中描述。尽管谨慎应用了我们建立的程序，仍然存在这样的可能性，即在 人源化VH和VL部分中的序列改变可能干扰Fv区的结构完整性。为此，我 们通过对人源化Fv序列应用与上述相同的电脑模拟程序，产生了另一个 <Dig>结构模型。此结构在图4中显示。mu<Dig>结构(图3)和hu<Dig> 结构(图4)的比较指示，我们在人源化过程中引入的氨基酸变化没有影 响抗原结合位点。

产生具有提高的亲和力的地高辛配基结合模块

对抗地高辛配基抗体的人源化VH和VL序列进行了进一步优化以产生 对地高辛配基具有更高亲和力的模块。基于实验测定的以及电脑模拟计算 预测的结构(见上，基于实验结构测定以外的结构建模)，我们鉴定了3 个位置，其中氨基酸变化可能影响亲和力。它们位于(Kabat位置)VH结 构域的Ser49，Ile57和Ala60(图46)。用Ala替换氨基酸VHSer49、Ala 替换VHIle57和用Pro替换VHAla60产生具有如SEQ ID NO 36和SEQ ID NO 37所列的序列的抗体衍生物。由此序列组成的结合实体可被表达并用标准 蛋白质A和大小排阻技术纯化(见实施例3“重组人源化<Dig>抗体，片段 和双特异性融合蛋白的组成、表达和纯化”)。得到的分子功能完整且相比 人源化亲本分子，展示了对地高辛配基的改进的亲和力。这通过表面等离 子共振(BiaCore)实验证明(详见实施例4“重组<Dig>抗体、片段和双特 异性融合蛋白与地高辛配基化抗原的结合”)。这些实验的结果在图46中显 示，并证明通过引入VH49，VH57和VH60突变，对地高辛配基的亲和力被 提高了约10倍。之后通过检查dig结合可变区的实验测定结构，确认了这 些位置的相关性。具有改进的亲和力的地高辛配基结合模块可被用作多种 双特异性和多特异性抗体衍生物的半抗原实体。

实施例3：重组人源化<Dig>抗体，片段和双特异性融合蛋白的组成、表达和纯化

为了更详细的表征，将鼠类和人源化<Dig>模块与人抗体的恒定区组 合，以形成人源化IgG或产生具有其他抗体序列的双特异性融合蛋白。产 生人源化<Dig>IgG和结合Dig以及其他靶(例如受体酪氨酸激酶Her2或 IGF1R)的双特异性衍生物需要(i)设计和确定这些分子的氨基酸和核苷 酸序列，(ii)在转染的培养哺乳动物细胞中表达这些分子，和(iii)从 转染的细胞上清中纯化这些分子。

设计和确定<Dig>IgG和结合Dig以及Her2或IGF1R的双特异性抗体衍生物的氨基酸和核苷酸序列

为了产生含有(原始)鼠类mu<Dig>19-11Fv区的结合特异性的人源 化IgG，我们将上述人源化VH序列依读框的融合至IgG1的CH1-CH2-CH3 的N端。类似地，我们将上述人源化VL序列依读框的融合至Cκ的N端。 得到的hu<her2><Dig>IgG H和L链的氨基酸序列在Seq.ID.NO.7，Seq. ID.NO.8和Seq.ID.NO.9中描述。为了产生包含hu<Di g>的结合特异 性以及针对受体酪氨酸激酶Her2的特异性的双特异性抗体衍生物，我们将 由人源化VH和VL序列定义的<Dig>单链Fv模块依读框的融合至以前描述 的<Her2>抗体的H链的C端(例如美国专利5,772,997)。通过引入以前描 述的VH44-VL100二硫键(例如Reiter Y，Brinkmann U，Lee B，Pastan I  Engineering antibody Fv fragments.for cancer detection and  therapy：disulfide-stabilized Fv fragments.Nature biotechnology； 1996Oct；14(10)：1239-45)进一步稳定此<Dig>scFv模块。得到的结合 Her2以及地高辛配基的双特异性抗体衍生物的氨基酸和序列在Seq.ID. NO.7，Seq.ID.NO.8和Seq.ID.NO.9中描述。

为了产生包含hu<Dig>的结合特异性以及针对受体酪氨酸激酶IGF1R 的特异性的双特异性抗体衍生物，我们将由人源化VH和VL序列确定的 <Dig>单链Fv模块依读框的融合至以前描述的<IGF1R>抗体的H链的C端。 通过引入以前描述的VH44-VL100二硫键(例如Reiter Y，Brinkmann U，Lee B，Pastan I Engineering antibody Fv fragments.for cancer  detection and therapy：disulfide-stabilized Fv fragments.Nature biotechnology；1996Oct；14(10)：1239-45)进一步稳定此<Dig>scFv模 块。得到的结合IGF1R以及地高辛配基的双特异性抗体衍生物的氨基酸和 序列在Seq.ID.NO.10，Seq.ID.NO.11和Seq.ID.NO.12中描述。

<Dig>IgG和结合Dig以及Her2或IGF1R的双特异性抗体衍生物的表达

使用FreeStyle^TM 293表达系统根据制造商的说明书(Invitrogen， USA)通过人胚肾293-F细胞的瞬时转染表达<Dig>IgG和双特异性抗体衍生 物。为此，在携带原核和真核选择标记的表达载体中构建相应的双特异性 抗体的轻和重链。在大肠杆菌中扩增这些质粒，将质粒纯化并之后用于瞬 时转染。如在Current Protocols in Cell Biology(2000)，Bonifacino， J.S.，Das so，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada， K.M.(编)，John Wiley & Sons，Inc中描述的，使用标准细胞培养技术 操纵细胞。在FreeStyle^TM 293表达培养基中在37℃/8％CO2下培养 FreeStyle^TM 293-F细胞悬浮物，并在转染当天以1-2x106活细胞/ml的密 度将细胞接种在新鲜的培养基中。用于250ml的最终转染体积，使用333 μl 293fectin^TM(Invitrogen，Germany)和250μg重和轻链质粒DNA以1∶ 1的摩尔比例在Opti-MEM I培养基(Invitrogen，USA)中制备 DNA-293fectin^TM复合物。在转染7天后，通过以14000g离心30分钟澄 清包含IgG或双特异性抗体的细胞培养上清，并通过无菌滤器过滤(0.22 μm)。将上清储存在-20℃，直至纯化。

为了测定细胞培养上清中的抗体和衍生物的浓度，应用亲和HPLC层 析。为此，在UltiMate 3000HPLC系统(Dionex)上，对在200mM KH2PO4， 100mM柠檬酸钠，pH 7.4中的Applied Biosystems Poros A/20柱应用包 含与蛋白质A结合的抗体和衍生物的细胞培养上清，并用200mM NaCl，100 mM柠檬酸，pH 2.5从基质上洗脱。通过紫外光吸收和峰面积的积分定量洗 脱的蛋白质。将纯化的标准IgG1抗体作为标准物。

<Dig>IgG和结合Dig及Her2或IGF1R的双特异性抗体衍生物的纯化

在转染表达质粒7天后，收获HEK 293细胞上清。通过使用蛋白质A- 琼脂糖凝胶TM(GE Healthcare，Sweden)的亲和层析和Superdex200大小 排阻层析分两步从上清中纯化其中包含的重组抗体(衍生物)。简而言之， 对用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl， pH 7.4)平衡的HiTrap蛋白质A HP柱(5ml)应用包含双特异性和三特异性 抗体的澄清的培养上清。用平衡缓冲液洗去未结合的蛋白质。用0.1M柠 檬酸盐缓冲液，pH 2.8洗脱双特异性抗体，并用0.1ml 1M Tris，pH 8.5 中和包含蛋白质的级分。然后，合并洗脱的蛋白质级分，用Amicon超速离 心过滤设备(MWCO：30K，Millipore)浓缩至3ml的体积并上样至用20mM 组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex200HiLoad 120ml 16/60 凝胶过滤柱(GE Healthcare，Sweden)。通过以320nm处的OD作为背景校 正测定在280nm处的光密度(OD)，使用在根据Pace et.al.，Protein  Science，1995，4，2411-1423的氨基酸序列为基础计算的摩尔消光系数， 测定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度。合并单体抗体级分，速冻并储存 于-80℃。提供部分样品用于随后的蛋白质分析和表征。

通过存在或缺乏还原剂(5mM 1，4-二硫苏糖醇)的SDS-PAGE并用考 马斯亮蓝染色，确认DIGHu2抗体构建体和双特异性DIG构建体的同质性。 根据制造商的说明书使用预制凝胶系统(Invitrogen，USA) (4-20％Tris-甘氨酸凝胶)。

在还原性条件下(图5-7)，与IgG相关的多肽链以及C-端scFv融合 物在SDS-PAGE上显示了与计算分子量类似的表观分子大小。通过蛋白质A HPLC分析了所有构建体的表达水平，且与“标准”IgG的表达产量类似， 或在IGF-1RDIGHu2-2321的情况下产量较低。在这样的未优化的瞬时表达 实验中，平均蛋白质产量为每升细胞培养上清6-35mg纯化蛋白(图8)。

在UltiMate 3000HPLC系统(Dionex)上使用Superdex 200分析型大 小排阻柱(GE Healthcare，Sweden)在25℃下在200mM KH2PO4，250mM KCl， pH 7.0的运行缓冲液中通过高效SEC分析双特异性抗体样品的聚集物含 量。以0.5ml/分钟的流速将25μg蛋白质注入柱并恒溶剂(isocratic) 洗脱50分钟。用于稳定性分析，制备0.1mg/ml，1mg/ml和3mg/ml浓 度的纯化蛋白，并在4℃、37℃孵育7天，然后通过高效SEC评估。在使 用肽-N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶促处理去除N-聚糖 后，通过NanoElectrospray Q-TOF质谱证实还原的双特异性抗体轻和重链 的氨基酸骨架的完整性。通过纯化蛋白的HP-大小排阻层析分析的聚集分 析显示(相比“正常”IgG)，包含未通过VH和VL之间的链间二硫化物稳 定的scFv的分子具有显著增加的聚集趋势。为了解决这些双特异性抗体的 聚集问题，对scFv部分进行二硫化物稳定。为此，我们在确定的位置(根 据Kabat编号体系的位置VH44/VL100)在scFv的VH和VL中引入单个半 胱氨酸替换。这些突变使得能够在VH和VL之间形成稳定的链间二硫化物， 其进而稳定得到的二硫化物稳定的scFv模块。在Fv的N-端和C-端在scFv 中引入VH44/VL100二硫化物导致所有构建体的蛋白质表达水平的显著改 善(图9)。在纯化后Her2DIGHu2-2320具有1mg的最终产量，而 Her2DIGHu2-2321具有约32mg的最终产量。

实施例4：重组人源化<Dig>抗体，片段和融合蛋白与地高辛配基化抗原的结合

进行了以下描述的分析以评估人源化程序是否产生了保留了全部结合 活性的重组<Dig>衍生物。为此，通过表面等离子共振(SPR)技术使用 Biacore T100或Biacore 3000仪器(GE Healthcare Bio-Sciences AB， Uppsala)分析重组<Dig>衍生物的结合性能。此系统被公认用于分子相互作 用的研究。其允许连续实时监控配体/分析物结合，并因此在多种测定设置 中测定结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡常数(KD)。SPR 技术是基于测量靠近镀金的生物传感器芯片表面的折射率。折射率的变化 指示由固定化的配体和注入溶液的分析物的相互作用引起的表面上的质量 变化。如果分子与表面上的固定化配体结合则质量增加，在解离的情况下 质量则减少。为了进行结合研究，使用胺结合化学在CM5生物传感器芯片 的表面固定抗-人IgG捕获抗体。用1∶1的0.1M N-羟基琥珀酰亚胺和0.1 M 3-(N，N-二甲基氨基)丙基-N-乙基碳二亚胺的混合物以5μl/分钟的流速 活化流动池。如果没有另外描述，在醋酸钠，pH 5.0中以10μg/ml注入 抗-人IgG抗体，这得到约12000RU的表面密度。以相同的方式处理参考 对照流动池，但仅使用载体缓冲液代替捕获抗体。注入1M乙醇胺/HCl pH 8.5封闭表面。为了比较人源化蛋白质变体的结合与原始的杂交瘤细胞 19-11的鼠类<Dig>IgG的结合，在CM5生物传感器芯片表面以与上述的用 于抗-人IgG抗体相同的方式固定抗-小鼠I gG捕获抗体。为了评估重组 <Dig>衍生物的功能，测定了重组hu<Dig>模块与不同地高辛配基抗原的结 合，所述模块包括(i)人源化IgG，(ii)含有hu<Dig>scFv的融合蛋白 或(iii)二硫化物稳定的scFv。将得到的结合亲和力与重组人源化模块 所来源的鼠类“野生型”DIG-IgG的结合比较。

杂交瘤来源的鼠类<Dig>19-11与人源化<Dig>IgG的比较

在CM5生物传感器芯片的表面以与上述相同的方式固定抗-小鼠IgG 抗体。以2μg/ml注入抗-人IgG抗体，这产生约600RU的表面密度。在 每轮结合循环以后，通过以5μl/分钟注入0.85％H₃PO₄ 60秒，然后以5μl/ 分钟注入5mM NaOH 60秒进行重生，以去除任何非共价结合的蛋白质。在 HBS-P(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，0.005％表面活性剂P20)中 稀释待分析的样品并以5μl/分钟的流速注入。对浓度在1-5nM之间的抗 体，接触时间(结合期)为3分钟。为了测量结合亲和力，以增加的浓度 注入不同的地高辛配基化抗原，即DIG-BP4的浓度是0.3125，0.625，1.25， 2.5，5和10nM，和DIG-siRNA是0.018-300nM之间。对每种分子接触时 间(结合期)是3分钟，解离时间(用运行缓冲液洗涤)是5分钟，以30 μl/分钟的流速。所有相互作用在25℃(标准温度)下进行。在鼠类<DIG> 19-11的情况下，在每轮结合循环后，在30μl/分钟的流速下注入10mM甘 氨酸/HCl pH 1.5的重生溶液60秒，以去除任何非共价结合的蛋白质。在 人源化<DIG>IgG的情况下，通过以5μl/分钟注入0.85％H₃PO₄ 60秒，然 后以5μl/分钟注入5mM NaOH进行重生。以每秒1个信号的速率检测信 号。

这些分析的结果在图10中示范显示并总结于表3，结果表明，重组人 源化<Dig>以与鼠类亲本抗体相同的功能和高亲和力结合地高辛配基化的 蛋白质和核酸。发现鼠类抗体针对地高辛配基化蛋白质(Dig-BP4，欧洲专 利EP 1545623B1)的Kd是33pM，而人源化抗体的Kd＜76pM。类似地， 发现鼠类抗体针对地高辛配基化核酸(siRNA-Dig，见实施例11)的kd是 269pM，而人源化抗体的Kd是12nM。因此，我们推断，在其人源化变体 (其由Seq.ID.NO.3，Seq.ID.NO.4，Seq.ID.NO.5和Seq.ID. NO.6中描述的序列定义)中保留了<Dig>抗体的功能。

杂交瘤来源的鼠类<Dig>19-11与重组人源化<Dig>-单链Fv融合蛋白的比较

以与实施例4的介绍中所描述的相同的方式在CM5生物传感器芯片的 表面固定抗小鼠和抗人IgG抗体。在HBS-P中稀释待分析的样品，并以5μl/ 分钟的流速注入。对浓度在1-5nM之间的抗体，接触时间(结合期)为3 分钟。为了测量结合亲和力，以增加的浓度注入不同的地高辛配基化抗原， 即DIG-BP4的浓度是0.3125，0.625，1.25，2.5，5和10nM，DIG-s iRNA 是0.018-120nM之间。对每种分子接触时间(结合期)是3分钟，解离时 间(用运行缓冲液洗涤)是5分钟，以30μl/分钟的流速。所有相互作用 在25℃(标准温度)下进行。在每轮结合循环后，在30μl/分钟的流速下 注入10mM甘氨酸/HCl pH 1.5的重生溶液60秒，以去除任何非共价结合 的蛋白质。当使用RNA酶作为配体时，通过以5μl/分钟注入0.85％H₃PO₄60秒和然后以5μl/分钟注入5mM NaOH 60秒进行重生。以每秒1个信号 的速率检测信号。

这些分析的结果在图11(鼠类<Dig>19-11的结果在图10中)中示范 显示并总结于表3，结果表明，在应用的双特异性融合蛋白(Her2-Dig， 见实施例3)中存在的重组人源化<Dig>scFv模块以与鼠类亲本抗体相同 的功能和高亲和力结合地高辛配基化的蛋白质和核酸。发现鼠类抗体针对 地高辛配基化蛋白质(Dig-BP4)的Kd是33pM，而人源化单链Fv的Kd 是68pM。类似地，发现鼠类抗体针对地高辛配基化核酸(siRNA-Dig，见 实施例11)的kd是269pM，而人源化单链Fv的Kd是35nM。因此，我 们推断，在双特异性融合蛋白(Her2-Dig，见实施例3)中存在的重组人 源化<Dig>scFv模块中也保留了野生型抗体的功能。

杂交瘤来源的鼠类<Dig>19-11与重组人源化<Dig>-二硫化物稳定的单链Fv融合蛋白的比较

以与实施例4的介绍中所描述的相同的方式在CM5生物传感器芯片的 表面固定抗小鼠和抗人IgG抗体。在这些测定中，当加入DIG-RNA酶作为 配体时，通过以2μg/ml注入在芯片表面固定抗人IgG抗体，这产生约600 RU的表面密度。在HBS-P中稀释待分析的样品，并以5μl/分钟的流速注 入。对浓度在1-10nM之间的抗体，接触时间(结合期)为3分钟。为了 测量结合亲和力，以增加的浓度注入不同的地高辛配基化抗原，即 DIG-siRNA在0.018-120nM之间。为了显示结合，对每种Raze以50nM的 浓度一式两份注入不同的地高辛配基化RNA酶(人和牛)。对每种分子接触 时间(结合期)是3分钟，解离时间(用运行缓冲液洗涤)是5分钟，以 30μl/分钟的流速。所有相互作用在25℃(标准温度)下进行。在每轮结 合循环后，在30μl/分钟的流速下注入10mM甘氨酸/HCl pH 1.5的重生 溶液60秒，以去除任何非共价结合的蛋白质。以每秒1个信号的速率检测 信号。

这些分析的结果在图12(鼠类<Dig>19-11的结果在图10中)中示范 显示并总结于表3，结果表明，在应用的双特异性融合蛋白(Her2-Dig， 见实施例3)中存在的重组二硫化物稳定的人源化<Dig>scFv模块以与鼠 类亲本抗体相同的功能和高亲和力结合地高辛配基化的核酸。发现鼠类抗 体针对地高辛配基化核酸(siRNA-Dig，见实施例11)的kd是269pM，而 二硫化物稳定的人源化<Dig>scFv模块的Kd是32nM。因此，我们推断， 在双特异性融合蛋白(Her2-Dig，见实施例3)中存在的重组二硫化物稳 定的人源化<Dig>scFv模块中也保留了野生型抗体的功能。

杂交瘤来源的鼠类<Dig>19-11与重组鼠类<Dig>-二硫化物稳定的单链Fv融合蛋白的比较

在HBS-P中稀释待分析的样品，并以5μl/分钟的流速注入。对浓度 在1-5nM之间的抗体，接触时间(结合期)为3分钟。为了测量结合亲和 力，以增加的浓度注入不同的地高辛配基化抗原，即DIG-BP4的浓度是 0.3125，0.625，1.25，2.5，5和10nM，DIG-siRNA是0.018-120nM之 间。对每种分子接触时间(结合期)是3分钟，解离时间(用运行缓冲液 洗涤)是5分钟，以30μl/分钟的流速。所有相互作用在25℃(标准温度) 下进行。在每轮结合循环后，在30μl/分钟的流速下注入10mM甘氨酸/HCl pH 1.5的重生溶液60秒，以去除任何非共价结合的蛋白质。以每秒1个 信号的速率检测信号。

这些分析的结果在图13(鼠类<Dig>19-11的结果在图10中)中示范 显示并总结于表3，结果表明，在应用的双特异性融合蛋白(Her2-Dig， 见实施例3)中存在的重组鼠类二硫化物稳定的<Dig>scFv模块以与鼠类 亲本抗体相同的功能和高亲和力结合地高辛配基化的核酸。发现鼠类抗体 针对地高辛配基化核酸(siRNA-Dig，见实施例11)的kd是269pM，而二 硫化物稳定的鼠类<Dig>scFv模块的Kd是467pM。因此，我们推断，在 双特异性融合蛋白(Her2-Dig，见实施例3)中存在的重组鼠类二硫化物 稳定的<Dig>scFv模块中也保留了野生型抗体的功能。

表3：鼠类“野生型”DIG-IgG和重组<Dig>衍生物与不同地高辛配基 化抗原的结合亲和力

进行了另一个SPR研究，其中比较了<DIG>-hu2，IGF1R-DIG和 <DIG>M-19-11在结合单地高辛配基化蛋白DIG-肌红蛋白方面的结合亲和 力。<DIG>-hu2和二硫化物稳定的<DIG>scFv与DIG-Myo的结合亲和力相 当(～15-25nM)，且也显示了鼠类<DIG>M-19-11与单地高辛配基化核酸(见 上)结合的约100倍高的亲和力。与其针对DIG-肌红蛋白(见表3a)的亲 和力相比，<DIG>-hu2针对DIG-BP4(＜76pM，见表3)和二硫化物稳定的 <DIG>scFv针对DIG-BP4(68pM，见表3)的显著更高的亲和力很可能是 由于与DIG-BP4结合的亲合力效应，因为DIG-BP4蛋白在其表面携带1个 以上的DIG分子。

表3a

可以产生不同形式的双和多特异性地高辛配基结合实体

可以多种形式将地高辛配基结合模块与细胞靶向实体连接。例如，为 此不仅可应用“经典的”抗体片段和抗体衍生模块例如Fab或Fv，而且可 应用以前在文献中描述的单结构域的类似抗体的实体。除了C-端融合至H 链(在图6中示范描述并用作许多分析的实例)以外，在我们的实验室中 还产生了另外的形式并进行了功能评估。图47a显示了基于全长IgG作为 主分子的分子的选择，生成所述分子以实现半抗原介导的至抗原表达靶细 胞的有效负载递送。这些分子包括，例如，(二硫化物稳定的)scFv与IgG L链的C-端的融合，单链Fab与CH3或C-κ的C-端的融合，scFv(和/或 scFab)与L链以及H链的融合，以产生六价分子。此外，成功产生了三价 实体，其包括含有二硫化物稳定的Fv和没有单链接头的三价实体，且所述 三价实体可用于半抗原介导的有效负载递送。另外，生成了包含融合的荧 光蛋白的双特异性实体。用于生成不同形式的氨基酸序列列于SEQ ID NO 38-SEQ ID NO 45。可在哺乳动物细胞中表达所有分子，并使用标准蛋白 质A和大小排阻技术纯化，并具有良好的产量(见实施例3“重组人源化 <Dig>抗体、片段和双特异性融合蛋白的组成、表达和纯化”)。

图47b和c显示了与基于全长IgG作为主分子相比尺寸较小的分子的 选择。这些分子由较小的抗体片段组成，但也是为了实现半抗原介导的至 抗原表达靶细胞的有效负载递送而产生。较小的模块可具有更高的组织和 肿瘤渗透性，并且与I gG衍生的实体相比具有不同的药物代谢动力学。小 分子的模块组成还允许加入和重组表达其他模块，例如用于结合生物素的 模块(例如链霉抗生物素或抗生物素)，或可利于进入细胞的实体(例如病 原体的移位结构域)。用于生成不同形式的氨基酸序列列于SEQ ID NO 46- SEQ ID NO 50。可表达所有这些分子并通过亲和层析和大小排阻技术纯化 以用于进一步的表征。

图47c)-47o)显示，所有这些不同形式的分子完全保留了用于有效 负载递送的先决条件，即靶向特异性以及地高辛配基结合能力：这通过表 面等离子共振(BiaCore)实验(详见实施例4“重组<Dig>抗体、片段和 双特异性融合蛋白与地高辛配基化抗原的结合”)和FACS分析(详见实施 例10“地高辛配基化Cy5和与<靶><Dig>双特异性抗体的复合物保留了可 用于体外和体内成像的靶特异性结合和荧光特征”)证明。这些实验的结果 在图47c)-47o)中显示，并证明与地高辛配基的结合能力和用作重组模 块的亲本地高辛配基结合部分相当。此外，在不同形式中也无损地保留了 识别靶向抗原的特异性。因此，多种不同形式可用作半抗原介导的靶向有 效负载递送的载体。

实施例5地高辛配基化肽与双特异性<Her2>-<Dig>和<IGF1R>-<Dig>的确定的复合物的产生

地高辛配基化肽与包含重组Dig结合模块的双特异性抗体衍生物的复 合物可赋予肽良好的生物物理表现和改进的PK参数。此外，这些复合物能 够将肽靶向展示由双特异性抗体变体识别的抗原的细胞。这些复合物由人 源化<靶><Dig>IgG组成，在其两个高亲和力的Dig结合位点上结合2个 (每个位点1个)地高辛配基化肽。希望肽被地高辛配基化以及与抗体复 合后仍然保留良好的生物学活性。还希望双特异性抗体衍生物的细胞表面 靶结合位点在复合的地高辛配基化肽的存在下，保留其结合特异性和亲和 力。

在评估此技术中，我们用作范例的肽是蜂毒素(Melittin)，INF7， FALLLv1，FALLv2和Fam5b。后3种肽已在筛选人源的生物活性肽中被鉴定 (将分别描述)。可通过体外测定肽对人肿瘤细胞系的细胞毒性作用，评估 肽的生物学活性。

这些肽的氨基酸序列如下：

蜂毒素：GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(Seq.ID.NO.17)

FALLv1：FALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(Seq.ID.NO.18)

FALLv2：NKRFALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPR(Seq.ID.NO.19)

Fam5b：QHRYQQLGAGLKVLFKKTHRILRRLFNLAK(Seq.ID.NO.20)

INF7：GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG(SEQ.ID.NO.21)

地高辛配基化肽与双特异性<靶><Dig>抗体变体的双特异性复合物可 用于将肽特异性靶向表达靶抗原的细胞。因此，肽将选择性处理通过表面 抗原识别的细胞，肽介导的细胞毒性应该在表达抗原的细胞上增强。

为了产生这样的用于选择性靶向的双特异性抗体复合物，必须(i)通 过合适的接头将地高辛配基与肽以允许肽保留其活性的方式连接；(ii)产 生和表征地高辛配基化肽与双特异性<靶><Dig>IgG的复合物。这些复合物 应当以确定的方式形成(2个Dig肽结合1个<Dig>Ig)。(iii)确保这些 复合物保留肽的活性以及靶向抗体的特异性和亲和力，以介导在表达靶向 抗原的细胞上的提高的(特异性)肽介导的生物学活性。

用于地高辛配基缀合的具有氨基端半胱氨酸的肽的产生

根据已建立的方案(FastMoc 0.25mmol)在自动化的Applied  Biosystems ABI 433A肽合成仪中使用Fmoc化学进行肽合成。在迭代循环 中，通过相应的Fmoc-氨基酸的相继连接组装肽序列。在每一个连接步骤 中，通过用N-甲基吡咯烷酮中的20％哌啶处理树脂(3x2.5分钟)去除N- 端Fmoc基团。使用通过在DMF中的HBTU/HOBt(每种1mmol)和DIPEA(2 mmol)活化的Fmoc保护的氨基酸(1mmol)进行连接(45-60分钟涡旋)。在 每一个连接步骤后，通过用在NMP中的Ac2O(0.5M)，DIPEA(0.125M) 和HOBt(0.015M)的混合物处理，对未反应的氨基加帽。在每一步之间， 用N-甲基吡咯烷酮和DMF充分洗涤树脂。在自动化的双连接中实现位阻氨 基酸的参入。为了此目的，用1mmol活化的构件处理树脂2次，在连接循 环之间没有加帽步骤。在完成靶序列后，使用标准氨基酸连接条件，将 Fmoc-12-氨基-4，7，10-三氧杂十二酸(TEG间隔物)与FAM5B和INF7肽连 接。随后，将Fmoc-Cys(Trt)-OH连接至所有肽序列(FAM5B和INF7有间 隔物，蜂毒素、FALLv1和FALLv2无间隔物)的氨基端。在最终的Fmoc去 保护后，将肽树脂置于烧结玻璃滤器(filter frit)并用三氟醋酸、水和 三异丙基硅烷的混合物(19mL∶0.5mL∶0.5mL)处理2.5小时。过滤 切割溶液并加入冷的(0℃)二异丙醚(300mL)沉淀肽，从而得到无色固体并 用二异丙醚重复洗涤。在醋酸/水混合物中重新溶解粗产物，冻干并之后使 用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Cromolith prep RP-18e柱，100x25 mm)，通过制备型反相HPLC纯化。

具有氨基端半胱氨酸的肽与地高辛配基的连接

对在0.1M KPO₄缓冲液(1mL)中的相应的半胱氨酸修饰肽(6-20mg)溶 液加入等摩尔量的溶于100μL DMF的地高辛配基-3-羧基-甲基-乙基酰胺 (ethylamido)马来酰亚胺。在环境温度下轻轻地翻滚反应混合物2-20 小时，过滤，并使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Cromolith prep RP-18e柱，100x25mm)通过制备型反向HPLC分离靶化合物。冻干后得到 无色固体形式的地高辛配基-肽缀合物。

蜂毒肽的分子量是2949.64，得到的肽-Dig缀合物的分子量是 3520.33。FALLv1肽的分子量是4710.59，得到的肽-Dig缀合物的分子量 是5384.43。FALLv2肽的分子量是4791.76，得到的肽-Dig缀合物的分子 量是5465.59。Fam5b肽的分子量是3634.37，得到的肽-Dig缀合物的分子 量是5410.47。INF7肽的分子量是2896.25，得到的肽-Dig缀合物的分子 量是3466.94。我们将缀合物分成小份溶解在H2O中并储存于-20℃，直到 与抗体复合。图14图解显示了肽-地高辛配基复合物的组成。

地高辛配基化肽与重组<靶>-<Dig>双特异性抗体的复合

使用重组<IGF1R>-<Dig>双特异性抗体和<Her2>-<Dig>双特异性抗体 作为连接反应的蛋白质成分。在实施例1中已描述了这些分子的组成和纯 化。

为了产生地高辛配基化肽与<IGF1R>-<Dig>和<Her2>-<Dig>双特异性 抗体的复合物，我们将(蜂毒素，INF7，FALLv1，FALLv2，Fam5b)肽-Dig 缀合物溶于水，得到1mg/ml的终浓度。将双特异性抗体在20mM组氨酸，140 mM NaCl，pH＝6.0的缓冲液中溶为1mg/ml(4.85μM)的浓度。通过上下吹 吸将肽和双特异性抗体混合至2∶1的摩尔比(肽∶抗体)，并在室温孵育 15分钟。然后，在体外测定中使用复合物，没有进一步的修饰。用于这些 测定，在Opti-MEM 1(Invitrogen Madison，WI)中进行复合物的稀释。

将得到的复合物定义为每个抗体衍生物携带2个Dig-肽的单体IgG样 分子。这些双特异性肽复合物的确定的组成(和2∶1的肽与蛋白质的比例) 通过大小排阻层析和装载/竞争实验验证。

实施例6：地高辛配基化肽和与<靶>-<Dig>双特异性抗体的复合物保留靶特异性结合和生物学活性

任何致力于生物活性化合物的特异性靶向的技术需要解决的一个非常 重要的问题是，应当保留所述化合物的生物学活性。此外，靶向模块的特 异性和活性不应受有效负载的连接的影响。我们描述的双特异性抗体技术 携带2个生物活性肽的调制步骤，其中之一也修饰靶向模块。在第一步中， 我们将地高辛配基共价连接至生物活性肽。在第二步中，此地高辛配基化 肽与双特异性抗体衍生物(其为大蛋白)复合。为了保留肽的活性，重要 的是确保修饰肽在这两步中的活性：活性测定需要显示，(i)在地高辛配 基化后保留了肽的功能，和(ii)在地高辛配基化肽与鼠类或人源化<Dig> 复合后保留功能。最后，必须显示(iii)在最终的复合物中仍然保留靶向 模块的结合特异性和亲和力。

未修饰的和地高辛配基化的细胞毒性肽的生物学活性的比较

为了评估蜂毒素，FALLv1和FALLv2肽的地高辛配基加入或改变是否 改变了其生物学活性，我们进行了体外测定。由于这些肽是细胞毒性的， 其生物学活性可容易地通过监控死细胞数而分析。为了测量此数值，使用 CytoTox-Glo测定(Promega Madison，WI)。

图15显示了用于评估蜂毒素，Fallv1和Fallv2肽及其DIG修饰变体 的生物学活性而进行的这些CytoTox-Glo测定的结果。用于这些测定，以 每孔15,000细胞的密度在96孔板中接种H322M细胞。在含有10％FCS，丙 酮酸钠，L-谷氨酰胺和NEAA混合物的RPMI中在37℃，5％CO2和85％湿度 下培养细胞24小时。然后以指示的浓度对细胞加入肽及其DIG-修饰变体。 再孵育细胞48小时。然后，用CytoTox-Glo测定试剂根据制造商的说明书 处理细胞。简而言之，此测定通过在培养基中存在的蛋白酶检测死细胞， 所述蛋白酶在试剂中切割出荧光肽。因此，此测定的荧光代表死细胞。然 后在InfiniteF200荧光读板器(Tecan Austria，)中分析96孔板。

这些测定的结果(图15，总结于表4)显示，当与非修饰的肽比较时， 地高辛配基化肽保留其生物学活性。CytoTox-Glo测定的IC50值对未修饰 的肽是3.28μM，对地高辛配基化肽蜂毒素是3.98μM。在与地高辛配基缀 合后类似地保留了Fallv1和Fallv2的活性(表4)。因此，地高辛配基化 没有影响生物学活性。我们推断，蜂毒素，FALLv1和FALLv2肽的地高辛 配基化没有影响其生物学活性。

与地高辛配基化抗体复合的肽的生物学活性对抗原表达肿瘤细胞的特异性靶向

不仅是肽与半抗原的共价连接可能影响其生物学活性，而且肽与双特 异性抗体大分子的复合也可能影响其生物学活性。因为IgG衍生的双特异 性分子是大蛋白(肽的10-40倍大)，不能先验地排除这些分子可能在空间 上阻碍肽的可及性并因此影响其生物学活性。反过来，肽复合物有可能影 响双特异性抗体衍生物中的靶向模块的特异性抗原结合功能。为了解决这 些问题，我们分析了抗体-肽复合物的特异性抗原结合功能，以及肽-抗体 复合物对表达抗原的肿瘤细胞系的体外活性。

为了测定复合物的抗原结合功能，我们应用表面等离子共振。由于肽 的低分子量，需要更高的表面密度以在结合时达到有效的信号高度。因此， 创造了特殊的芯片表面以评估重组<Dig>衍生物与Dig-肽的功能。以5μl/ 分钟的流速用1∶1的0.1M N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M3-(N，N-二甲基氨 基)丙基-N-乙基碳二亚胺混合物活化细胞池。在5μg/ml的醋酸钠pH 5.0 中注入抗-人IgG抗体以得到约2000RU的表面密度。同样地处理参考对照 流动池，省略捕获抗体。注入1M乙醇胺/HCl pH 8.5封闭表面。

抗原和地高辛配基化肽与<靶><DIG>双特异性抗体的加成结合

用于这些Biacore实验，应用重组产生的RTK IGF1R的可溶性胞外结 构域以表征<IGF1R>-<Dig>-Dig-肽复合物。为了显示对地高辛配基化肽的 加成结合，使用地高辛配基化INF7(SEQ.ID.NO.21)和FALLv1(SEQ.ID. NO.18)。在包含0.1％BSA的HBS-P(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl， 0.005％表面活性剂P20)中稀释抗体，并以10μl/分钟的流速注入。对50nM 浓度的抗体，接触时间(结合期)是1分钟。对于DIG-INF7以50nM的浓 度使用地高辛配基化INF7，以90nM的浓度使用地高辛配基化FALLv1。以 50nM的浓度使用可溶性IGF1R片段。在HBS-P(10mM HEPES，pH 7.4，150 mM NaCl，0.005％表面活性剂P20)中稀释地高辛配基化肽和sIGF1R，并以 10μl/分钟的流速注射添加。对每个分子，接触时间(结合期)是3分钟， 解离时间(用运行缓冲液洗涤)是3分钟。在每个结合循环后，以10μl/ 分钟流速注入0.85％H3PO4的重生溶液120秒，接着以10μl/分钟流速注 入10mM NaOH 120秒以去除任何非共价结合的蛋白质。以每秒1个信号的 速率检测信号。所有相互作用在25℃下进行。这些测定结果(图16)显示， 具有地高辛配基化肽的IgG复合物保留了对细胞表面抗原的结合特异性和 亲和力，与结合顺序无关。

为了分析<Her2>-<Dig>-Dig-肽复合物和<IGF1R>-<Dig>-Dig-肽复合 物是否介导其有效负载特异性靶向表达抗原的细胞，我们利用FALLv1和 Fam5b肽具有细胞毒性的事实。通过监控死细胞数，我们因此能够比较DIG- 肽和靶向的DIG-肽-<Her2>-<Dig>复合物的生物学活性。为了测量死细胞 数，使用CytoTox-Glo测定(Promega Madison，WI)。为了分析靶向特异性， 使用2种细胞系：具有低水平的表面Her2的H322M，和具有高水平的表面 Her2的KPL4。

用于这些测定，以每孔15,000细胞的密度在96孔板中接种H322M 细胞。在含有10％FCS，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺和NEAA混合物的RPMI中在 37℃，5％CO2和85％湿度下培养细胞24小时。以每孔7,000细胞的密度 在96孔板中接种KPL4细胞。在含有10％FCS和L-谷氨酰胺的RPMI中在37 ℃，5％CO2和85％湿度下培养细胞24小时。然后以指示的浓度对细胞加入 DIG-肽和DIG-肽-<Her2>-<Dig>复合物。再孵育细胞48小时。然后，用 CytoTox-Glo测定试剂根据制造商的说明书处理细胞。简而言之，此测定 通过在培养基中存在的蛋白酶检测死细胞，所述蛋白酶在试剂中切割出荧 光肽。因此，此测定的荧光代表死细胞。然后在InfiniteF200荧光读板器 (Tecan Austria，)中分析96孔板。

这些测定结果(图17)显示，具有地高辛配基化肽的IgG复合物赋予 对表达抗原的细胞的细胞毒性：当比较<Her2>-<Dig>双特异性抗体递送至 H322M和KPL4细胞的DIG-FALLv1的细胞毒性时，总是发现其对表达更高 水平表面抗原的细胞毒性更高。<Her2>-<Dig>双特异性抗体递送的 DIG-Fam5b肽的细胞毒性也与表面抗原的水平相关。这些结果显示，当被 合适的双特异性抗体递送时，细胞毒性肽在表达抗原的细胞上特异性富集。

当比较DIG肽的细胞毒性和由合适的DIG双特异性AB递送至表达抗原 的细胞的DIG肽的细胞毒性时(图18)，总是发现被递送的肽赋予更高的 细胞毒性：与使用未复合的肽相比，FALLv1肽的<Her2>-<Dig>复合物针对 表达抗原的靶细胞的细胞毒性更高。与非递送的对照肽相比，当Fam5b肽 被递送至抗原阳性靶细胞时，其细胞毒性也更高。这显示肽复合物在表达 抗原的靶细胞上特异性富集(并因此介导对其更高的生物学活性)。

表4

  分子   IC50未修饰的肽   IC50Dig-肽   蜂毒素   3.3uM   4.0uM   FALLv2   9.3uM   7.6uM   FALLv1   7.4uM   6.4uM

实施例7：地高辛配基化小化合物与双特异性<Her2>-<Dig>和<IGF1R>-<Dig>的确定的复合物的产生

地高辛配基化小化合物与包含重组Dig结合模块的双特异性抗体衍生 物的复合物可赋予小化合物良好的生物物理性质和改进的PK参数。此外， 这样的复合物能够将化合物靶向展示被双特异性抗体变体识别的抗原的细 胞。这些复合物由一个人源化<靶><Dig>IgG组成，所述IgG在其两个高 亲和力的Dig结合位点上结合2个(每个位点1个)地高辛配基化化合物。 希望化合物被地高辛配基化以及与抗体复合后仍然保留良好的生物学活 性。还希望双特异性抗体衍生物的细胞表面靶结合位点在复合的地高辛配 基化化合物的存在下，保留其结合特异性和亲和力。在评估此技术中，我 们用作范例的小化合物是阿霉素。阿霉素和地高辛配基化阿霉素 (＝Dig-Dox)的生物学活性可通过体外测定对人肿瘤细胞系的细胞毒性作 用评估。

地高辛配基化阿霉素与双特异性<靶>-<Dig>抗体变体的双特异性复合 物可用于将阿霉素特异性靶向表达靶抗原的细胞。因此，阿霉素将处理通 过表面抗原识别的细胞。因此，阿霉素介导的细胞毒性应该在表达抗原的 细胞上增强。

为了产生这样的用于选择性靶向的双特异性抗体复合物，必须(i)通 过合适的接头将地高辛配基与阿霉素以允许阿霉素保留其活性的方式连 接；(ii)产生和表征地高辛配基化阿霉素与双特异性<靶><Dig>IgG的复 合物。这些复合物应当以确定的方式形成(2个Dig-阿霉素结合1个 <Dig>Ig)。(iii)确保这些复合物保留阿霉素的活性以及靶向抗体的特异 性和亲和力，以介导在表达靶向抗原的细胞上的阿霉素介导的特异性生物 学活性。

地高辛配基化阿霉素的产生

从Sigma-Aldrich获得阿霉素。为了连接地高辛配基与阿霉素，我们 进行了以下程序：对在DMF(500μL)中的地高辛配基-3-O-甲基羰基-ε- 氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(20mg，30.4μmol)溶液加入三乙胺(8.4 μL，60.8μmol)，并将得到的混合物立刻转移至在DMF(500μL)中的 阿霉素-HCl溶液中。在环境温度下翻滚反应混合物2小时，过滤，并使用 包含0.1％TFA的乙腈/水梯度，通过制备型反相HPLC(Merck Cromolith prep  RP-18e柱，100x25mm)分离靶化合物。在冻干后，得到无色固体形式(25.2 mg，76％)的阿霉素-地高辛配基缀合物。分析型HPLC：tR＝13.9分钟(Merck  Chromolith Performance RP-18e，100x4.6mm，水+0.1％TFA  乙腈/ 水+0.1％TFA 80∶20，25分钟)；ESI-MS(阳离子模式)：m/z：对 C58H75N2O18，计算：1087.5；实测：1087.6[M+H]+。阿霉素的分子量是 579.98Da。得到的阿霉素-Dig缀合物的分子量是1087.24Da。我们将缀 合物在DMSO中分成小份储存于-20℃，直到与抗体复合。图18显示了阿霉 素-地高辛配基缀合物的结构。

地高辛配基化阿霉素与重组<靶-Dig>双特异性抗体的复合

使用重组<IGF1R>-<Dig>双特异性抗体和<Her2>-<Dig>双特异性抗体 作为连接反应的蛋白质成分。在实施例1中已描述了这些分子的组成和纯 化。

为了产生地高辛配基化阿霉素和<IGF1R>-<Dig>和<Her2>-<Dig>双特 异性抗体的复合物，我们将阿霉素-Dig缀合物在包含1％乙腈和0.1％DMSO 的OptiMEM(Invitrogen)中溶解为0.1mg/ml的终浓度。以1mg/ml(5μM) 的浓度在由20mM组氨酸和140mM NaCl，pH 6组成的缓冲液中使用双特异 性抗体。以2∶1的摩尔比例(地高辛配基化阿霉素∶抗体)混合地高辛配 基化阿霉素和双特异性抗体。此程序得到确定组成的复合物的同质制品。 之后，在下述细胞活力测定中使用此制品。

图19显示了地高辛配基化阿霉素和<Her2>-<Dig>的复合物的大小排 阻谱。通过增加至高达每个蛋白质分子至少1个DIG-dox分子的荧光信号 显示增加的装载(蛋白质复合物大小的信号)。之后，加入更多的DIG-dox 分子不能以线性的方式提高蛋白质位置上的信号，但也没有出现预期的未 结合的DIG-dox信号，可能是由于与柱材料的非特异性结合。我们从这些 实验中推断，Dig-dox和双特异性抗体的复合物由包含至少1个LMW化合 物/蛋白质的分子组成。

通过使用表面等离子共振研究(Biacore，见上文的实施例4)的对复 合物的进一步表征提供了另外的证据，证明复合反应产生了完全保留双特 异性抗体模块的特异性结合亲和力的确定分子。

实施例8：地高辛配基化阿霉素和与<靶-Dig>双特异性抗体的复合物保留靶特异性结合和生物学活性

任何致力于生物活性化合物的特异性靶向的技术需要解决的一个非常 重要的问题是，应当保留所述化合物的生物学活性。此外，靶向模块的特 异性和活性不应受有效负载的连接的影响。我们描述的双特异性抗体技术 携带2个生物活性化合物的调制步骤，其中之一也修饰靶向模块。在第一 步中，我们将地高辛配基共价连接至阿霉素。在第二步中，此地高辛配基 化阿霉素与双特异性抗体衍生物(其为大蛋白)复合。为了保留阿霉素的 活性，重要的是确保修饰的阿霉素在这两步中的活性：活性测定需要显示， (i)在地高辛配基化后保留了阿霉素的功能，和(ii)在最终的复合物中 仍然保留靶向模块的结合特异性和亲和力。

未修饰的和地高辛配基化的阿霉素的生物学活性的比较

为了评估阿霉素的地高辛配基化是否改变了其生物学活性，我们在存 在阿霉素或地高辛配基化阿霉素的情况下培养的不同的细胞系中进行了生 物测定。然后分析细胞活力。图20、21和48a显示了这些我们进行的用于 评估阿霉素和地高辛配基化阿霉素的生物学活性的细胞活力测定的结果。 用于这些测定，我们接种了KPL-4，H322M或MDA-MB-468细胞并让它们粘 附在板上过夜。第二天，用指示浓度的阿霉素或地高辛配基化阿霉素处理 细胞，持续48小时。然后，裂解细胞，并使用CellTiter Glo荧光细胞 活力测定(Promega，Madison，WI)评估细胞活力。这些测定的结果(图20、 21和48a)显示，地高辛配基化阿霉素当与H332M细胞孵育时保留了部分 其生物学活力。KPL-4细胞在暴露于所使用浓度的地高辛配基化阿霉素后， 没有显示任何影响。当与H322M细胞孵育时，细胞活力测定的IC50值对未 修饰的阿霉素是25μM，对地高辛配基化阿霉素是＞1000μM。在KPL-4 细胞的情况下，细胞活力测定的I C50值对未修饰的阿霉素是2.6μM，和 对地高辛配基化阿霉素是＞1000μM。当与MDA-MB-468细胞孵育时，细胞 活力测定的IC50值对未修饰的阿霉素是17μM，对地高辛配基化阿霉素 是＞1000μM。这指示在用地高辛配基修饰后，阿霉素活力的显著丢失。此 降低的活性的原因不是功能的丢失，而是地高辛配基化阿霉素在细胞膜渗 透方面受到限制。此分子比原始的阿霉素大得多，因此不容易穿透生物膜。 此限制通过实验在图22中显示：免疫荧光显示阿霉素穿透膜并聚集在细胞 核中的其作用位点。相反地，大部分地高辛配基化阿霉素在接触细胞后聚 集在内体中，因此没有到达其在细胞中的作用位点。然而，地高辛配基化 阿霉素的分子功能仍然得到保留。这可通过共同应用内体逃逸试剂来证明， 这允许地高辛配基化阿霉素进入细胞质和细胞核，并因此大大增强了细胞 毒性(见下文)。

地高辛配基化-抗体复合的阿霉素的生物学活性对表达抗原的肿瘤细胞的特异性靶向

为了分析抗体-复合物的特异性抗原结合功能是否可用于特异性递送 有效负载活性至肿瘤细胞，我们进行了免疫荧光研究和随后的体外细胞毒 性测定，以测定靶向的阿霉素的生物学活性。可通过免疫荧光，通过用514 nm的激光激发，同时在520-560nm波长之间检测发射，显像Dig-Dox。因 此我们能够光学地显像细胞上与<IGF1R>-<DIG>复合的dig-dox的靶向和 聚集。图22显示了表达IGF1R的MCF7细胞的免疫荧光分析，在细胞表面 上聚集了IGF1R-DIG和Dig-Dox复合物。这些研究的结果指示，dig-dox 通过双特异性抗体的靶向部分被特异性递送至靶细胞。

为了进一步分析<Her2>-<Dig>-Dig-Dox复合物和 <IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox复合物是否介导其(细胞毒性)有效负载特异性 靶向表达抗原的细胞，我们接种了确定数目的KPL-4(Her2+++)，H322M (IGF1R+++)和MDA-MB-468(Her2+/-)细胞并让它们粘附在板上过夜。第二 天，用指示浓度的<Her2>-<Dig>-Dig-Dox或<IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox复合 物处理细胞，持续48小时。然后，使用CellTiter Glo荧光细胞活力测 定(Promega，Madison，WI)评估细胞活力。

这些测定的结果(图20、21和48b)显示了具有地高辛配基化阿霉素 的IgG复合物赋予对表达抗原的细胞的细胞毒性：Dig-Dox/<Her2>-<Dig> 复合物对表达Her2的Kpl-4靶细胞的IC50值是5.9μM，而对靶阴性 MDA-MB-468细胞，Dig-Dox和<Her2>-<Dig>复合物相比没有任何有效负载 的<Her2>-<Dig>没有赋予高得多的细胞毒性。类似地， Dig-Dox/<IGF1R>-<Dig>复合物对表达IGF1R的H322M靶细胞的IC50值是 5.8μM。在两种靶细胞系(KPL-4和H322M)中都显示，装载Dig-Dox的靶 向抗体比以相同浓度使用的未装载的抗体具有更强的细胞毒性。我们推断， <靶>-<Dig>双特异性抗体衍生物能够特异性递送细胞毒性有效负载至靶向 模块识别的细胞。

图48显示了地高辛配基化阿霉素与<Dig>双特异性抗体的另一个靶向 实验的结果。这些实验包括另一种乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-468。在这些测 定中，我们如上所述增殖KPL-4，H322M或MDA-MB-468细胞并将其铺在板 上，然后用指示浓度的阿霉素或地高辛配基化阿霉素处理细胞48小时。使 用CellTiter Glo荧光细胞活力测定(Promega，Madison，WI)的细胞活力 测定(图48a和b)验证了，当地高辛配基化阿霉素与MDA-MB468细胞孵 育时丢失了其大部分生物学活性。此表型与在KPL-4和H322M细胞中观察 到的非常类似(见上文)。在MDA-MB-468细胞上的IC50值对非修饰的阿霉 素是17μM，对地高辛配基化阿霉素是＞1000μM。在图48c-e中显示了 另一个实验，此实验研究了递送与双特异性靶向模块复合的地高辛配基化 阿霉素的可能性：如上所述，用<Her2>-<Dig>-Dig-Dox或 <IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox复合物处理KPL-4(Her2+++)，H322M(IGF1R+++) 和MDA-MB-468(Her2+/-)细胞48小时。然后，使用CellTiter Glo荧光 细胞活力测定(Promega，Madison，WI)评估细胞活力。这些测定的结果验 证了，具有地高辛配基化阿霉素的IgG复合物赋予对表达抗原的细胞的细 胞毒性。在2种表达her2或IGF1R的靶细胞系(KPL-4和H322M)中显示， 装载Dig-Dox的靶向抗体比以相同浓度使用的未装载的抗体具有更强的细 胞毒性。相反地，对靶阴性MDA-MB-468细胞，Dig-Dox和<Her2>-<Dig>复 合物相比没有任何有效负载的<Her2>-<Dig>没有赋予明显更高的细胞毒 性。我们推断，<靶>-<Dig>双特异性抗体衍生物能够特异性递送细胞毒性 有效负载至靶向模块识别的细胞。

实施例9：地高辛配基化荧光底物与双特异性<Her2>-<Dig>和<IGF1R>-<Dig>的确定复合物的产生

地高辛配基化荧光底物与包含重组Dig结合模块的双特异性抗体衍生 物的复合物可用于携带靶抗原的组织或细胞的特异性成像。这些复合物由 一种人源化<靶>-<Dig>IgG组成，所述IgG在其两个高亲和力的Dig结合 位点上结合2个(每个位点1个)可通过成像技术显像的地高辛配基化底 物。成像化合物被地高辛配基化以及与抗体复合后必须保留其性能(荧光)。 还希望双特异性抗体衍生物的细胞表面靶结合位点在复合的Dig-化合物 的存在下，保留其结合特异性和亲和力。

在评估此技术中，我们用作范例的成像化合物是Cy5。Cy5是一种荧光 底物，其被575-633nm之间的波长激发，并在激发后其发射近红外光谱 的670nm波长的光。因此，可通过荧光显微镜以及通过体内成像技术评估 Cy5和地高辛配基化Cy5(＝Dig-Cy5)的存在。地高辛配基化Cy5与双特异 性<靶>-<Dig>抗体变体的双特异性复合物可用于将Cy5特异性靶向表达靶 抗原的细胞。因此，通过表面抗原识别的细胞可通过Cy5显像，并因此与 不携带靶抗原的细胞区分开。

为了产生这样选择性靶向成像试剂的双特异性抗体复合物，必须(i) 通过合适的接头以允许Cy5保留其荧光特征的方式连接地高辛配基和Cy5； (ii)产生和表征地高辛配基化Cy5与双特异性<靶>-<Dig>IgG的复合物。 这些复合物应当以确定的方式(2个Dig-Cy5结合1个<Dig>IgG)形成。 (iii)确保这些复合物保留Cy5的活性以及靶向抗体的特异性和亲和力， 以介导表达靶向抗原的细胞的特异性Cy5显像。

地高辛配基化Cy5的产生

为了产生地高辛配基化Cy5，用单环内酰胺(monobac)乙二胺转化DIG- 羧甲基-NHS酯(DE 3836656)。然后去除boc并允许释放出的胺与Cy5-NHS 酯(GE Healthcare，PA15106)反应。为了纯化DIG-Cy5，进行HPLC，使用 RP 18柱。洗脱液A是包含0.1％TFA的水，洗脱液B是包含0.1％TFA的 乙腈。在运行60分钟的洗脱期间，洗脱液B的浓度从0％增加至100％。

Cy5的分子量是791.99Da。得到的Cy5-Dig缀合物的分子量是1167.55 Da。我们将缀合物在PBS中分成小份储存于-20℃，直到与抗体复合。图 23显示了Cy5-地高辛配基缀合物的结构。

地高辛配基化Cy5与重组<靶-Dig>双特异性抗体的复合

使用重组<IGF1R>-<Dig>双特异性抗体和<Her2>-<Dig>双特异性抗体 作为连接反应的蛋白质成分。在实施例1中已描述了这些分子的组成和纯 化。

为了产生地高辛配基化Cy5与<IGF1R>-<Dig>和<Her2>-<Dig>双特异 性抗体的复合物，我们将Cy5-Dig缀合物在PBS中溶解为0.5mg/ml的终 浓度。在由20mM组氨酸和140mM NaCl，pH 6组成的缓冲液中以1mg/ml(5μM) 的浓度使用双特异性抗体。以2∶1的摩尔比例(地高辛配基化Cy5∶抗体) 混合地高辛配基化Cy5和双特异性抗体。此程序得到确定组成的复合物的 同质制品。之后，在如下所述的体外和体内成像研究中使用此制品。

图24显示了地高辛配基化Cy5和<Her2>-<Dig>的复合物的大小排阻 谱。通过增加至高达每个蛋白质分子2个DIG-Cy5分子的荧光信号显示增 加的装载(蛋白质复合物大小的信号)。如果将装载增加到最高每个蛋白质 分子5个DIG-Cy5分子，荧光信号不再增加，提示2个DIG结合位置以2∶ 1(DIG-Cy5∶<Her2>-<Dig>)的比例被饱和。相反地，没有<Dig>结合部分 的、针对<Her2>或<IGF1R>的抗体根本不结合DIG-Cy5(图49b)，指示 DIG-Cy5不与这些抗体非特异性结合。我们从这些实验中推断，Dig-Cy5 和双特异性抗体的复合物由包含2个Dig-Cy5化合物/蛋白质的分子组成。

通过使用表面等离子共振研究(Biacore，见上文的实施例4)的对复 合物的表征提供了另外的证据，证明复合反应产生了完全保留双特异性抗 体模块的特异性结合亲和力的确定分子。

对实验条件的进一步优化更清楚地显示了<Her2>-<Dig>和DIG-Cy5之 间的结合比例是1∶2。图49a和b显示了在优化了实验设置后，地高辛配 基化Cy5和<Her2>-<Dig>复合物的大小排阻谱和SEC评估。

通过增加至高达每个蛋白质分子2个DIG-Cy5分子的荧光信号显示增 加的装载(蛋白质复合物大小的信号)。如果将装载增加到最高每个蛋白质 分子5个DIG-Cy5分子，荧光信号不再增加，提示2个DIG结合位置以2∶ 1(DIG-Cy5∶<Her2>-<Dig>)的比例被饱和。相反地，没有<Dig>结合部分 的、针对<Her2>或<IGF1R>的抗体根本不结合DIG-Cy5(图49b)，指示 DIG-Cy5不与这些抗体非特异性结合。我们从这些实验中推断，Dig-Cy5 和双特异性抗体的复合物由包含2个Dig-Cy5化合物/蛋白质的分子组成。

实施例10：地高辛配基化Cy5和与<靶>-<Dig>双特异性抗体的复合物保留了可用于体外和体内成像的靶特异性结合和荧光特征

任何致力于生物活性化合物的特异性靶向的技术需要解决的一个非常 重要的问题是，应当保留所述化合物的生物学活性。此外，靶向模块的特 异性和活性不应受有效负载的连接的影响。我们描述的双特异性抗体技术 携带2个生物活性化合物的调制步骤，其中之一也修饰靶向模块。在第一 步中，我们将地高辛配基共价连接至Cy5。在第二步中，此地高辛配基化 Cy5与双特异性抗体衍生物(其为大蛋白)复合。为了保留Cy5的活性， 重要的是确保修饰的Cy5在这两步中的活性：需要显示，(i)在地高辛配 基化后保留了Cy5的荧光功能，和(ii)在最终的复合物中仍然保留靶向 模块的结合特异性和亲和力。

未修饰的和地高辛配基化Cy5的荧光活性

为了评估Cy5的地高辛配基化是否改变了其荧光特征，我们比较了Cy5 的激发和发射光谱并将其与新产生的Dig-Cy5和具有双特异性抗体的复合 物中的Dig-Cy5的光谱比较。表4总结了这些分析的结果：Cy5与地高辛 配基的缀合，以及Dig-Cy5与抗体的复合没有影响Cy5的荧光特征。我们 推断，Dig-Cy5和其复合物可用于抗体介导的靶向和体内成像。

Dig-Cy5复合的靶向模块的结合活性

为了评估地高辛配基化Cy5的复合是否改变双特异性靶向模块的结合 特征，我们使用表面共振分析。使用Her2(以及IGF1R)的胞外结构域作 为抗原测定抗体亲和力。在实施例4中已描述了这些分析的细节。表5总 结了这些分析的结果：Dig-Cy5与抗体的复合没有影响靶向模块的结合亲 和力。

表5

通过使用FACS分析的对复合物的进一步表征提供了另外的证据，证明 Dig-Cy5与抗体的复合没有影响靶向模块的结合。在这些分析中，我们使 用CD22阳性Raji和Ramos细胞和双特异性<CD22>-<DIG>抗体。3x10⁵细 胞/孔的96孔板与5μg/ml<CD22>-<DIG>抗体在FACS缓冲液(包含5％FCS 的PBS)中孵育。洗涤后，细胞与终浓度66.4nM的DIG-Cy5孵育。再次 洗涤后，用FACS canto II(BD Biosciences)分析细胞。

此分析的结果在图25中显示。<CD22>-<DIG>和DIG-Cy5复合物明显地 与Raji或Ramos细胞结合，而单独的DIG-Cy5几乎没有任何结合。我们因 此推断，DIG-Cy5与双特异性抗体的复合物可用于抗体介导的靶向和体内 成像。

将地高辛配基化抗体复合的Cy5体内特异性靶向的表达抗原的肿瘤细胞

为了分析抗体-复合物的特异性抗原结合功能是否可用于特异性递送 成像试剂至肿瘤细胞，我们进行了体内的近红外荧光成像研究(NIRF)。在 这些研究中，将50μg的<Her2>-<Dig>-Dig-Cy5或<IGF1R>-<Dig>Dig-Cy5 静脉内注射至携带皮下肿瘤异体移植物的免疫缺陷小鼠。这些异体移植物 表达抗原Her2(KPL4细胞)或抗原IGF1R(H322M细胞)。随后，使用CRI 的Maestro系统进行NIRF成像。将动物置于测量室并根据染料测量在确定 光谱的波长阵列中的荧光。通过特殊的软件分析得到的图像的每个像素的 光谱信息，所述软件允许分离不同的预定义光谱，例如自身荧光和染料的 信号。通过Maestro软件定量这些分离的特定信号，以比较不同的样品。

这些测定的结果(图26和27)显示，与双特异性抗体复合的Dig-Cy5 被特异性靶向表达同源抗原的肿瘤。在注射后24小时，可通过NIRF使用 <Her2>-<Dig>Dig-Cy5复合物显像表达Her2的KPL4肿瘤。以类似的方式， 在使用双特异性抗体衍生物<IGF1R>-<Dig>和Dig-Cy5的复合物30分钟后， 可通过NIRF特异性显像表达IGF1R的肿瘤。与显示靶向肿瘤荧光的抗体复 合物相反，不与抗体复合的Dig-Cy5没有显示肿瘤特异性荧光(而在肝中 有一定聚集，如图29中的圆圈指示)。

另一个使用<靶>-<Dig>双特异性抗体与地高辛配基化成像底物组合的 成像方法在图28中显示：在此实验中，我们在注射带瘤动物前没有预先形 成蛋白质靶向模块与地高辛配基化有效负载的复合物。作为替换，我们先 注射双特异性抗体并等待48小时，然后再注射地高辛配基化成像底物。此 程序为靶向模块提供了用于肿瘤/组织渗透和在肿瘤上聚集的时间。此后， 提供的成像试剂由于其小尺寸具有快速的肿瘤穿透，且在于其上体内形成< 靶>-<Dig>Dig-Cy5复合物的靶组织上聚集。此方法具有以下优势，即打开 成像窗口的时间非常短，因为任何未复合的成像试剂被快速清除。此外， 此方法可特别用于仅应以有限的全身接触提供给患者的放射性成像(或治 疗)剂。

我们从这些实验中推断，双特异性<靶>-<Dig>抗体与地高辛配基化成 像试剂的复合物可用于特异性体内成像目的。

实施例11：地高辛配基化核酸与双特异性<Her2>-<Dig>和<IGF1R>-<Dig>的确定复合物的产生

地高辛配基化核酸，例如siRNA与包含重组Dig结合模块的双特异性 抗体衍生物的复合物可用于将核酸特异性靶向表达抗原的细胞。这样的复 合物能够将肽靶向展示由双特异性抗体变体识别的抗原的细胞。这些复合 物由一种人源化<靶>-<Dig>IgG组成，所述IgG在其两个高亲和力的Dig 结合位点上结合2个(每个位点1个)地高辛配基化核酸。希望核酸被地 高辛配基化以及与抗体复合后保留其功能。还希望双特异性抗体衍生物的 细胞表面靶结合位点在复合的地高辛配基化核酸的存在下，保留其结合特 异性和亲和力。

在评估此技术中我们作为示范使用的核酸是DNA片段或siRNA。我们 使用靶向Eg5或荧光素酶的siRNA作为失活细胞质内的相应mRNA的实例。 以地高辛配基化核酸的形式产生DNA或siRNA。此外，选择的分子是地高 辛配基化的并与荧光染料(包括Cy5，见实施例9和10)连接。可通过如 上所述的成像技术显像荧光核酸的特异性靶向和定位。此外，siRNA的生 物学活性可通过测定其在体外的人肿瘤细胞系中的mRNA下调作用在体外 评估。

表6：小帽：cuu＝2′O-甲基修饰，2’F：在核糖上的2’F，替换2’ OH

在这些实例中使用的核酸组成在表6中显示。

地高辛配基化核酸与双特异性<靶-Dig>抗体变体的双特异性复合物可 用于将核酸特异性靶向表达靶抗原的细胞。因此，通过表面抗原识别的细 胞将被核酸选择性地处理，核酸导致的活性，例如RNAi或其他核酸介导的 细胞毒性应当在表达抗原的细胞上增强。

为了产生这样选择性靶向的双特异性抗体复合物，必须(i)通过合适 的接头以允许核酸保留其活性的方式连接地高辛配基和核酸；(ii)产生和 表征地高辛配基化核酸与双特异性<靶>-<Dig>IgG的复合物。这些复合物 应当以确定的方式(2个Dig-核酸结合1个<Dig>IgG)形成。(iii)确保 这些复合物保留核酸的活性以及靶向抗体的特异性和亲和力，以介导对表 达靶向抗原的细胞的提高的(特异性)核酸介导的生物学活性。

地高辛配基化核酸的产生

1.寡核糖核苷酸合成和纯化：

使用ABI 394合成仪(Applied Biosystems)在10μmol规模上根据在 固相上的亚磷酰胺技术合成寡核糖核苷酸。在由可控孔度玻璃(CPG，具有75μmol/g的载荷，从Prime Synthesis，Aston，PA，USA得到，或 3’-PT-氨基-Mod.C6CPG，具有37μmol/g的载荷，来自Glen Research， Sterling，Virgina，USA)制成的固相支持物上进行合成。常规的RNA亚 磷酰胺、2’-O-甲基亚磷酰胺和2’-F亚磷酰胺以及辅助试剂购自Proligo (Hamburg，Germany)。没有对合成循环进行任何修饰，使用相应的亚磷酰 胺(从GE Healthcare，Munich Germany得到)将Cy5荧光染料连接至5’ 端。在结束固相合成后，对结合在支持物上的寡聚物进行切割和去保护。 然后通过阴离子交换(AEX)HPLC，在AKTA Explorer系统(GE Healthcare) 上使用Source 15Q，SPSC-150，150x8mm柱(Bischoff，Leonberg， Germany)纯化粗寡聚物。

2.氨基修饰的RNA的DIG标记

在二甲亚砜(DMSO)(Fluka，Buchs，Switzerland)中溶解地高辛配基 -3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基-琥珀酰亚胺(Roche，Basel， Switzerland)。将此溶液加入溶解在缓冲液(在0.1M KCl，pH 8.5中的 0.1M硼酸钠)中的纯化的氨基修饰的RNA。通过AEX HPLC控制反应。在 定量反应的情况下，通过用3M NaOAc，pH＝5.2和乙醇(1∶32)沉淀，分离 缀合的RNA。如果反应不是定量的，进行纯化步骤。在此情况下，通过AEX HPLC，在AKTA Explorer系统(GE Healthcare)上使用DNAPac PA-10022x 250mm(Dionex，Idstein，Germany)纯化寡聚物。缓冲液A是6M尿素， 10mM NaClO₄，20mMTris，1mM EDTA；pH 7.4，20％ACN，缓冲液B是6 M尿素，500mM NaClO₄，20mM Tris，1mM EDTA；pH 7.4，20％ACN。使 用4.5mL/分钟(在60℃下)的流速。记录260、280和(在Cy5的情况下) 643nm处的紫外光迹线。在55分钟内使用25％B至55％B的梯度。合并合 适的级分并用3M NaOAc，pH＝5.2和乙醇(1∶32)沉淀。离心后，在水中溶 解沉淀。

通过在260nm处的吸光度测量在紫外光度计(Beckman Coulter， Krefeld，Germany)中测定溶液的浓度。将各个链以冷冻的溶液储存于-20 ℃，直到退火。

3.退火寡核糖核苷酸以产生siRNA

通过混合等摩尔的RNA溶液退火互补链。冻干混合物并在合适体积的 退火缓冲液(100mM NaCl，20mM磷酸钠，pH 6.8)中重构以得到预期浓度。 将此溶液置于95℃的水浴，在3小时内冷却至室温。

核酸以及siRNA异源双链体的分子量在表6中列出。我们将核酸缀合 物分成小份溶解于0.1M NaCl，20mM NaH₂PO₄xH2O/Na₂HPO₄x2H₂O，pH 6.8并储存于-20℃，直到与抗体复合。图29图示了连接地高辛配基的核 酸的组成。

地高辛配基化核酸与重组<靶-Dig>双特异性抗体的复合

使用重组<IGF1R>-<Dig>双特异性抗体和<Her2>-<Dig>双特异性抗体 作为连接反应的蛋白质成分。在实施例1中已描述了这些分子的组成和纯 化。

为了产生地高辛配基化核酸与<IGF1R>-<Dig>和<Her2>-<Dig>双特异 性抗体的复合物，我们在0.1M NaCl，20mM NaH₂PO₄x H2O/Na₂HPO₄x 2H₂O， pH 6.8中将核酸-Dig缀合物溶解为100μM的终浓度。在20mM组氨酸，140 mM NaCl，pH＝6.0的缓冲液中将双特异性抗体溶为1mg/ml(5μM)的浓度。 通过上下吹吸以2∶1的摩尔比(核酸∶抗体)混合核酸和双特异性抗体， 并在室温孵育15分钟。然后，在体外测定或体内应用中使用复合物，没有 进一步的修饰。在Opti-MEM 1(Invitrogen Madison，WI)中进行用于这 些测定的复合物的稀释。将得到的复合物定义为单体IgG样分子，其携带 2个Dig-siRNA/1个抗体衍生物。通过大小排阻层析和装载/竞争实验验证 这些双特异性复合物的确定组成(和2∶1的核酸与蛋白质比例)。这些双 特异性靶向模块和荧光标记的核酸的大小排阻层析分析的结果在图30中 显示：通过增加至高达每单个蛋白质分子2个核酸的比例的荧光信号显示 增加的装载(较大的蛋白质复合物大小处的信号)。之后，加入更多的标记 核酸没有增加蛋白质位置上的信号，而是增加了代表核酸大小的较低分子 量分子的位置上的信号。2∶1的siRNA-蛋白质复合物没有显示任何解离的 证据。我们从这些实验推断，蛋白质-Dig-siRNA复合物由包含2个siRNA/ 蛋白质的确定分子组成。

应用天然质谱分析递送载体的有效负载的装载

可应用天然质谱测定蛋白质复合物的分子量。使用水性挥发性溶剂在 中性pH下进行与变性质谱相对的此技术，以下述方式优化，即，使非共价 蛋白质复合物在质谱分析期间的解离或破坏最小化(Sharon M，Robinson  CV(2007)，The role of mass spectrometry in structure elucidation  of dynamic protein complexes，Annu Rev Biochem.2007；76：167-93.； Heck AJ(2008)，Native mass spectrometry：a bridge between  interactomics and structural biology，Nat Methods.5(11)：927-33.)。 然而，分析的蛋白质复合物的一定的稳定性仍然是天然质谱的先决条件， 以避免复合物在样品制备和质谱检测期间解离。

为了测定<Dig>双特异性抗体与地高辛配基化有效负载(特别是 Dig-siRNA或Dig-肽)的有效负载的装载，我们对<Her2-Dig>双特异性抗 体以及亲本二价<Dig>抗体进行了天然质谱。与这些结合模块连接的有效负 载是单地高辛配基化和双地高辛配基化的siRNA和单地高辛配基化肽。

在质谱分析前，使用PNGase-F去糖基化抗体，以减少光谱复杂性和便 于数据的解释。为了使分子进入可与天然MS相容的溶液，通过使用具有 10kDa截止分子量的离心过滤装置(Millipore，England)将最初的样品缓 冲液顺序替换为50mM水性醋酸铵(pH 7.5)。之后，以1∶2(摩尔/摩尔) 的比例混合抗体和相应的有效负载，将用于质谱测量的最终样品浓度调节 为～10μM。然后在LCT电喷射飞行时间(time-of-flight)仪器(Waters， Manchester，UK)上分析混合的样品。使用纳米喷射玻璃毛细管将样品引入 Z-喷射源。源压力最高增加至-9mbar以产生增加的碰撞冷却。源温度设 定为80℃，且样品锥孔电压在125-175V之间变化。针电压设定为～1200V， 以提供稳定的喷射和适当的去溶剂化，但不导致蛋白质和有效负载分子的 断裂。锥孔电压在100-200V之间变化以达到最佳分辨率。使用2秒的扫 描时间得到质谱，并使用Mass Lynx软件(Waters，Manchester，UK)解释。

这些分析的结果在图50a中示范地显示，其中指示，<Dig>载体和地高 辛配基化siRNA或地高辛配基化肽的复合物可通过天然质谱检测。可检测 包含1个或2个dig-siRNA或dig-肽的抗体复合物。这证明，有效负载复 合物在用于天然质谱的水性缓冲液中形成，并具有足够的稳定性，从而在 预处理、去溶剂化和质谱程序中以完整的复合物形式“幸存”，甚至尽管它 们不是共价连接的。

图50b总结和比较了在程序完成后可检测的复合物的组成：所有光谱 包含指示游离的未复合的抗体的信号，和在光谱的低m/z范围中包含游离 的未复合的有效负载分子的信号(在描述的放大光谱中未显示)。然而，在 所有包含地高辛配基化有效负载的样品中，大部分信号归属于包含1或2 个有效负载的复合物。每个载体观察到的有效负载的最大数是2或更少， 这与每个蛋白质存在2个Dig-捕获模块完全一致。

当在与双特异性Dig靶向载体的复合反应中应用包含1个地高辛配基 的siRNA或肽时，复合物的绝大部分包含2个有效负载/抗体。这在单地高 辛配基化siRNA和单地高辛配基化肽中观察到相同的程度。此观察结果与 2(有效负载)∶1(载体)的复合物化学计量一致。

相反地，当在与双特异性Dig靶向载体的复合反应中应用包含2个地 高辛配基的siRNA时，(双Dig)有效负载和dig-双特异性抗体之间的1∶ 1的复合物作为主要信号出现。这可能指示1个有效负载在两端通过地高 辛配基与1个<Dig>模块结合。在此情况下，因为有效负载包含2个地高辛 配基，2∶1的Dig与载体的化学计量转变为1∶1的化学计量。这些实验 数据指示，在地高辛配基化有效负载和包含<Dig>的靶向载体之间的确定的 和相当稳定的复合物的形成。此外，我们的结果指示，天然质谱可作为分 析载体-有效负载复合物的装载化学计量和组成的有价值的工具。

实施例12：地高辛配基化s iRNA和与<靶>-<Dig>双特异性抗体的复合物保留siRNA的生物学活性以及蛋白质模块的靶特异性结合

任何致力于生物活性化合物的特异性靶向的技术需要解决的一个非常 重要的问题是，应当保留所述化合物的生物学活性。此外，靶向模块的特 异性和活性不应受有效负载的连接的影响。我们描述的双特异性抗体技术 具有2个生物活性核酸的调制步骤，其中之一也修饰靶向模块。在第一步 中，我们将地高辛配基共价连接至生物活性核酸，例如siRNA。在第二步 中，此地高辛配基化核酸(siRNA)与双特异性抗体衍生物(其为大蛋白) 复合。为了保留核酸的活性，重要的是确保修饰的核酸在这两步中的活性： 活性测定需要显示，(i)在地高辛配基化后保留了核酸的功能，和(ii) 在地高辛配基化核酸与包含<Dig>的靶向模块复合后保留功能。最后，必须 显示(iii)在最终的复合物中仍然保留靶向模块的结合特异性和亲和力。

未修饰的和地高辛配基化的siRNA的生物学活性的比较

为了评估对于siRNA，地高辛配基加入或改变是否改变其生物学活性， 我们在细胞培养物中进行了体外测定。为此，我们选择了评估siRNA失活 Eg5mRNA的活性。Eg5siRNA活性的直接作用是下调其同源mRNA。这可通 过bDNA(分支DNA)测定定量，其检测细胞中特定mRNA的量(Burris等人， 1999，Molecular Endocrinology)。为了进行这些测定，我们将确定数目 的对应细胞类型接种在96孔板中，并允许它们粘附过夜。第二天，用预期 量的特定siRNA转染细胞，或用下述试剂处理细胞，所述试剂对mRNA水平 的影响应被分析。24小时后，根据制造商的说明书进行QuantiGene试剂 盒方案(Affymetrix)，以定量mRNA水平。简而言之，将细胞裂解液转移至 存在基因特异性探针组的捕获板，并且然后在53℃孵育过夜。洗涤孔。然 后将其相继与扩增物(Amplifier)和碱性磷酸酶连接的标记探针在53℃ 孵育，在2次孵育间进行洗涤。在最后的洗涤后，加入发光碱性磷酸酶底 物二氧杂环丁烷(dioxitane)并在53℃孵育30分钟。使用InfiniteF200 发光读板器(Tecan Austria，)检测发光。靶向Eg5的siRNA的生 物学活性不仅可通过bDNA分析测定，而且可通过在生长的细胞中除尽Eg5 mRNA导致的表型测定。Eg5是属于驱动蛋白样蛋白家族的动力蛋白。Eg5， 又称KSP(驱动蛋白纺锤体蛋白)，是形成两极的有丝分裂纺锤体所必需的 且是纺锤体极点正确分离所必需的。Eg5的消耗导致特征的单星体纺锤体 的形成并激活纺锤体关卡。这导致有丝分裂停滞并最终导致凋亡(Tao et.al.，Molecular and cellular biology.2007Jan；27(2)：689-98) (Tao W.et.al.，Cancer Cell.2005；8：49 59.)。因此，通过siRNA 的Eg5失活在许多情况下介导培养细胞的细胞毒性表型。因此，可通过监 控活细胞数分析Eg5siRNA的生物学活性。

为了测量活细胞数，根据制造商提供的方案进行CellTiter-Glo发光 细胞活力测定(Promega Madison，WI)测定。在此测定中裂解细胞，并产生 与ATP量成比例的发光信号。ATP量与活细胞数直接成比例。然后在 InfiniteF200发光读板器(Tecan Austria，)中分析96孔板。

表7总结了我们进行的用于比较转染的siRNA与转染的其地高辛配基 对应物的生物学活性的bDNA和细胞毒性测定的结果。用于bDNA测定，我 们在96孔板中接种HeLa-S3细胞并允许它们粘附过夜。第二天，使用 LipofectamineTM 2000转染试剂根据制造商的说明书(Invitrogen)用指示 量的siRNA转染细胞。24小时后，根据制造商的说明书进行QuantiGene 试剂盒(Affymetrix)方案，以定量Eg5 mRNA的mRNA水平。这些测定的结 果在图31中显示。

用于细胞毒性测定，以7000细胞/孔的密度在96孔板中接种KPL-4 细胞。在含有10％FCS和L-谷氨酰胺的RPMI中在37℃，5％CO2和85％湿 度下孵育细胞。第二天，使用Dharmafect转染试剂根据制造商的说明书 (Dharmacon)用指示量的siRNA转染细胞。48小时后，用CellTiter-Glo 测定试剂根据制造商的说明书处理细胞。这些测定的结果在图33中显示。

表7

CellTiter-Glo测定的IC50值对未修饰的Eg5siRNA是28nM，对地 高辛配基化siRNA是4nM。对应的bDNA测定的IC50值对未修饰的Eg5siRNA 是0.016nM，和对地高辛配基化siRNA是0.035nM。

在图31中提供了使用未修饰的和Dig修饰的Eg5siRNA的我们的细胞 毒性测定的结果的另一个实例。我们从这些分析中推断，siRNA可被地高 辛配基化而不影响其生物学活性。

可产生识别不同靶抗原的双和多特异性地高辛配基结合实体

地高辛配基结合模块可以多种形式与不同的细胞靶向实体连接。除了 与识别人IGF1受体或Her2的抗体的C-端融合外，多种识别不同细胞表面 抗原的其他抗体被转化为用于半抗原介导的有效负载递送的载体。产生、 纯化和表征的实例包括识别人CD22抗原、人CD33抗原、Lewis Y癌症相 关碳水化合物抗原、人和鼠类VEGF受体2或受体CDCP1的包含<Dig>的递 送载体。应用在图47中描述的形式或形式组合，甚至可将识别2个(或多 个)单独的靶或一个表面靶分子上的多个单独的表位的分子与Di g-靶向实 体组合。图51a和b显示了产生的实现递送至表达不同表面靶分子的表达 抗原的靶细胞的半抗原介导的有效负载递送的分子选集。用于产生针对不 同细胞表面抗原的靶向的有效负载递送的载体的氨基酸序列列于SEQ ID  NO 51-SEQ ID NO 60。用于产生识别CDCP1的双特异性靶向实体的氨基 酸序列在申请EP 09011046.1中描述。可在哺乳动物细胞中表达所有分子， 并使用标准蛋白质A和大小排阻技术纯化，并具有良好的产量(见实施例 3“重组人源化<Dig>抗体、片段和双特异性融合蛋白的组成、表达和纯化”)。 图51c-g显示，所有这些识别不同靶抗原的不同形式的分子完全保留了用 于有效负载递送的先决条件，即靶向特异性以及地高辛配基结合能力和亲 和力：这通过表面等离子共振(BiaCore)实验(详见实施例4“重组<Di g> 抗体、片段和双特异性融合蛋白与地高辛配基化抗原的结合”)和FACS分 析(结果未显示)证明。在FACS分析中，靶-Dig双特异性抗体与细胞孵 育，然后与荧光标记的地高辛配基单独孵育。这些实验的结果总结于图51 c-g。数据证明，与亲本抗体或地高辛配基结合部分相比，针对细胞表面靶 抗原以及针对地高辛配基的结合特异性和亲和力没有变化。因此，可使用 识别多种不同靶抗原的多种不同形式和模块作为载体用于半抗原介导的靶 向的有效负载递送。这些靶向载体中的一部分，特别是那些识别肿瘤细胞 上的高密度内化抗原的载体可能特别适于靶向的有效负载递送。例如，识 别在肿瘤细胞上富集的Le Y碳水化合物抗原的双特异性分子是递送核酸和 其他有效负载至肿瘤细胞的非常有效的载体(见下实施例15，Ley介导的 DPC的靶向)。

实施例13地高辛配基化抗体复合的siRNA对表达抗原的肿瘤细胞的特异性靶向

因为siRNA具有相当大的大小且是高度带电的，双特异性靶向模块和 siRNA的复合有可能影响靶向模块的特异性抗原结合功能。为了解决此问 题，我们分析了(i)抗体-siRNA复合物的特异性抗原结合功能，以及(ii) 这些复合物在体外将siRNA靶向表达抗原的靶细胞的能力。最后，我们还 通过(iii)体内肿瘤异体移植物模型中siRNA靶向的NIRF成像验证了抗 体-siRNA复合物的功能。

抗体-siRNA复合物的特异性抗原结合

为了测定<靶>-<Dig>Dig-siRNA复合物的抗原结合功能，我们应用表 面等离子共振，使用如实施例4中用于<Her2>-<Dig>所描述的相同的实验 设置。用于<IGF1R>-<Dig>，应用如下修改的实施例4中描述的方法：在醋 酸钠，pH 5.0中以2μg/ml注入抗-人IgG抗体，这得到约600RU的表面 密度。在每个结合循环后，通过以5μl/分钟注入0.85％H3PO4 60秒和然 后以5μl/分钟注入5mM NaOH 60秒进行重生，以去除任何非共价结合的 蛋白质。在这些Biacore实验中，使用重组产生的RTK Her2的可溶性胞外 结构域表征<Her2>-<Dig>-Dig-siRNA复合物，并使用重组产生的RTK IGF1R 的可溶性胞外结构域表征<IGF1R>-<Dig>-Dig-siRNA复合物。这些测定的 结果(总结于表8)显示，具有地高辛配基化siRNA的IgG复合物保留了 对细胞表面抗原的结合特异性和亲和力。此表也显示了地高辛配基化 siRNA对<Her2>-<Dig>或<IGF1R>-<Dig>双特异性靶向模块的亲和力。

表8

证明细胞表面抗原以及地高辛配基化siRNA与双特异性分子的同时结 合的另一个实例在图32中显示：用于此实验，我们使用如实施例4中描述 的Biacore实验，但具有如下修改：在HBS-P中稀释待分析的样品并以5μl/ 分钟的流速注入。分别以5μl/ml的浓度相继注入抗体<Her2>-<Dig>， Her2-ECD和DIG-siRNA。对每个分子接触时间(结合期)是3分钟。

从我们的结合研究的结果(表8和图32)中，我们推断，双特异性模 块同时结合Dig-siRNA以及靶抗原。此外，我们推断，靶抗原结合不受抗 体复合物中存在的siRNA的影响。

与地高辛配基化抗体复合的siRNA在体外对表达抗原的肿瘤细胞的特异性靶向

为了分析<Her2>-<Dig>-Dig-siRNA复合物和 <IGF1R>-<Dig>-Dig-siRNA复合物是否介导其有效负载特异性靶向表达抗 原的细胞，我们利用siRNA可被Dig以及荧光标记物同时标记的事实。因 此，可以通过显微镜或其他成像技术显像siRNA的定位。

通过FACS分析的表征提供了证据，证明Dig-siRNA-Cy5与抗体的复合 没有影响靶向模块的结合。在这些分析中，我们使用CD22阳性Raji和 Ramos细胞和双特异性<CD22>-<DIG>抗体。3x10⁵细胞/孔的96孔板与5 μg/ml的<CD22>-<DIG>抗体在FACS缓冲液(包含5％FCS的PBS)中孵育。 洗涤后，将细胞与66.4nM的终浓度的DIG-siRNA-Cy5孵育。再次洗涤后， 用FACS canto II(BD Biosciences)分析细胞。

此分析的结果在图35中显示。<CD22>-<DIG>和DIG-siRNA-Cy5的复合 物明显地结合Raji或Ramos细胞，而单独的DIG-siRNA-Cy5几乎不显示任 何结合。因此我们推断，DIG-siRNA-Cy5与双特异性抗体的复合没有影响 靶向模块的结合。图34显示了通过共聚焦显微镜的体外成像分析的结果， 其中我们将表达抗原的细胞以及没有(或仅有弱)抗原表达的细胞暴露于 <Her2>-<Dig>模块和地高辛配基化Cy5标记的siRNA的复合物。图35显示 了通过共聚焦显微镜的体外成像分析的结果，其中我们将表达抗原的细胞 以及没有(或仅有弱)抗原表达的细胞暴露于<IGF1R>-<Dig>模块和地高辛 配基化Cy5标记的siRNA的复合物。

在这些实验中，在玻璃盖玻片上培养KPL-4，MDA-MB-468或H322M细 胞至约50-70％的密度。然后用5nM浓度的<Her2>-<Dig>-Dig-siRNA-Cy5 或<IGF1R>-<Dig>-Dig-siRNA-Cy5复合物以指示的时间处理细胞。然后用 多聚甲醛固定细胞。为了染色双特异性抗体，洗涤固定的细胞，在湿度箱 中用封闭试剂GSDB孵育，然后用6.5μg/ml浓度的兔抗人κ轻链抗体(DAKO) 孵育1.5至2小时。再次洗涤后，用28.6μg/ml浓度的Alexa-fluor 488 标记的山羊抗兔抗体(Molecular Probes)在湿度箱中孵育细胞1.5小时。 然后洗涤细胞。然后用10μg/ml浓度的DAPI(Roche)标记DNA 2-3分钟， 再次洗涤，然后用封片剂覆盖。Leica SP20共聚焦显微镜分析细胞。

这些分析的结果(图34和35，总结于表9)证明，Dig-siRNA复合物 通过双特异性<Her2>-<Dig>或<IGF1R>-<Dig>靶向模块被特异性递送至表 达抗原的细胞。此递送特异性针对复合物识别的靶向抗原并依赖于所述靶 向抗原，因为siRNA没有被递送至抗原阴性细胞。通过抗原结合模块介导 的特异性递送的另一个证据是，可通过应用过量(竞争)的作为双特异性 模块的一部分的相同抗体的IgG(但不结合siRNA)竞争siRNA递送。在 37℃孵育细胞与抗体siRNA复合物提供了明确的证据，证明抗体以及连接 的Dig-siRNA的内化(图34和35)。我们推断，siRNA不仅被特异性递送 至表达抗原的细胞，而且其也被这些细胞内化。

表9

地高辛配基化抗体复合的siRNA对体内的表达抗原的肿瘤细胞的特异性靶向

为了分析<Her2>-<Dig>-Dig-siRNA复合物和 <IGF1R>-<Dig>-Dig-siRNA复合物是否不仅在细胞培养实验中而且在活动 物中介导其有效负载对表达抗原的细胞的特异性靶向，我们利用siRNA可 被Dig以及荧光标记物同时标记的事实。因此，有可能通过成像技术在活 动物中显像siRNA的定位。我们应用的用于此任务的技术是体内的近红外 荧光成像(NIRF)。用于这些研究，50ug<Her2>-<Dig>-Dig-siRNA-Cy5 或<IGF1R>-<Dig>Dig-siRNA-Cy5复合物经静脉内注射进携带皮下肿瘤异 体移植物的免疫缺陷小鼠。这些异体移植物表达抗原Her2(KPL4细胞)或 抗原IGF1R(H322M细胞)。然后使用如实施例10中描述的Maestro系统进 行NIRF成像。

表10

这些测定的结果(图36和37)显示，与双特异性抗体复合的Dig-siRNA 被特异性靶向表达同源抗原的肿瘤。这些数据总结于表10：可通过NIRF 使用<Her2>-<Dig>Dig-siRNA复合物显像表达Her2的KPL4肿瘤(图36)。 以相同的方式，当应用双特异性抗体衍生物<IGF1R>-<Di g>和Dig-siRNA 的复合物时，可通过NIRF特异性显像表达IGF1R的肿瘤(图37)。我们从 这些实验推断，双特异性<靶-Dig>抗体与地高辛配基化s iRNA的复合物在 表达靶抗原的体内组织或细胞上积累。

实施例14：在通过地高辛配基化抗体复合的siRNA靶向的表达抗原的肿瘤细胞中的siRNA活性

为了介导mRNA的特异性破坏，siRNA必须进入其靶细胞的细胞质。因 此，递送特异性siRNA活性的一个重要因素是，不仅将分子递送至细胞(这 已在实施例12和13中得到证明)，而且必须将足够量的siRNA转移进这些 细胞的细胞质。为此，这些分子必须至少穿透1次生物膜。由于生物制剂 不能容易地穿过膜，此过程是有效递送siRNA活性所必须克服的瓶颈。克 服此瓶颈的手段可为膜渗透、蛋白质跨膜易位或可能涉及膜破坏过程的内 体逃逸或小泡逃逸机制。可能在siRNA进入细胞质的过程中有帮助的一个 因素是(i)在内化后(siRNA有效负载的内化已在实施例13中显示)从 双特异性靶向部分中释放siRNA有效负载的潜能。这可能有利于进入细胞 质，因为需要转移的实体比完整的siRNA靶向复合物小(只有Dig-siRNA)。 可能有利于siRNA转移至靶细胞的细胞质的另一种原理是(ii)将靶向复 合物与内体功能的调节物，或与内体逃逸/破坏模块组合。

在内化后从双特异性抗体部分释放Dig-siRNA有效负载

因为<Dig>模块的足够的亲和力，地高辛配基化siRNA和<靶>-<Dig> 双特异性靶向模块的复合物是确定和稳定的。另一方面，Dig-siRNA和蛋 白质之间的连接不是共价的，而是由抗体-半抗原相互作用组成。为了分析 复合物的非共价连接模式是否可以在内化后介导有效负载的释放，我们使 用双标记的siRNA复合物进行荧光显微镜实验。用于这些实验，我们应用 Cy5标记的Dig-siRNA定位细胞内siRNA的位置。为了显像靶向复合物的 蛋白质部分，应用兔抗人κ轻链抗体并接着与Alexa-fluor 488标记的山 羊抗兔抗体孵育。可在不同的激发和发射通道通过显微镜显像2种实体。 重叠来自2个通道的信号显像使得有机会同时跟踪蛋白质和siRNA在应用 于表达抗原的细胞后的路径。显像和显微镜技术的实验细节已在实施例12 中描述。图33和34显示了这些共染色实验的结果。表达Her2的KPL4细 胞在37℃下暴露于<Her2>-<Dig>Dig-siRNA-Cy5复合物，并随后通过显微 镜分析(图37)。以相同的方式，表达IGF1R的H322M细胞在37℃下暴露 于<IGF1R>-<Dig>Dig-siRNA-Cy5复合物，并随后通过显微镜分析(图40)。 在两个实验中，观察了复合物与细胞表面的结合和随后的内化。在早期的 时间点上，蛋白质和siRNA信号共同定位在细胞表面上和内体中。这指示 完整的复合物与靶细胞结合并内化进靶细胞。在后来的时间点上，我们观 察到蛋白质相关信号与siRNA相关信号的分离。在具有<Her2>-<Dig> Dig-siRNA-Cy5的KPL4细胞以及暴露于<IGF1R>-<Dig>Dig-siRNA-Cy5的 H322M细胞中观察到此分离。

为了验证我们有关DIG标记的有效负载与DIG双特异性AB的分离的结 果，将表达Le Y的MCF7细胞暴露于装载DIG标记的重组eGFP的 <LeY>-<DIG>。观察到复合物与细胞表面的结合和随后的内化。这些数据在 图38c-d中显示。在早期的时间点上，抗体和eGFP信号共定位在细胞表面 上和内体中。这指示完整的复合物与靶细胞结合并内化进靶细胞。在后来 的时间点上，我们观察到抗体相关信号与eGFP相关信号的分离。此发现指 示，不同的货物分子与靶向DIG双特异性抗体分离。为了显示观察到的分 离是基于DIG系统，我们进行了比较实验，使用通过SMCC接头与<IGF1R> 抗体共价连接的Nu457标记的siRNA，或<IGF1R>抗体与荧光蛋白柠檬黄的 串联融合蛋白。在这些情况下，无一观察到有效负载从靶向抗体上的显著 分离。

我们从这些实验推断，完整的<靶>-<Dig>Dig-siRNA复合物与靶细胞 表面结合并内化，且随后从抗体实体上释放siRNA有效负载。

在表达抗原的细胞中的靶向siRNA活性

为了介导mRNA的特异性破坏，必须将足够量的siRNA转移进这些细胞 的细胞质。细胞质中的RNAi机制的组件特异性识别siRNA双链体并将反义 siRNA参入名为RNA诱导沉默复合物的蛋白质复合物。然后，反义链与相 应mRNA配对，导致mRNA被RISC切割，从而介导特异性mRNA破坏。

为了分析靶向Dig-siRNA是否能够从内体中逃逸并随后介导mRNA击 倒，我们对表达IGF1R的H322M肿瘤细胞应用<IGF1R>-<Dig>Dig-siRNA 复合物。此外，我们对表达Her2的肿瘤细胞应用<Her2>-<Dig>Dig-siRNA 复合物。为了利于靶向siRNA的内体逃逸，我们还共同应用了靶向内体逃 逸模块。在这些实验中使用的模块是实施例5中描述的地高辛配基化INF7 肽。

在对细胞应用靶向siRNA和靶向肽后，测定siRNA介导的mRNA击倒， 以及siRNA介导的表型。我们用于这些实验的分子是Eg5-siRNA，只要可 实现足够的Eg5击倒，其介导对细胞的细胞毒性表型。Eg5siRNA和定量 Eg5mRNA水平(bDNA测定)和表型(细胞毒性测定)的测定已在实施例 12和表7中详细描述。

这些分析的结果在图34中显示并总结于表11：用于这些实验，以15000 细胞每孔的密度在96孔板中接种H322M细胞。在37℃，5％CO2和85％湿度 下在具有10％FCS、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和NEAA混合物的RPMI中培养细 胞24小时。(以7000细胞每孔的密度在96孔板中接种KPL4细胞。)在37 ℃，5％CO2和85％湿度下在具有10％FCS和L-谷氨酰胺的RPMI中培养细胞 24小时。为了产生地高辛配基化肽与<IGF1R>-<Dig>和<Her2>-<Dig>双特 异性抗体的复合物，我们将肽-Dig缀合物在H2O溶解为1mg/ml的终浓度。 在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH＝6.0的缓冲液中将双特异性抗体溶为1 mg/ml(4，85μM)的浓度。以2∶1的摩尔比(肽∶抗体)通过上下吹吸混 合肽和双特异性抗体，并在室温孵育15分钟。以1∶2(AB∶siRNA)的比 例将Eg5和荧光素酶对照siRNA分子分别加入双特异性抗体，并通过上下 吹吸混合。将3种混合物在室温孵育15分钟。然后，以指示浓度将复合物 加入细胞。再孵育细胞24小时并裂解，用于以前描述的bDNA分析。

通过共同应用<靶>-<Dig>-Dig-siRNA和<靶-Dig>-Dig-INF7(一种内 体逃逸介导肽(等人，2007，Biochemistry))，我们能够观察在 siRNA-蛋白质复合物靶向的细胞中的mRNA击倒。使用<IGF1R>-<Dig>-Dig siRNA模块的表达IGF1R的细胞以剂量依赖的方式显示了Eg5mRNA的减少 (在图35中显示了对INF肽的剂量依赖)。对照实验没有导致任何mRNA 的消耗，在对照实验中我们应用没有靶向模块的Dig-siRNA，或没有siRNA 的靶向INF肽。这指示，识别细胞表面抗原的完整的siRNA-靶向复合物是 介导siRNA击倒所必需的。siRNA活性与靶向INF7肽的剂量依赖相关性指 示，加入的内体调节物可提高<靶>-<Dig>双特异性抗体衍生物对siRNA的 特异性靶向效力。

我们从这些实验推断，<靶>-<Dig>双特异性分子可将siRNA活性特异 性靶向表达抗原的细胞。我们进一步推断，可通过另外应用靶向内体调节 剂提高此活性。

表11

与DharmaFECT-DIG-siRNA复合的<DIG>双特异性抗体介导siRNA

调查了基于脂的转染试剂帮助通过<DIG>双特异性抗体特异性靶向的 siRNA的内体逃逸的能力。因此，使用可商业获得的基于脂的转染试剂 DharmaFECT(由Dharmacon提供)。

为了分析DIG-siRNA，DharmaFECT和双特异性<DIG>抗体的复合物形 成和在靶细胞上的聚集，使用MCF7细胞(LeY阳性，CD22阴性)进行FACS 分析。使用LeY-DIG作为靶向抗体，CD22-DIG作为非靶向对照抗体，此外 使用Cy5标记的DIG-siRNA。根据制造商的说明书将DharmaFECT与 DIG-siRNA-Cy5孵育以允许复合物形成。然后，将 DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5复合物与LeY-DIG或CD22-DIG抗体孵育。在 PBS中悬浮MCF7细胞并在冰上与DIG-siRNA-Cy和DharmaFECT的复合物或 LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5或 CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5复合物孵育30分钟。在BD FACS Canto II上测量样品前洗涤细胞。在适于检测Cy5的波长处检测信号。

图52a和b显示了此FACS分析的结果。在上图中可见， DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy和CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5与 MCF7的类似的结合行为。2种复合物由于DharmaFECT的非特异性粘性与 MCF7细胞结合，这是转染试剂的固有性质。相反地，在下图中，清晰可见 LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5复合物相比 DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5的更强的聚集，指示 DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5通过LeY-DIG特异性靶向MCF7细胞。

接下来分析了DharmaFECT/DIG-siRNA， CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA和LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA复合 物介导在MCF7细胞中的特异性RNAi的能力。因此使用靶向Eg5的siRNA。 接种确定数目的MCF7细胞在96孔板中并允许粘附过夜。第二天，用期望 量的DharmaFECT/DIG-siRNA，CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA和 LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA处理细胞，持续24小时。通过bDNA测定 (见实施例12的描述)分析Eg5-mRNA水平的下调，并对GAPDH-mRNA的水 平标准化。

图52c显示了bDNA测定的结果。当复合 LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA与LeY-DIG和CD22-DIG时，保留了 DharmaFECT/DIG-siRNA的转染活性。通过靶向这些细胞的复合物 LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA介导Eg5-mRNA的下调(见图52a)。然而， 在复合物CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA中也观察到下调。通过LeY-DIG 介导的DharmaFECT/DIG-siRNA在MCF7细胞上的靶向积聚仅少量提高 RNAi。通过DharmaFECT的粘性介导的DharmaFECT/DIG-siRNA的积聚已经 足以实现转染和随后的RNAi。总之，选择与siRNA复合的基于脂的转染试 剂作为内体逃逸模块是可能的。然而，在转染试剂本身具有强细胞粘附能 力的情况下，抗体介导的靶向特异性可能受影响。

实施例15：与<靶>-<Dig>双特异性抗体复合的地高辛配基化DPC可用于靶向siRNA递送并具有内体裂解活性

任何致力于siRNA的特异性靶向的技术需要解决的一个非常重要的问 题是，核酸必须到达靶细胞的细胞质以发挥生物学活性。因为核酸是高度 带电的且自身不易穿过膜，释放靶向的(和内化的)siRNA至细胞的细胞 质是siRNA递送的主要瓶颈。

通过应用动态多聚缀合物(DPC)可克服“siRNA的内体逃逸”瓶颈， DPC是在结合细胞和内化后导致siRNA内体逃逸的化学实体(Rozema DB et. al.，Dynamic PolyConjugates for targeted in vivo delivery of siRNA  to hepatocytes.Proceedings of the National Academy of Sciences of  the United States of America；2007Aug 7；104(32)：12982-7PMID：17652171，特别是在WO2008/0022309，US公 开号US2008-0152661A1，US2008-0287630，US2008-0281074A1， US2008-0287628A1，US2008-0269450A1，US专利号7,098,032， 7,019,113，6,919,091中)。这样的DPC由PBAVE(丁基氨基乙烯基醚的聚 合物)支架组成，使用双官能团的马来酰胺键(maleamate linkage)在支 架上可逆地连接PEG分子。在所述马来酰胺酸连接中可使用羧化的二甲基 马来酸(CDM)。使用PEG单元屏蔽PBAVE的致内体裂解的正电荷。在PBAVE 上还连接siRNA负载(例如通过可逆的二硫键)。将得到的递送载体称为 siRNA动态多聚缀合物，因为siRNA、屏蔽基团(和另外的靶向配体)以可 逆的方式缀合在聚合物上。导致siRNA的细胞质递送的这样的DPC的内体 裂解性能是通过其化学环境引起的：在成熟中的内吞溶酶体(endolysome) 中的pH的降低引起CDM-PEG的释放，暴露PBAVE的正电荷，其进而介导内 体裂解。

为了组合DPC的内体裂解特征和双特异性地高辛配基或半抗原系统的 特异性靶向性能，应用以下程序。在第一步中，(i)需要以使地高辛配基 可接近抗Dig抗体的方式产生与地高辛配基缀合的DPC。此外，(ii)Dig-DPC 需要与靶-Dig双特异性抗体以保留双特异性抗体的细胞表面靶向部分的 结合特异性和亲和力的方式复合。最后，必须显示(iii)通过Dig-半抗 原维系在一起的抗体-DPC复合物形成足够稳定的赋予体外以及体内特异 性靶向的确定组成。

地高辛配基化DPC和双特异性DPC复合物的产生

为了产生地高辛配基化DPC，应用已在别处描述的程序(Rozema DB et. al.，Dynamic PolyConjugates for targeted in vivo delivery of siRNA  to hepatocytes.Proceedings of the National Academy of Sciences of  the United States of America；2007Aug 7；104(32)：12982-7PMID：17652171，特别是在WO2008/0022309，US公 开号US2008-0152661A1，US2008-0287630，US2008-0281074A1， US2008-0287628A1，US2008-0269450A1，US专利号7,098,032， 7,019,113，6,919,091中)，具有如下修改，即以不同的比例将NHS-地高 辛配基加入PBAVE-CDM-PEG反应混合物。简而言之，为了产生地高辛配基 化DPC，将2.5μM的在Hepes缓冲液(500mM，pH 8)中的多聚丁基氨基乙 烯基醚(PBAVE)溶液与0.07M的N-羟基琥珀酰亚胺NHS-DIG溶液(在等 渗的葡萄糖缓冲液或1x磷酸缓冲液PBS中)混合。将混合物在室温孵育 30分钟。可应用的PBAVE比NHS-Dig的比例包括1∶1的摩尔比或多种其 他比例。在30分钟的孵育步骤后，以1∶35的比例(Dig-PBAVE∶CDM-PEG) 将CDM-PEG550溶液(0.11M)加入PBAVE-DIG复合物，并在室温再孵育60 分钟。然后，通过应用1.3ml Sephadex G-50离心柱去除任何过量的未结 合的CDM-PEG。NHS-Dig和CDM-PEG与PBAVE支架的连接导致pH敏感的羧 基二甲基马来酸酐CDM键的形成。

为了分析这些地高辛配基化DPC是否具有足够暴露的地高辛配基使其 可与Dig双特异性抗体复合，进行了SEC-MALLS分析。此技术不仅分析蛋 白质或蛋白质复合物的大小，而且也提供有关分子的半径，即形状的证据。 使用双特异性抗体和地高辛配基化DPC复合物进行的SEC-MALLS分析的结 果指示，地高辛配基化DPC以相当稳定的方式与双特异性Dig靶向模块结 合。我们推断，地高辛配基化DPC可用于与含有Dig结合单元的双特异性 抗体模块形成稳定的复合物。

双特异性抗Dig抗体-地高辛配基化DPC复合物将DPC递送至培养的靶细胞并使DPC内化

为了测定<靶>-<Dig>Dig-DPC的抗原结合功能，我们应用FACS测定。 用于这些测定，对表达IGF1R的H322M细胞应用<IGF1R-Dig>-DPC复合物。 如图40所示，在H322M和Raji细胞系上进行FACS分析。悬浮在PBS+5％FCS 的细胞接受7.5nM摩尔浓度的抗体或复合物和30nM浓度的二级抗体(当 需要时，即对照)。一级抗体在冰上孵育30分钟，然后在洗涤步骤后，加 入二级抗体并在冰上孵育30分钟。在BD FACS Canto II上测量样品前， 洗涤细胞。在适于检测APC(对照)或Cy3(包含DPC的样品)的合适波长 处检测信号。在H322M中表达IGF1R，这为连接缀合物的IGF1R-DIG双特 异性抗体提供了信号。Raji细胞系表达CD22，此细胞系对CD22-DIG+缀 合物具有阳性信号。2种细胞系都显示了中度的背景信号，这是由于相当 高的二级抗体浓度导致的。然而，由于连接缀合物的双特异性抗体在测定 中没有二级抗体，在这些样品中检测的所有信号都是由于特异性抗原结合。 我们的实验分析证明，IGF1R.Dig::Dig-DPC复合物与表达IGF1R的H322M 细胞结合。相反地，此分子不与不表达IGF1R的Raji或Ramos细胞结合。 这证明连接DPC的双特异性抗体保留了结合和特异性。另外的实验证明， 表达CD22抗原的Ramos和Raji细胞与和识别CD22抗原的Dig双特异性抗 体复合的DPC结合。这证明连接DPC的双特异性抗体保留了结合和特异性。

还应用了共聚焦显微镜证明靶向DPC的特异性结合和随后的内化。用 于这些实验，用<IGF1R-Dig>-Dig DPC复合物处理表达IGF1R的H322M细 胞。这些复合物的DPC部分用荧光底物Cy3标记以显像DPC在抗原结合后 的位置。图41显示，靶向DPC结合表达表面抗原的H322M细胞并被内化。 在结合和内化后的早期时间点，抗体和DPC共定位在内体中。然后，抗体 检测和DPC检测指示细胞内复合物的分离。这指示，Dig复合的DPC在细 胞内从抗体靶向部分解离，以介导不受限制的内体裂解活性。

双特异性抗Dig抗体-地高辛配基化DPC复合物将DPC递送至体内的肿瘤异体移植物

为了解决抗体-DPC复合物是否足够稳定以将DPC靶向体内的肿瘤的问 题，进行了动物实验。用于这些实验，将与Cy3标记的地高辛配基化DPC 复合的Cy3标记的Her2-Dig双特异性抗体注射进携带表达Her2的KPL4 肿瘤异体移植物的动物中。通过在不同时间点的近红外荧光成像(NIRF) 检测DPC在肿瘤中的积累，并与未靶向的Cy3标记的Dig-DPC(未与双特 异性抗体复合)的积累比较。图42显示了此分析的结果：未靶向的DPC 在抗原阳性肿瘤中仅显示了弱的积累或没有积累。相反地，通过双特异性 Dig抗体变为靶向的DPC显示了明显的在肿瘤中积累的证据。我们推断， Dig-双特异性抗体可用于将DPC靶向体内的期望靶位点。

使用LeY-DIG和DIG-DPC的siRNA靶向

LeY是LeY家族的碳水化合物抗原，其在结肠、胃、卵巢、乳腺和肺 的许多粘液癌以及表皮癌的表面发现。为了靶向此抗原，构建了双特异性 LeY-DIG抗体，其中<LeY>序列源自单克隆抗体B3，一种针对LeY抗原的鼠 类抗体(Pastan，等人，1991，Cancer research)。由于B3仅与有限数目 的正常组织起反应，其是癌症治疗的理想候选物(Brinkmann等人，1991， PNAS)。另外，因为LeY抗原在源自上述癌症的细胞中具有非常高的密度， 在与抗原结合后，LeY和<LeY>复合物显示了高内化率。

进行了FACS分析以调查LeY-DIG将DIG-DPC-siRNA靶向表达LeY的 MCF7乳腺癌细胞的能力(图53a和b)。如上所述进行FACS分析。在图53a 中，以增加的浓度(25nM，50nM，100nM和150nM)将DIG-DPC-siRNA 加入MCF7细胞，导致DIG-DPC-siRNA与MCF7细胞表面的浓度依赖性非特 异结合。在图53b中，以增加的浓度(25nM，50nM，100nM和150nM) 将LeY-DIG和DIG-DPC-siRNA的复合物与细胞孵育。观察到浓度依赖性的 LeY-DIG至MCF7细胞的靶向，其大大超过单独的DIG-DPC-siRNA的非特异 结合的程度。总之，LeY-DIG能够将DIG-DPC-siRNA强力地靶向表达LeY 的MCF7细胞。

接下来，使用MCF7细胞进行生物测定，以分析通过LeY-DIG的 DIG-DPC-siRNA靶向是否导致比用单独的或与非靶向抗体复合的 DIG-DPC-siRNA处理的细胞中的mRNA下调更高的同源mRNA的下调。

图53c)显示了用增加浓度的单独的或与非靶向抗体CD22-DIG复合的 DIG-DPC-siRNA处理的MCF7细胞的bDNA测定(如上所述)的结果。在此 实验中，靶向AhaI的siRNA与DPC结合。AhaI(Hsp90ATP酶的激活物) 是Hsp90分子伴侣的调节物(Panaretou等人，2002，Molecular Cell)。 用单独的DIG-DPC-AhaI处理MCF7细胞导致AhaI/GAPDH mRNA比例的浓度 依赖性减少，指示DIG-DPC-AhaI与MCF7细胞的非特异性结合也导致了靶 mRNA的一些mRNA击倒。另外，当使用较高浓度的DIG-DPC-AhaI时，持家 基因GAPDH的mRNA也略微减少。然而，令人惊讶地，以浓度依赖的方式将 MCF7细胞和CD22-DIG/DIG-DPC-AhaI复合物孵育部分逆转了AhaI-mRNA的 非特异性DPC介导的击倒。这可能反映了非靶向抗体一旦与Dig-siRNA DPC 复合物连接后的的屏蔽作用。

在图53d)中显示了以浓度依赖的方式用与另一种非靶向抗体 VEGFR2-DIG复合的DIG-DPC-AHAI处理的MCF7细胞的mRNA分析。与 VEGFR2-DIG的结合再次导致DIG-DPC-AhaI的非特异性转染的减少。总之， 与非靶向抗体复合的DIG-DPC-AhaI比单独的DIG-DPC-AhaI具有更少的非 特异性活性。

以浓度依赖的方式用LeY-DIG和DIG-DPC-AhaI的复合物靶向处理 MCF7细胞导致AhaI的mRNA下调(对GAPDH标准化)的强烈增加。这指示 LeY-DIG的特异性靶向(图54a)也导致DIG-DPC-AhaI的生物活性提高。

图53e显示了用单独的或与LeY-DIG或CD22-DIG复合的DIG-DPC-AHAI 处理的MCF7细胞的mRNA分析，并与用单独的或与LeY-DIG或CD22-DIG 复合的DIG-DPC-GL3处理的细胞比较。siRNA GL3针对荧光素酶，这是在 癌细胞中通常不存在的靶mRNA。相比用单独的或与LeY-DIG或CD22-DIG 复合的DIG-DPC-AHAI的处理，用单独的或与LeY-DIG或CD22-DIG复合的 DIG-DPC-GL3的处理没有导致AhaI/GAPDH比例的减少。此结果指示， DIG-DPC-AHAI引起的AhaI/GAPDH比例的减少是特异性siRNA介导的作用。

接下来，用LeY-DIG/DIG-DPC-AhaI和CD22-DIG/DIG-DPC-AHAI以时间 依赖的方式(1，4，8，24或48小时)处理MCF7细胞，并再次通过bDNA测 定评估AhaI相对GAPDH的mRNA水平的比例。从这些实验中计算IC40值， 并通过用LeY-DIG/DIG-DPC-AhaI处理的MCF7细胞的IC40值除以用 CD22-DIG/DIG-DPC-AhaI(简称IC40LeY/CD22)处理的MCF7细胞的IC40 值得到靶向特异性因子。在图53f中，将靶向特异性因子对时间作图，指 示当用LeY-DIG/DIG-DPC-AhaI处理MCF7细胞4-8小时时达到最高的特异 性。

可使用SEC-MALLS分析DIG-PBAVE-siRNA和LeY-DIG DIG-PBAVE-siRNA复合物

SEC-MALLS(大小排阻层析多角度激光光散射)是一种分析技术，通过 此技术生物分子在凝胶过滤柱上分离并被递送至3种检测系统：紫外光/ 可见光、折光率(RI)和光散射(LS)。紫外光/可见光和RI的检测器提供 有关样品浓度的信息。LS是在溶液中表征大分子和多种颗粒的非侵入性技 术。与大多数表征方法相反，其不需要外部校正标准。在此意义上其是一 种绝对技术。这里使用的Wyatt Technology仪器具有2种不同类型的用于 绝对分子表征的光散射测量：

经典光散射/静态光散射：这里，根据角度测量散射光的强度，并 可得到摩尔质量、rms半径和第二位力系数(A2)。对特定类型的颗粒，经 典光散射可得到大小、形状和结构。

准弹性光散射(QELS)或动态光散射(DLS)：在QELS测量中，使 用快速光子计数器测量散射光信号中的时间依赖性波动。QELS测量可测定 大分子或颗粒的流体动力学半径。

静态和动态光散射方法收集不同类型的信息，为更完整的表征生物分 子提供了补充(complimentary)数据。

通过大小排阻层析组合多角度激光光散射(SEC-MALLS)和准弹性光散 射(QELS)，分析了DIG-DPC-siRNA AHAI、及LeY-DIG与DIG-DPC-siRNA AHAI 的复合物。SEC部分由Dionex Ultimate 3000系列的HPLC泵、脱气装置 和自动进样器组成。对GE Healthcare Bio-Sciences(Uppsala，Sweden) 的Superose 6 10/300GL SEC柱应用190μl 5mg/ml的DIG-DPC-siRNA AHAI 溶液或190μl 3.3mg/ml的LeY-DIG和DIG-DPC-siRNA AHAI的复合物的 溶液。使用1x PBS作为洗脱液和0.25mL/分钟的流速。通过示差折光率 (RI)检测器(Optilab rEx)、三角度激光光散射检测器(miniDAWN Treos， GaAs laser 658nm，50mW，K5cell)和Wyatt Technology(Santa  Barbara，CA，USA)的动态光散射检测器(WyattQELS)检测样品。使用Zimm 图计算分子量并通过Windows软件，版本5.3.4.13的ASTRA得到流体动力 学半径。

DIG-DPC-siRNA AHAI、及LeY-DIG与DIG-DPC-siRNA AHAI的复合物的 SEC-MALLS分析结果在图54中显示。

在图54a和b中，显示了DIG-DPC-siRNA AHAI(左图)和 LeY-DIG/DIG-DPC-siRNA AHAI(右图)的分子量的分析。黑色曲线指示LS 检测器产生的信号，而红色线显示了从LS和RI检测器的信号产生的分子 量。提供的分子量仅是近似值，因为DIG-DPC-siRNA AHAI的精确dn/dc 值未知并以0.146估计，这是PEG的dn/dc值。如图54a中所示， DIG-DPC-siRNA AHAI显示了具有估计分子量为～300至～720kD的分子的多 分散溶液。LeY-DIG的加入也产生多分散溶液，但具有估计分子量为～500 至～1100kD的分子。大小的增加指示LeY-DIG和DIG-DPC-siRNA AHAI复 合。

在图54c)和d)中，显示了DIG-DPC-siRNA AHAI(左图)和 LeY-DIG/DIG-DPC-siRNA AHAI(右图)的流体动力学半径分析。黑色曲线指 示LS检测器产生的信号，而蓝色点线显示从QELS检测器产生的流体动力 学半径。DIG-DPC-siRNA AHAI包含流体动力学半径范围从～7nm-～10nm 的分子，LeY-DIG/DIG-DPC-siRNA AHAI包含流体动力学半径范围从～9nm -～12.5nm的分子。LeY-DIG的加入再次导致大小的增加，再次指示 LeY-DIG和DIG-DPC-siRNA AHAI复合。

实施例16：使用DIG标记的GFP测量<LeY><DIG>双特异性抗体的内化

<靶>-<Dig>双特异性抗体可用于特异性递送DIG标记的负载至细胞 (实施例6)。一个出现的问题是，<靶>-<Dig>双特异性抗体是否也可用于 将DIG标记的蛋白质靶向细胞。为了回答此问题，如以前描述的，我们将 DIG部分与增强型绿色荧光蛋白(eGFP)缀合。eGFP是源自维多利亚多管 发光水母(Aequorea Victoria)的GFP的突变形式，其具有改进的光谱特 征、增加的荧光、耐光性和偏移至488nm的主要激发偏移(Heim R，Cubitt  A，Tsien R(1995).Nature 373(6516)：663 4.)。

<LeY>-<DIG>双特异性抗体可用于将DIG标记的eGFP蛋白靶向靶细胞

为了分析<LeY>-<DIG>双特异性抗体是否可用于将DIG标记的eGFP蛋 白递送至靶细胞，我们使用FACS分析。因为eGFP具有荧光(主要激发 488nm，主要发射509nm)，可通过常见的FITC滤光器组检测可此蛋白的存 在。我们产生了与2[1∶2]或3个[1∶3]DIG部分连接的2种eGFP变体。

用于这些分析，我们使用LeY阳性MCF7细胞和双特异性<LeY>-<DIG> 抗体。将3x10⁵细胞接种至96孔板的每个孔中并立刻使用。对孔加入3.43 nM的在FACS缓冲液(含有5％FCS的PBS)中的<LeY>-<DIG>双特异性抗体。 以相同的浓度使用<DIG>抗体作为非靶向对照。为了检测结合的抗体，加入 Cy5标记的二级抗体(Jackson Immunoresearch 709-176-1490；Cy5 F(ab′)2驴抗人IgG(H+L))至3.43nM的终浓度。在FACS缓冲液中洗涤 后，在4℃孵育细胞1小时，然后用FACS canto II(BD Biosciences)分 析。为了显示<LeY>-<DIG>双特异性抗体介导的eGFP至细胞的递送，对孔 加入与2倍摩尔量的[1∶2]和[1∶3]DIG-eGFP预孵育的3.43nM的在FACS 缓冲液(含有5％FCS的PBS)中的<LeY>-<DIG>双特异性抗体。在FACS缓 冲液中洗涤后，用FACS canto II(BD Biosciences)分析细胞。

这些测定的结果(图43)显示，与双特异性抗体复合的DIG-eGFP被 特异性靶向表达同源抗原的肿瘤。观察到<DIG>对照抗体的弱背景结合。在 使用单独的二级抗体时也观察到此信号，因此这是此二级抗体的假象。另 一方面，如通过特异性二级抗体所检测的，<LeY>-<DIG>双特异性抗体显示 了与表达LeY的MCF7细胞的明显结合。这些抗体无一在FITC通道中产生 显著信号。当<LeY>-<DIG>双特异性抗体装载[1∶2]或[1∶3]DIG-eGFP时， 当分析Cy5信号时，相比用Cy5连接的二级抗体检测的未装载抗体，这些 复合物没有产生显著的信号(图43)。当在FITC通道中分析相同的复合物 时，[1∶2]和[1∶3]DIG-eGFP得到显著的信号，而没有观察到<LeY>-<DIG> 双特异性抗体的信号(图43、4)。这些数据显示，DIG连接的eGFP作为模 型蛋白可被<靶>-<DIG>双特异性抗体特异性募集至靶阳性细胞。

DIG标记的eGFP蛋白可用于监控结合靶细胞的双特异性抗体的内吞

靶向细胞表面相关受体的抗体在结合后经常被内化。在内化后，与靶 结合的抗体被运输至内体区室。这些区室相继被酸化。在pH依赖性荧光团 例如eGFP的帮助下，可监控抗体的内化。

负责吸收和荧光的eGFP的发光团由β-折叠的圆柱体内侧的对羟基苯 亚甲基咪唑啉酮(p-hydroxybenzylideneimidazolidinone)组成。发光团 可以中性的苯酚形式或阴离子酚盐的形式存在。2种形式展示了截然不同 的吸收和荧光特征。在这些形式之间的平衡取决于周围介质的 pH(Nakabayashi T，Wang HP，Kinjo M，Ohta N.Photochemical & photobiological sciences：Official journal of the European  Photochemistry Association and the European Society for  Photobiology；2008Jun；7(6)：668-70.)。发光团的2种形式的不同荧光 特征已用于多种测定(Puckett LG，Lewis JC，Bachas LG，Daunert S. Analytical biochemi stry；2002Oct 15；309(2)：224-31)(Kneen M， Farinas J，Li Y，Verkman AS.Biophysical journal；1998 Mar；74(3)：1591-9)。

为了分析DIG-eGFP监控内化的能力，我们进行了FACS实验。用于这 些分析，我们使用LeY阳性MCF7细胞和双特异性<LeY>-<DIG>抗体。将3x 10⁵细胞接种至96孔板的每个孔中并立刻使用。对孔加入与2倍摩尔量的 [1∶2]和[1∶3]DIG-eGFP预孵育的3.43nM的在FACS缓冲液(含有5％FCS 的PBS)中的<LeY>-<DIG>双特异性抗体。在FACS缓冲液中洗涤后，在4 ℃或37℃下孵育细胞1小时。然后用FACS canto II(BD Biosciences) 分析细胞。

这些实验的结果(图44)显示，在<LeY>-<DIG>双特异性抗体内化后， DIG-eGFP的荧光显著减少。在4℃下，复合物可与细胞表面定位的LeY抗 原结合，但不能被内化。1小时候，荧光被完全保留(图44)。然而在37 ℃下孵育1小时足够起始DIG-eGFP<LeY>-<DIG>双特异性抗体复合物的内 化。测量的信号显示，在这些细胞中仍然有eGFP，但是与4℃的对照细胞 相比，观察到荧光信号的显著减少(图44，1，2)。这些数据显示，可利 用pH依赖性荧光团测量内体的内吞依赖性酸化和因此追踪被内吞的双特 异性抗体的运输。

可产生结合不同半抗原的双和多特异性靶向实体

应用地高辛配基结合模块将地高辛配基化有效负载连接至靶向载体是 可实现的半抗原介导的有效负载递送的一种技术可能性。然而，此概念可 扩展至捕获有效负载并将其连接至靶向模块的不同的半抗原或其他实体。 例如，用于siRNA递送，可应用结合核酸的双特异性抗体和抗体衍生物将 siRNA连接至靶向载体。

用作有效负载捕获模块的先决条件是(i)有效负载与半抗原的连接不 影响有效负载的活性和(ii)靶向载体与“半抗原化”有效负载的有效结 合/复合的可能性。此实施例描述了2种另外的可用于有效负载递送的模 块：生物素结合实体(抗体)和PEG结合实体。

生物素是稳定的小分子，与其相关的大量现有连接技术是广泛应用的。 生物素可连接至蛋白质、肽、低分子量化合物或核酸以及其他物质。与地 高辛配基类似，通过标准方法可进行连接而不影响有效负载的活性。

与标准的“半抗原”结合物截然不同的是识别聚乙二醇(PEG)的抗体。 PEG是聚合物并因此不能被认为是标准“半抗原”。然而，PEG结合实体可 作为有效负载捕获实体的良好选择，因为PEG已经用于重组蛋白质的连接。 有关蛋白质、肽和其他物质的PEG化的大量技术和优化程序是现有的；此 外，PEG是许多siRNA递送载体例如纳米微粒的成分。因此，在靶向载体 中具有用于捕获有效负载的PEG结合部分允许通过与已经存在的模块的简 单组合进行复合。这可包括PEG化化合物、PEG化蛋白质或核酸，PEG-脂 质体或其他PEG化纳米微粒。

可基于和图47中描述的相同形式或形式组合产生利用生物素或PEG 结合部分用于复合有效负载的递送载体。可通过将双特异性抗体的地高辛 配基结合实体替换为结合生物素或聚乙二醇的抗体衍生物产生在图55中 显示的这些分子。在此实施例中我们使用的用于产生生物素结合双特异性 抗体的细胞表面靶向部分源自识别人IGF1受体的抗体。从产生抗生物素抗 体的鼠类杂交瘤细胞的mRNA中分离生物素结合序列(以与实施例1中描述 的用于抗-Dig模块的类似方式)。以相同的方式从产生抗PEG抗体的杂交 瘤细胞的mRNA中分离PEG结合序列(以与实施例1中描述的用于抗-Dig 模块的类似方式)。可使用的抗PEG抗体以前已经被描述(Wunderlich等 人，Hybridoma 26(3)：168-172，2007；Cheng等人，Bioconj.Chem. 16：1225-31，2005；Tsai等人，Biotechniques 30：396-402，2001)。

用于产生靶向有效负载递送的包含抗生物素模块的载体的氨基酸序列 在SEQ ID NO 61和SEQ ID NO 62中列出。Roche杂交瘤<IGF1R-生物素> 可在哺乳动物细胞中表达并使用标准蛋白质A和大小排阻技术纯化为同质 (见实施例3“重组人源化<Dig>抗体、片段和双特异性融合蛋白的组成、 表达和纯化”)。图55b至d显示了包含抗生物素的分子完全保留了作为有 效负载递送的先决条件的靶向特异性以及生物素结合能力：这通过表面等 离子共振(BiaCore)实验证明(详见实施例4“重组<Dig>抗体、片段和双 特异性融合蛋白与地高辛配基化抗原的结合”)。在此图中显示的数据证明， 对细胞表面靶抗原以及对生物素的结合特异性和亲和力得到保留。因此， 除了地高辛配基以外，可使用其他具有半抗原(样)性质或具有直接的有 效负载结合能力的物质产生用于靶向有效负载递送的载体。

双特异性地高辛配基结合实体可用于递送基于蛋白质或肽的siRNA转染模块

据显示，多种肽序列，即所谓的细胞渗透肽(CPP)可用于将siRNA 分子转染进人癌症细胞。TAT肽是具有CPP功能的肽的转染能力的一个公 开的实例。然而，迄今为止，具有CPP衍生模块的siRNA的转染很难与靶 向特异性组合。具有已显示的将DIG-siRNA靶向不同靶细胞的能力的结合 地高辛配基的双特异性抗体(见实施例13)可用于将DIG-siRNA和结合 siRNA的CPP的复合物靶向表达抗原的靶细胞。为此，需要将CPP与siRNA- 抗体靶向复合物连接。CPP有时可与核酸自发地复合。通过将肽与结合核 酸的实体连接，可实现具有CPP样功能的肽与siRNA之间的更稳定的连接。 这样的实体可为结合双链siRNA的寡或多聚精氨酸链，这是由于负电荷磷 酸骨架和精氨酸的正电荷氨基之间的离子相互作用。也可应用更结构化的 肽或蛋白质结构域连接CPP和siRNA，例如结合单链或双链核酸和核酸衍 生物的结构域。

图56a显示了我们用于证明<Dig>双特异性抗体可用于递送siRNA-CPP 复合物至靶细胞的实验设置：我们用于这些分析的具有CPP功能的肽模块 是源自人NRTN基因的30-mer肽。此肽最近被我们鉴定为具有CPP样和 siRNA转染功能。为了产生用于有效连接siRNA的肽衍生物，我们将此肽 与多聚精氨酸连接。得到的siRNA-结合模块和CPP的融合物的序列是

RRRRRRRRRRGAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA(SEQ ID NO 63)

图56b证明了可与siRNA结合实体融合的CPP样NRTN肽可以极为稳定 的方式与(地高辛配基化)siRNA复合。这导致复合的siRNA在凝胶电泳 实验中的强力的蛋白质介导的滞留。我们观察到的凝胶迁移程度指示，多 于1个siRNA-结合肽融合物被各siRNA复合。

这指示包含<Dig>siRNA的复合物的形成。这些复合物可通过随后与双 特异性<Dig>靶向载体形成“超复合物”被靶向(见图56a)。

为了分析这些复合物在靶细胞中特异性诱导mRNA沉默的能力，我们比 较了装载DIG标记的靶向Aha1或对照荧光素酶的siRNA的、包含 <LeY>-<DIG>或<CD22>-<DIG>双特异性抗体的复合物的靶向siRNA转染。通 过在室温预孵育Dig-siRNA和<Dig>双特异性抗体30分钟，接着加入 CPP-PolyArg(siRNA结合)实体以产生完整的具转染能力的复合物，从而 形成这些复合物。将完整的复合物在室温再孵育30分钟，然后加入至LeY 阳性MCF7细胞中，在Optimem培养基中持续3小时。在随后在生长培养 基中孵育另外21小时后，裂解细胞，使用bDNA测定分析其mRNA含量。这 些分析的结果在图56c中显示。结果证明，双特异性抗体与siRNA的复合 物和复合siRNA的转染肽或结构域可用于实现特异性靶向的siRNA递送和 随后的靶向RNAi。在<Ley-Dig>双特异性抗体靶向的表达LeY的MCF7细胞 中观察到这些复合物使Aha1mRNA减少。在其余相同的条件下使用 <CD22-Dig>作为双特异性模块与使用<LeY-Dig>双特异性抗体达到的效果 相比，显示了减少的RNAi。<Ley>-<DIG>相比<CD22>-<DIG>递送至Ley阳 性和CD22阴性的MCF7细胞的显著更强的RNAi作用指示，siRNA CPP复合 物由抗体介导靶向至靶细胞。

实施例17：地高辛配基(DIG)标记的siRNA-脂纳米微粒与针对特异性靶和DIG(<靶-DIG>)的双特异性抗体的组合在体外介导特异性细胞靶向、摄取和特异性RNAi

我们研究了<靶-DIG>双特异性抗体是否能够引导DIG标记的siRNA-脂 纳米微粒至细胞且不影响这些纳米微粒的递送机制的问题。为了解决此问 题，我们

(i)合成了siRNA-脂纳米微粒的DIG连接的脂成分，

(ii)配制这些DIG标记的siRNA-脂纳米微粒，

(ii)产生DIG标记的siRNA-脂纳米微粒与<靶-DIG>双特异性抗体的 复合物，和

(iv)评估DIG标记的siRNA-脂纳米微粒组合<靶-DIG>双特异性抗体 的体外靶向和mRNA沉默性能。

(i)合成DIG连接的1，2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺[甲氧基(聚乙二 醇)-2000](DSPE-PEG₂₀₀₀-DIG)。通过连接NHS激活的DIG(Roche  Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)和胺功能性DSPE-PEG₂₀₀₀(Avanti  Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AB)合成DSPE-PEG₂₀₀₀-DIG。

(ii)制造DIG标记的siRNA-脂纳米微粒。DIG标记的siRNA-脂纳米 微粒由1，2-二硬脂酰-3-磷脂酰胆碱(DPPC)(Avanti Polar Lipids， Inc.，Alabaster，AB)、2，2-二亚麻酰-4-二甲基氨乙基-[1，3]-二氧戊环 (内部合成)、胆固醇(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Munich，Germany) 和聚乙二醇(PEG)₂₀₀₀-脂按比例(7.1，57.1，34.4，和1.4mol％)组成。全部 的PEG₂₀₀₀-脂含量(1.4mol％)分别由1.4％，1.36％，1％，或0.4％的Sunbright GM-020CE，α-[3′-(1，2-二肉豆蔻酰-3-propanoxy)-甲酰胺-丙基]-ω-甲 氧基-聚氧化乙烯(α -[3′-(1，2-dimyristoyl-3-propanoxy)-carboxamide-propyl]-ω -methoxy-polyoxyethylene)(NOF Europe，Grobbendonk，Belgium)和对 应的0％，0.04％，0.4％，或1％的DSPE-PEG₂₀₀₀-DIG(见上)组成。在乙醇中 溶解脂和胆固醇。在pH 4的柠檬酸盐缓冲液中溶解AHA1-、DIG-连接的 AHA1-或荧光素酶(LUC)-siRNA。通过快速注射合适体积的乙醇脂混合物 至缓冲的水性siRNA溶液形成siRNA-脂纳米微粒。siRNA-脂纳米微粒随后 针对磷酸缓冲液(PBS)使用10kD MWCO Slide-A-盒(Thermo  Scientific，Rockford.IL)透析。确认siRNA-脂纳米微粒制备物的pH值， 并在Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments LTD，Malvern，UK)上通 过动态光散射测定siRNA-脂纳米微粒的大小分布和ζ电位。进行修改的 RiboGreen测定(Invitrogen GmbH，Darmstadt，Germany)以定量siRNA捕 获的程度。在将siRNA-脂复合物溶解在甲醇∶氯仿(10∶1，体积∶体积) 之后通过分光光度计测定总siRNA含量。siRNA-脂纳米微粒(RLX-107- RLX-115)的平均颗粒大小范围是从119nm-128nm(Z_平均值)，具有范围 从0.02-0.1的多分散性指数。在PBS中的ζ电位范围从-3至-4mV。封装 效率是95％-96％，最终siRNA浓度范围是从0.4mg/ml-0.5mg/ml。

(iii)DIG标记的siRNA-脂纳米微粒与<靶-DIG>双特异性抗体的复 合。包含1pmol的AHA1-，DIG连接的AHA1-，或荧光素酶(LUC)-siRNA 的DIG标记的siRNA-脂纳米微粒与3.24pmol的针对肿瘤相关LewisY寡 糖和DIG<LeY-DIG>或针对唾液酸结合跨膜蛋白CD22和DIG<CD22-DIG>的双 特异性抗体、或Dulbecco磷酸缓冲液(D-PBS)(Invitrogen，Carlsbad， CA)在200μl终体积的Opti-(Invitrogen GmbH，Darmstadt， Germany)中在室温孵育30分钟。

(iv)评估DIG标记的siRNA-脂纳米微粒组合<靶-DIG>双特异性抗体 的体外靶向和mRNA沉默性能；将MCF-7细胞以15000细胞/孔的密度在80μl 培养基(RPMI 1640培养基，10％胎牛血清，100U/ml青霉素/链霉素； Biochrom AG，Berlin，Germany)中接种在96孔板上，并在细胞培养箱中 孵育过夜(37℃，95％H₂O，5％CO₂)。在预孵育DIG标记的siRNA-脂纳米微 粒与<靶-DIG>双特异性抗体后(见上)，将20μl混合物加入MCF-7细胞， 得到包含1nM siRNA和无抗体(无AB)或1nM siRNA和3.24nM的<LeY-DIG> (LeY)或<CD22-DIG>(CD22)抗体的100μl的终体积。在细胞培养箱中培养 细胞12小时。作为对照，也在相同的抗体浓度但无siRNA或siRNA-脂纳 米颗粒(仅有AB)的条件下孵育细胞。作为另外的对照，用50nM与市售 的转染试剂Dharmafect 2(Dh2)(Dharmacon Inc.，Lafayette，CO)复合 的AHA1-或荧光素酶-siRNA根据制造商的说明书转染细胞。孵育后，裂解 细胞并使用市售的bDNA定量系统(Affymetrix Inc.，Fremont，CA)定量 AHA1-和GAPDH-mRNA浓度。将AHA1-mRNA信号标准化为GAPDH-mRNA信号， 并相对使用Dh2的荧光素酶-siRNA转染得到的信号(设定为100％)记录 AHA1/GAPDH-mRNA比例。

在没有使用<LeY-DIG>双特异性抗体时，siRNA-脂纳米微粒的效能随着 DSPE-PEG₂₀₀₀-DIG浓度的增加而减少，且包含1％DSPE-PEG2000-DIG的siRNA- 脂纳米微粒(RLX-107)没有介导靶AHA1-mRNA的击倒。相反地，将MCF-7 细胞与不含DSPE-PEG₂₀₀₀-DIG的制剂(RLX-110和RLX-115)孵育12小时分别 导致43％或41％的AHA1-mRNA击倒。更重要地，在对培养基加入<LeY-DIG> 双特异性抗体后，包含1％(RLX-110)，0.4％(RLX-108)，或0.04％(RLX-109) DSPE-PEG₂₀₀₀-DIG的脂质体制剂的AHA1-mRNA击倒效力分别显著增加了 14％，45％，或31％。<LeY-DIG>和<CD22-DIG>双特异性抗体对不含 DSPE-PEG₂₀₀₀-DIG的siRNA-脂纳米微粒的效力都没有影响。类似地，对含有 DSPE-PEG₂₀₀₀-DIG的siRNA-脂纳米微粒加入非靶向<CD22-DIG>双特异性抗 体对AHA1-mRNA击倒也没有作用。含有荧光素酶-siRNA的siRNA-脂纳米微 粒(RLX-111-RLX-114)也不影响AHA1-mRNA水平，不管使用哪种双特异性 抗体。当对不含DSPE-PEG₂₀₀₀-DIG但含有DIG-修饰的AHA1-siRNA的siRNA- 脂纳米微粒加入<LeY-DIG>双特异性抗体时，与加入<CD22-DIG>抗体 (RLX-115)相比，效力仅增加5％(图57)。

在表12和图57中总结的结果表示，通过使用<靶-Dig>双特异性抗体， 可有效和特异性地将DIG标记的siRNA-脂纳米微粒递送至在其细胞表面表 达靶向抗原的细胞。DIG标记的siRNA-脂纳米微粒的效力因此可在表达靶 抗原的细胞中被显著地特异性提高。由于<CD22-DIG>双特异性抗体没有在 DIG标记的siRNA-脂纳米微粒中传递此效应，以及<LeY-DIG>双特异性抗体 没有在其组成相同但不含靶向部分的siRNA-脂纳米微粒中传递此效应，令 人信服地显示了此方法对抗体、抗原和siRNA的特异性。此外，在用包含 Luc siRNA的siRNA-脂纳米微粒处理MCF-7细胞后，AHA1mRNA水平未受 影响。

表12：在用与<靶-Dig>双特异性抗体复合的DIG标记的siRNA-脂纳米 微粒处理后，在MCF-7细胞中siRNA介导的mRNA击倒。在用与<靶-Dig> 双特异性抗体预孵育的DIG标记的siRNA-脂纳米微粒孵育12小时后，在 表达LeY抗原但不表达CD22的MCF-7乳腺癌细胞中测定AHA1mRNA水平(相 对GAPDH)。