使用土壤杆菌对小麦属的植物进行基因导入的方法及小麦属的植物的转化植物的制作方法

摘要

本发明的方法的特征是包含将接种了土壤杆菌的植物组织用共存培养基培养后，去除选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。通过本发明，能够提供与传统公知的土壤杆菌法相比，以高效率进行小麦属植物的转化的基因导入方法和转化植物的制作方法。

说明书

技术领域

本发明涉及藉由土壤杆菌属细菌对小麦属的植物进行基因导入的方法。 本发明还涉及利用土壤杆菌属细菌，制作小麦属的植物的转化植物的方法。

背景技术

作为主要谷类即小麦、玉米、稻等单子叶植物的转化方法，传统上已知 有电穿孔法、粒子枪法等。但是，这些物理的基因导入方法存在如下问题： 导入了多拷贝的基因，无法以完整形式进行基因的插入，转化植物多见畸形、 不育，等等。

利用土壤杆菌细菌的基因导入法作为双子叶植物的转化法有着普遍的 应用。土壤杆菌属细菌的宿主仅限于双子叶植物，认为其不能寄生在单子叶 植物中(非专利文献1)，但正在进行用土壤杆菌转化单子叶植物的尝试。

1990年时，有研究报告提示，在稻、玉米、小麦等稻科作物中也能够 利用土壤杆菌进行基因导入，但其中的任何一个均不仅存在重现性问题，对 于导入的基因的确认也是不完全的，未能给出有说服力的结果(非专利文献 2)。

土壤杆菌法的改良

近年来，有报告称：通过利用具有强病原性土壤杆菌的一部分病原性基 因的超级二元载体，即使在稻、玉米等单子叶植物中，也能够进行稳定、高 效率的转化(非专利文献3和4)。这些报告认为，利用土壤杆菌进行的转化 除了能够实现稳定、高效率的转化之外，还具有下述优点：所得转化植物的 突变少，导入基因的拷贝数少、且多为完好形式。继在稻、玉米中取得成功 之后，还有报告称在大麦(非专利文献6)和高粱(非专利文献7)中利用土壤杆 菌进行了转化。

Ishida等人(1996)(非专利文献4)以玉米自交系(inbred)为材料利用土壤 杆菌进行了转化。其后，相继又有关于利用土壤杆菌转化玉米的报告(非专 利文献8-10)。作为改善利用土壤杆菌转化玉米的效率的尝试，有：在N6 基本培养基中转化选择细胞(非专利文献9)、在培养基中添加AgNO₃和羧苄 西林(非专利文献9、11)、在共存培养基中添加半胱氨酸(非专利文献10)， 等等。Ishida等人(2003)(非专利文献11)报告：通过用含AgNO₃和羧苄西林 的培养基选择共存培养后的玉米未成熟胚，提高了玉米的转化效率。

Hiei等人(2006)(非专利文献12)报告称：通过接种对土壤杆菌之前的 稻和玉米的未成熟胚实施热处理、离心处理，转化效率提高，并且对于目前 为止无法转化的品种也能够获得转化体。此外，Hiei和Komari(2006)(非专 利文献13)报告称：通过改变共存培养培养基的组成和凝胶化剂，籼稻中的 转化效率提高。

这样，通过对培养基组成、选择标记基因的修饰、作为材料的植物组织 片的前处理等的钻研，在利用土壤杆菌进行的稻和玉米的转化中，与最初的 报告相比，取得了显著的效率提高和适应品种扩展。

未成熟胚的利用

作为利用土壤杆菌进行单子叶谷物的转化的材料，未成熟胚和短期培养 的未成熟胚是最合适的。在玉米、小麦、大麦等作物中，未成熟胚是土壤杆 菌感染的主要靶标(Cheng等(2004)：非专利文献14)。

在主要谷类之中，对于玉米和高粱，在刚刚分离后的未成熟胚中接种土 壤杆菌并进行共存培养，然后进行了转化细胞和转化植物的选择。(Frame等 (2006)：非专利文献15，Ishida等(2007)：非专利文献16，Zhao等(2000)： 非专利文献7，Gurel等(2009)：非专利文献17)。

在以刚刚分离后的未成熟胚作为材料的稻的转化中，对接种土壤杆菌并 进行共存培养后的未成熟胚切除胚轴后加以利用。共存培养后去除胚轴是为 了去除共存培养中生长的芽、根(Hiei and Komari(2006)：非专利文献13， Datta and Datta(2006)：非专利文献18)。

此外，对于大麦，从接种土壤杆菌前的未成熟胚切除胚轴、或者造成胚 轴损伤，然后用于土壤杆菌的转化(Tingay等(1997)：非专利文献6，Sharawat 等(2007)：非专利文献19)。从分离的大麦的未成熟胚去除胚轴是困难的， 为了总是得到没有问题的未成熟胚，需要数日的联系(Jacobsen等，(2006)： 非专利文献20)。该繁杂操作是为了提高来自未成熟胚的愈伤组织形成率 (Sharawat等(2007)：非专利文献19)。

这样，对于上述的谷类，在以未成熟胚作为转化的材料时，就是否从未 成熟胚去除胚轴、以及去除胚轴时进行该操作的时期而言，根据作物的种类 不同有明确的区别。

对于作为主要谷类之一的小麦，有报告称尝试了以未成熟胚作为材料， 利用土壤杆菌制作转化植物。

例如，Cheng等(1997)(非专利文献5)报告称，在小麦(品种Bobwhite)的 未成熟胚、前培养后的未成熟胚和未成熟胚来源的愈伤组织中接种土壤杆 菌，用含G418的培养基进行转化细胞和植物的选择，以0.14～4.3％的效率 获得了转化体。其后，又有关于利用土壤杆菌制作转化小麦的报告，但直至 距Cheng等(1997)(非专利文献5)最初的报告已经过10年以上的今天，其效 率在基本上所有的报告中均小于5％，且适应品种也受到限制。而且，还存 在下述问题：难以重现已经报告的结果、不同实验获得的结果偏差大、能够 获得良好植物材料的时期有限等。

此外，对于小麦，在利用未成熟胚作为材料的报告中，有的报告称去除 胚轴，而未提及胚轴的切除操作的报告也很多，缺少一致性(Przetakiewicz等 (2004)：非专利文献21，Jones等(2005)：非专利文献22，Wan and Layton (2006)：非专利文献23，Wu等(2008)：非专利文献24，Khanna and Daggard (2003)：非专利文献25)。这其中，关于在小麦的转化中进行去除胚轴的处 理的报告均是从接种土壤杆菌之前的未成熟胚上切除。

而且，关于作为转化的材料的小麦未成熟胚的胚轴的切除，Jones等 (2005)：非专利文献22)的文献中记载，“使用未成熟胚时，早熟的接合子的 发芽(precocius zygotic germination)是重要的问题，但通过在培养培养基中添 加二氯甲氧苯酸(二氯甲氧苯酸a)、脱落酸、高浓度的2，4-D这样的植物激素， 可以将其抑制。数个作者明确表示，为了防止接合子的发芽，而除去或致伤 胚轴”。上述记载可以理解成，当在小麦的转化中使用未成熟胚时，如果使 用植物激素等，则可以解决未成熟胚的发芽问题，无需特别进行胚轴的处理。

此外，公开了下述内容：对于小麦的未成熟种子的目标组织(胚)，在该 植物存在于天然植物环境中的时间点接种土壤杆菌，并与该土壤杆菌共存培 养，然后通过目标组织的脱分化和再生获得转化植物，但这些文献中有关于 小麦未成熟胚的胚轴处理的记载(特表2002-541853(专利文献1)、Risacher 等(2009)：非专利文献33)。在专利文献1中，接种土壤杆菌，并在与该土 壤杆菌共存培养后切除胚轴，但该文献中是在评价了GUS(β-葡糖醛酸酶)的 表达后去除胚轴的。这就意味着是在进行了基因导入后再切除胚轴。而且， 在专利文献1所公开的技术中，是在天然植物环境中、即小麦未成熟种子的 胚附着于该植物的状态下，接种土壤杆菌的。

在非专利文献33中，使用与专利文献1相似的方法在目标组织(胚)的大 小约1mm的小麦未成熟种子中接种土壤杆菌后，将未成熟种子在附着于麦 穗的状态下保存2～3天。然后，从种子分离未成熟胚，着床于包含用于除去 土壤杆菌的抗生素的培养基上后，培养5天。然后，从培养后的未成熟胚切 除胚轴，再于同培养基上培养7天后，进行转化细胞的选择、再分化。

如以上所述，在利用土壤杆菌进行的小麦的转化中，采用传统方法虽可 获得转化植物，但转化效率远低于同为单子叶作物的稻、玉米，且实验的重 现性也存在问题。因而，希望开发出能够以高效率获得转化体的、重现性高 的方法。此外，对于小麦，关于胚轴的切除，在进行切除的时期方面有各种 种报告，尚未获得确定的认识。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特表2002-541853

专利文献2：WO1998/054961

专利文献3：WO2002/012520

专利文献4：特开2000-023675

专利文献5：WO2002/012521

专利文献6：WO2005/017169

专利文献7：WO2005/017152

专利文献8：WO2007/069643

非专利文献

非专利文献1：De Cleene，M.and De Ley，J.(1976)The host range of crown gall. Bot.Rev.42：389-466.

非专利文献2：Potrycus，I(1990)Gene transfer to cereals：an assessment. Bio/technology 8：535-542.

非专利文献3：Hiei，Y.，Ohta，S.，Komari，T.and Kumashiro，T.(1994)Efficient  transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and  sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal 6：271-282.

非专利文献4：Ishida，Y.，Saito，H.，Ohta，S.，Hiei，Y.，Komari，T.and  Kumashiro，T.(1996)High efficiency transformation of maize(Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.Nature Biotechnology 14：745-750.

非专利文献5：Cheng，M.，Fry，J.E.，Pang，S.，Zhou，H.，Hironaka， C.M.，Duncan，D.R.，Conner，T.W.，Wan，Y.(1997)Genetic transformation  of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens.Plant Physiol.115：971-980.

非专利文献6：Tingay，S.，McElroy，D.，Kalla，R.，Fieg，S.，Wang， M.，Thornton，S.，Brettell，R.(1997)Agrobacterium tumefaciens-mediated barley  transformation.Plant J.11：1369-1376.

非专利文献7：Zhao，Z.-Y.，Cai，T.，Tagliani，L.，Miller，M.，Wang， N.，Peng，H.，Rudert，M.，Schoeder，S.，Hondred，D.，Seltzer，J.，Pierce， D.(2000)Agrobacterium-mediated sorghum transformation.Plant Mol.Biol.44： 789-798.

非专利文献8：Negrotto，D.，Jolley，M.，Beer，S.，Wenck，A.R.，Hansen， G.(2000)The use of phosphomannose-isomerase as a selection marker to recover  transgenic maize plants(Zea mays L.)via Agrobacterium transformation.Plant  Cell Reports 19：798-803.

非专利文献9：Zhao，Z.-Y.，Gu，W.，Cai，T.，Tagliani，L.，Hondred， D.，Bond，D.，Schroeder，S.，Rudert，M.，Pierce，D.(2001)High throughput  genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize.Mol. Breed.8：323-333.

非专利文献10：Frame，B.R.，Shou，H.，Chikwamba，R.K.，Zhang，Z.， Xiang，C.，Fonger，T.M.，Pegg，S.E.K.，Li，B.，Nettleton，D.S.，Pei， D.，Wang，K.(2002)Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of  maize embryos using a standard binary vector system.Plant Physiol.129：13-22.

非专利文献11：Ishida，Y.，Saito，H.，Hiei，Y.，Komari，T.(2003)Improved  protocol for transformation of maize(Zea mays L.)mediated by Agrobacterium  tumefaciens.Plant Biotechnology 20：57-66.

非专利文献12：Hiei，Y.，Ishida，Y.，Kasaoka，K.，Komari，T.(2006)Improved  frequency of transformation of rice and maize by treatment of immature embryos  with centrifugation and heat prior to infection with Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Tissue and Organ Culture 87：233-243.

非专利文献13：Hiei，Y.，Komari，T.(2006)Improved protocol for  transformation of indica rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.Plant Cell  Tissue and Organ Culture 85：271-283.

非专利文献14：Cheng et al.(2004)Invited revier：Factors influencing  Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species.In Vitro  Cell.Dev.Biol.Plant 40：31-45.

非专利文献15：Frame et al.(2006)Maize(Zea mays L.)Methods inMolecular  Biology，vol.343 Agrobacterium prptocols，volume 1，Edited by Kan Wang， Humana Press Inc.，Totowa，NJ，185-199.

非专利文献16：Ishida et al.(2007)Agrobacterium-mediated transformation of  maize.Nature Protocols 2：1614-1621.

非专利文献17：Gurel et al.(2009)Efficient，reproducible  Agrobacterium-mediated transformation of sorghum using heat treatment of  immature embryos.Plant Cell Reports 28：429-444.

非专利文献18：Datta and Datta(2006)Indica Rice(Oryza sativa，BR29 and  IR64)Methods in Molecular Biology，vol.343Agrobacterium prptocols，volume 1，Edited by Kan Wang，Humana Press Inc.，Totowa，NJ，201-212.

非专利文献19：Sharawat et al.(2007)Agrobacterium tumefaciens-mesiated  genetic transformation of barley(Hordeum vulgare L.).Plant Science 172： 281-290.

非专利文献20：Jacobsen et al.(2006)Barley(Hordeum vulgare L.)Methods  in Molecular Biology，vol.343 Agrobacterium prptocols，volume 1，Edited by Kan  Wang，Humana Press Inc.，Totowa，NJ，171-183.

非专利文献21：Przetakiewicz et al.(2004)Agrobacterium-mediated  transformation of polyploid careals.The efficiency of selection and transgene  expression in wheat.Cellular&Molecular Biology Letters 9：903-917.

非专利文献22：Jones et al.(2005)Review ofmethodologies and a protocol for  the Agrobacterium-mediated transformation of wheat.Plant Methods 1：5

非专利文献23：Wan and Layton(2006)Wheat(Triticum aestivums L.)Methods  in Molecular Biology，vol.343 Agrobacterium prptocols，volume 1，Edited by  Kan Wang，Humana Press Inc.，Totowa，NJ，245-253.

非专利文献24：Wu et al.(2008)Efficient and rapid Agrobacterium-mediated  genetic transformation of durum wheat(Triticum turgidum L.var.durum)using  additional virulence genes.Transgenic Research 17：425-436.

非专利文献25：Khanna and Daggard(2003)Agrobacterium  tumefaciens-mediated transformation of wheat using a superbinary vector and a  polyamine-supplemented regeneration medium.Plant Cell Reports 21：429-436

非专利文献26：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.(2001)Molecular  Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，New York.

非专利文献27：Linsmaier，E.，Skoog，F.(1965)Organic growth factor  requirements of tobacco tissue culture.Physiol.Plant.18：100-127.

非专利文献28：Chu，C.-C.(1978)The N6 medium and its applications to anther  culture of cereal crops.In：Proc.Symp.Plant Tissue Culture.Peking：Science  Press，pp 43-50.

非专利文献29：Komari et al.(1989)Efficient selection of somatic hybrids in  Nicotiana tabacum L.using a combination of drug-resistance markers introduced  by transformation.Theor.Appl.Genet.77：547-552.

非专利文献30：Ke et al.(2002)Manipulation of discriminatory T-DNA delivery  by Agrobacterium into cells of immature embryos of barley and wheat.Euphytica  126：333-343

非专利文献31：Watson et al.(1975)Plasmid required for virulence of  Agrobacterium tumefaciens.J.Bacteriol.123：255-264.

非专利文献32：Kan Wang(2006)Preface Methods in Molecular Biology， vol.343 Agrobacterium prptocols，volume 1，Edited by Kan Wang，Humana Press  Inc.，Totowa，NJ，vii-viii.

非专利文献33：Risacher et al.(2009)Highly Efficient Agrobacterium- Mediated Transformation of Wheat Via In Planta Inoculation.Method in  Molecular Biology，Transgenic Wheat，Barley and Oats，vol.478，Humana  Press.115-124.

非专利文献34：Jones et al.(2005)Review of methodologies and a protocol for  the Agrobacterium-mediated transformation of wheat.Plant Methods I：5

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的是提供：与传统公知的土壤杆菌法相比能够以高效率进行 转化的、对小麦属(Triticum)的植物进行基因导入的方法，以及小麦属的转化 植物的制作方法。

解决问题的方法

本发明人等为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过与将接种 了土壤杆菌的小麦属植物的未成熟胚或完全成熟种子的组织用共存培养基 进行培养的共存步骤同时和/或在该共存步骤之后，物理地/化学地损伤选自 幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位，与传统方法相比，小麦属植物的转化 效率提高，从而想到了本发明。

本发明优选通过诸如以下记载的实施方式进行，但不限于此。

[实施实施方式1]

一种对小麦属(Triticum)植物的未成熟胚或完全成熟种子的组织进行基 因导入的方法，上述方法包括：

(i)进行将接种了土壤杆菌的上述组织在该土壤杆菌的存在下进行培养 的共存步骤；以及

(ii)与该共存步骤同时和/或在该共存步骤之后，进行在上述组织中物理 地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。

[实施方式2]

一种小麦属(Triticum)植物的转化植物的制作方法，上述方法包括：

(i)进行将接种了土壤杆菌的未成熟胚或完全成熟种子的组织在该土壤 杆菌的存在下进行培养的共存步骤；

(ii)与该共存步骤同时和/或在该共存步骤之后，进行在上述组织中物理 地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤；

(iii)进行对上述组织用休眠培养基进行培养的休眠步骤；然后

(iv)进行对上述组织用再分化培养基进行再分化的步骤。

[实施方式3]

实施方式1或2所述的方法，其中，在所述组织中物理地/化学地损伤 选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位是从组织去除选自幼根、幼芽和胚 轴中的至少一个部位。

[实施方式4]

实施方式1～3中任一项所述的方法，其中，与所述共存步骤同时和/或 在该共存步骤开始后7天以内，进行在所述组织中物理地/化学地损伤选自 幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。

[实施方式5]

实施方式1～3中任一项所述的方法，其中，所述共存步骤开始后1天～3 天，进行在所述组织中物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少 一个部位的步骤。

[实施方式6]

实施方式1～5中任一项所述的方法，其中，所述共存培养基是不含植物 生长调节剂的培养基。

[实施方式7]

实施方式1～6中任一项所述的方法，其中，进行以下的转化效率提高处 理中的至少1个。

a)离心处理；

b)向共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜；

c)热处理；

d)热和离心处理；

e)加压处理；

f)在粉末存在下接种土壤杆菌的处理；

g)在共存培养基中添加半胱氨酸的处理。

[实施方式8]

实施方式1～6中任一项所述的方法，其中，进行以下的a)和/或b)的转 化效率提高处理。

a)离心处理；

b)向共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜。

[实施方式9]

实施方式2～8中任一项所述的方法，其中，在上述(iii)休眠步骤与(iv) 再分化步骤之间包括药物选择步骤。

[实施方式10]

实施方式2～9中任一项所述的方法，其中，(iii)休眠培养基和/或药物选 择步骤的选择培养基包含植物生长调节剂。

[实施方式11]

实施方式1～10中任一项所述的方法，其中，所述土壤杆菌是选自 LBA4404、EHA101、EHA105、AGL1C和58C1中的菌。

[实施方式12]

实施方式1～11中任一项所述的方法，其中，小麦属植物是普通小麦 (T.aestivum)或硬粒小麦(T.durum)。

发明的效果

根据本发明，能够以高效率进行小麦属植物的转化。由此，能够稳定、 且重现性好地获得转化后的植物体，还可以削减用于获得该植物体的成本。

附图说明

图1是显示幼根、幼芽和胚轴的切除对从接种了土壤杆菌的小麦 未成熟胚形成愈伤组织的影响的图表。测试各区36-43的未成熟胚。而且， 在图1的实验中，在接种土壤杆菌后、切除幼根、幼芽和胚轴前，将小麦未 成熟胚着床于共存培养基。纵轴表示未成熟胚的愈伤组织形成指数，横轴表 示自接种土壤杆菌后、直至从未成熟胚切除幼根、幼芽和胚轴并着床于休眠 培养基的天数。愈伤组织形成指数是在接种后第9天，对各个未成熟胚采用 以下3个等级进行评价而得到的值：1(胚盘的一半以上愈伤组织化)、0.5(胚 盘的一部分愈伤组织化)、0(无愈伤组织形成)。横轴的“0天”表示在接种土壤 杆菌前切除了胚轴的未成熟胚。“2天无切除”表示在未切除胚轴的情况下接 种土壤杆菌后、在未切除胚轴的情况下在接种土壤杆菌后第2天着床于休眠 培养基的未成熟胚。

图2是显示幼根、幼芽和胚轴的切除对接种了土壤杆菌的小麦未 成熟胚的愈伤组织形成的影响的图表。而且，在图2的实验中，无论在第几 天进行切除，均是在接种并开始共存培养后的第2天将小麦未成熟胚着床于 休眠培养基。纵轴表示未成熟胚的愈伤组织形成指数，横轴表示自接种土壤 杆菌后、直至从未成熟胚切除幼根、幼芽和胚轴的天数。愈伤组织形成指数 的计算方法同图1。横轴的“0天”表示在接种土壤杆菌前切除了胚轴的未成 熟胚。“无切除”表示在未切除胚轴的情况下接种土壤杆菌后、在未切除胚轴 的情况下在接种土壤杆菌后第2天着床于休眠培养基的未成熟胚。

图3是表示针对离心处理的时期对转化效率的影响进行研究的结 果的图表。在图3中，A区是在对未成熟胚接种土壤杆菌之前，进行了15,000 rpm、10分钟的离心处理的实验区。B区是对未成熟胚接种土壤杆菌并切除 了幼根、幼芽和胚轴后，进行了15,000rpm、10分钟的离心处理的实验区。 C区是对未成熟胚接种土壤杆菌并进行15,000rpm、10分钟的离心处理后， 进行了幼根、幼芽和胚轴的切除的实验区。对于各个未成熟胚，采用以下6 个等级，对用休眠培养基培养5天后的未成熟胚中的GUS基因的表达进行 了评价：4(在胚盘的75％以上中表达)、3(在胚盘的50-74％中表达)、2(在胚 盘的25～49％中表达)、1(在胚盘的5～24％中表达)、0.5(在胚盘的1～4％中表 达)、0(无表达)。对于各区19～25个未成熟胚进行评价，其平均值如图3的 纵轴所示。即，在图3中，纵轴表示根据GUS基因的表达对基因导入效率 进行评价的结果。

图4是显示添加在共存培养基中的5μM植物激素的添加对转化 效率的影响的研究结果的图表。图4中的3个柱从左起分别表示未添加植物 激素的实验区、添加5μM的细胞分裂素(kinetin)的实验区和添加5μM的 4PU的实验区。对于各个未成熟胚，采用以下6个等级评价了用休眠培养基 培养5天后的未成熟胚中的GUS基因的表达：4(在胚盘的75％以上中表达)、 3(在胚盘的50-74％中表达)、2(在胚盘的25～49％中表达)、1(在胚盘的5～24％ 中表达)、0.5(在胚盘的1～4％中表达)、0(无表达)。对于各区16～17个未成熟 胚进行评价，其平均值示于图4的纵轴。即，图4中，纵轴表示根据GUS 基因的表达对各实验区的基因导入效率进行评价的结果。

图5是显示添加在共存培养基中的0.5μM的植物激素的添加对转 化效率的影响的研究结果的图表。图5中的4个柱从左起分别表示未添加植 物激素的实验区、添加0.5μM的2，4-D的实验区、添加0.5μM的毒莠定的实 验区、和添加0.5μM的二氯甲氧苯酸的实验区。对于各个未成熟胚，采用以 下6个等级评价了用休眠培养基培养5天后的未成熟胚中的GUS基因的表 达：4(在胚盘的75％以上中表达)、3(在胚盘的50-74％中表达)、2(在胚盘的 25～49％中表达)、1(在胚盘的5～24％中表达)、0.5(在胚盘的1～4％中表达)、 0(无表达)。对各区10个未成熟胚进行评价，其平均值示于图5的纵轴。即， 在图5中，纵轴表示根据GUS基因的表达对各实验区的基因导入效率进行 评价的结果。

图6是显示添加在共存培养基中的5μM植物激素的添加对转化效 率的影响的研究结果的图表。图6中的4个柱从左起分别表示未添加植物激 素的实验区、添加5μM的毒莠定的实验区、添加5μM的2，4-D的实验区、 和添加5μM的二氯甲氧苯酸(Dicamba)5μM的实验区。对于各个未成熟胚， 采用以下6个等级评价了用休眠培养基培养5天后的未成熟胚中的GUS基 因的表达：4(在胚盘的75％以上中表达)、3(在胚盘的50-74％中表达)、2(在 胚盘的25～49％中表达)、1(在胚盘的5～24％中表达)、0.5(在胚盘的1～4％中 表达)、0(无表达)。对各区18～19个未成熟胚进行评价，其平均值示于图6 的纵轴。即，在图6中纵轴表示根据GUS基因的表达对各实验区的基因导 入效率进行评价的结果。

发明的具体实施方式

以下对本发明的构成进行具体说明。

本发明提供一种基因导入方法，其是对小麦属(Triticum)植物的未成熟胚 或完全成熟种子的组织进行基因导入的方法，其包括：

(i)进行将接种了土壤杆菌的上述组织在该土壤杆菌的存在下进行培养 的共存步骤；

(ii)与该共存步骤同时和/或在该共存步骤之后，进行在上述组织中物理 地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。

本发明还提供一种方法，其是小麦属(Triticum)植物的转化植物的制作方 法，其包括：

(i)将接种了土壤杆菌的、未成熟胚或完全成熟种子的组织在该土壤杆菌的存 在下进行培养的共存步骤；

(ii)与该共存步骤同时和/或在该共存步骤之后，进行在上述组织中物理地/化 学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤；

(iii)进行将上述组织用休眠培养基进行培养的休眠步骤；然后

(iv)进行将上述组织用再分化培养基进行再分化的步骤。

在本发明中，可使用的植物组织所来源的植物是小麦属植物。而且，作 为本说明书中的“小麦属”植物的例子，并非限定，作为一粒系小麦，可以列 举出野生一粒小麦(T.aegilopoides)、沙达一粒小麦(T.thaoudar)、和、一粒小 麦(T.monococcum)；作为二粒系小麦，可以列举出野生二粒小麦 (T.dicoccoides)、栽培二粒小麦(T.dicoccum)、金字塔形穗小麦(T.pyromidale)、 高粒山小麦(T.orientale)、硬粒小麦(T.durum)、圆锥小麦(T.turgidum)、波兰 小麦(T.polonicum)、和波斯小麦(T.persicum)；作为三粒系小麦，可以列举出 普通小麦(T.aestivum)、斯卑尔脱小麦(T.spelta)、密穗小麦(T.compactum)、印 度圆粒小麦(T.sphaerococcum)、莫迦小麦(T.maha)和瓦维洛夫小麦 (T.vavilovii)。在本发明中，普通小麦(T.aestivum)或硬粒小麦(T.durum)是优 选的，普通小麦(T.aestivum)是特别优选的。

此外，在本发明中可使用的植物组织是未成熟胚和完全成熟种子，优选 未成熟胚。在本说明书中“未成熟胚”是指：处于受粉后的成熟过程中的未成 熟种子的胚。对用于本发明的方法的未成熟胚的时期(熟期)没有特殊限制， 可以在受粉后的任何时期采集，优选受粉后7～21天后的未成熟胚。

此外，在本说明书中“完全成熟种子”是指：受粉后的成熟过程结束、作为种 子已完全成熟。

以下对上述各步骤进行具体说明。

1.关于本发明的各步骤

本发明的基因导入方法以及转化植物的制作方法利用土壤杆菌细菌。除 了特别提及的步骤以外，可以按照公知的利用土壤杆菌细菌的基因导入方 法、转化方法的各步骤来进行。

(1)关于共存步骤

在本发明中，进行将接种了土壤杆菌的、未成熟胚或完全成熟种子的组 织在该土壤杆菌的存在下进行培养的共存步骤。本步骤是通过将接种了土壤 杆菌的植物组织在土壤杆菌的共存下进行培养，切实地进行从土壤杆菌向植 物细胞的DNA的导入的步骤。

本发明的基因导入方法和转化植物的制作方法中，优选从小麦属植物的 植物体分离、采集可使用的植物组织后使用。因此，在本发明中，首先从小 麦属植物的植物体分离、采集组织(未成熟胚、完全成熟种子)，然后进行对 该分离、采集的组织接种土壤杆菌。

在本发明中，所使用的植物组织为未成熟胚时，对其大小没有特殊限制。 例如，非专利文献33中使用的小麦未成熟胚的大小是1mm；此外，Jones等 (2005)(非专利文献34)记载，小麦的转化中使用的未成熟胚的大小必须是 0.8-1.5mm。

但是，本发明人等发现：在小麦中，具有一定以上的大小能够进一步提 高转化效率(实施例10)。因此，在本发明中使用的小麦未成熟胚优选具有一 定以上的大小。并非限定，接种土壤杆菌时的小麦未成熟胚优选1.2mm以 上的大小、更优选超过1.5mm的大小、最优选2.2mm以上。

而且，进一步，对本发明中使用的小麦未成熟胚的大小的上限没有特殊 限制，可以是能够从作为基因导入的对象的小麦属植物获得的最大的未成熟 胚。例如，能够从Fielder品种获得的最大的未成熟胚是通常3.0mm左右的 大小，这样的未成熟胚也优选利用。

诸如上述的植物组织可以进行用于提高转化效率的各种处理。作为这样 的处理，可以列举出例如：加热处理(专利文献2)、离心处理(专利文献3)、 热和离心处理(专利文献5)、以及加压处理(专利文献6)等。这样的处理可以 在土壤杆菌的接种之前实施，也可以与土壤杆菌的接种同时进行，或者还可 以在土壤杆菌的接种之后实施。这样的用于提高转化效率的处理将在后面详 述。

在本发明中，对小麦属植物的组织接种土壤杆菌。

本说明书中使用的“接种”是指：使土壤杆菌与植物的组织(例如胚盘)接 触，本技术领域中各种接种土壤杆菌的方法是公知的。作为本方法，可以列 举出例如：在将土壤杆菌悬浮在液体培养基中而得到的悬浊液中加入植物组 织的方法、将土壤杆菌的悬浊液直接滴加到共存培养基上的植物组织上的方 法、向植物组织中注入土壤杆菌悬浊液的方法、和将植物组织浸渍在土壤杆 菌悬浊液中并减压的方法等。然而，本发明中的土壤杆菌的接种方法不限于 上述方法。

在接种该土壤杆菌时，为了改善利用土壤杆菌的转化效率，可以使土壤 杆菌的悬浊液中包含例如乙酰丁香酮、表面活性剂、多孔性陶瓷等各种添加 剂。

对本发明中可使用的土壤杆菌没有特殊限制，可以是在利用土壤杆菌的 转化法中可使用的、公知的任何土壤杆菌。在本发明的优选方式中，土壤杆 菌为例如LBA4404、EHA101、EHA105、AGL1和C58C1等，但不限于此。 当在载体方面不使用超级二元载体(非专利文献3和4)时，从转化效率的观 点来看，优选使用含有土壤杆菌A281(非专利文献31)所具有的Ti质粒 pTiBo542的菌株。

公知土壤杆菌具有将插入在土壤杆菌内的质粒T-DNA中的基因导入到 植物的基因组中的性质。因此，可在本发明中使用的土壤杆菌具有将希望在 植物内表达的基因插入到T-DNA中而得到的质粒。于是，通过将具有该质 粒的土壤杆菌接种到植物组织，可以转化植物。这样，可以赋予组织中的植 物细胞以优选的性状。可在本发明中使用的土壤杆菌用质粒例如有pSB131、 U0009B、U0017S、pSB134、pNB131和pIG121Hm等，但不限于此。

本步骤中使用的培养基在本说明书中称为“共存培养基”。共存培养基可 以是植物细胞培养中通常使用的培养基，可以列举出例如以LS无机盐类(非 专利文献27)、N6无机盐类(非专利文献28)为基本成分的培养基。此外，并 非限定，优选降低了诸如上述的通常在组织培养中使用的培养基中所含的无 机盐类和/或维生素量的培养基，更优选降低至1/5以下的培养基，更优选降 低至1/10以下的培养基，具体地可以适合使用1/10浓度MS培养基等。

Ke等(2002)(非专利文献30)公开了对于大麦使用不含植物生长调节剂 的共存培养基的例子。

但是，并不限于此，在本发明中共存培养基中可以添加2，4-二氯苯氧 基乙酸(2，4-D)、毒莠定、或其他生长素类作为生长素类。或者，还可以添加 细胞分裂素、4PU这样的细胞分裂素等其他植物生长调节剂。

而且，本发明人等发现：如下述的实施例1和9所示，共存培养基中的 生长素类的浓度低，则转化效率提高。因此，在本发明中，共存培养基中所 含的生长素类的浓度没有特殊限制，优选5μM以下、更优选0.5μM以下， 最优选完全不含生长素类的方式。

而且，为了提高转化效率，还可以在共存培养基中加入各种添加剂。作 为这样的添加剂，可以列举出例如硝酸银(专利文献4)、硫酸铜(专利文献7) 和半胱氨酸(非专利文献14)等。

本步骤中“培养”是指：使植物组织着床(置床)于固体化的共存培养基上 或液态共存培养基中，使之在合适的温度、明暗条件和时间(期間)内生长发 育。在本发明中，培养基的方式没有特殊限制，只要能够对植物组织充分供 给培养基成分即可。共存培养基的固体化可以通过添加本技术领域公知的固 体化剂来进行，作为这样的固体化剂，已知有例如琼脂糖等。在本发明中， 可以适合使用这样的固体化的共存培养基。本步骤中的培养温度可以适宜地 选择，优选在20℃-35℃、更优选在23℃进行。此外，本步骤的培养优选在 暗处进行，但不限于此。本步骤的培养时间也可以适宜选择，优选为1天-5 天、更优选为2天。

(2)关于进行选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的物理的/化学的损伤的步骤

与上述的共存步骤同时和/或在该共存步骤后，进行在组织中物理地/化 学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。本发明的特征之 一是通过提高该步骤基因导入的效率和植物的转化的效率。

在本发明中，对用于“物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至 少一个部位”的手段没有特殊限制，包括各种物理的处理和化学的处理。并 非进行限定，物理的处理包括例如：用锋利的刀具(例如手术刀)进行切除或 者伤害、利用具有锋利尖端的器具(例如镊子)进行去除或者伤害等。化学的 处理包括例如：利用使植物细胞的机能消失或者降低的酸性、碱性物质、对 细胞具有毒性的除草剂成分等药物进行处理等。在本发明中，物理地“去除” 选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位是优选的方式。

而且，胚是将来成为植物体的部分，包含幼根、幼芽、胚轴。胚轴是指 作为胚的轴的圆柱形部分，其上端长出幼芽，其下端长出幼根。在本说明书 中，幼根、幼芽、胚轴应理解为本技术领域中通常使用的含义。

此外，在本说明书中，“选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位”(以 下称为“上述部位”)是指：选自幼根、幼芽、胚轴中的1个、2个、或3个部 位的全部组合。具体地，其组合如下；1)幼根、2)幼芽、3)胚轴、4)幼根和 幼芽、5)幼根和胚轴、6)幼芽和胚轴、7)幼根和幼芽和胚轴。

对于作为本发明的对象的小麦属植物而言，即使进行共存培养，该步骤 中也不会有像稻一般的程度的芽、根伸长。因此，在本发明中，若在共存培 养后进行去除胚轴的操作，则实际上多是与胚轴干一起切除幼根和幼芽。但 是，如果在切除胚轴时，没有伤害幼根、幼芽，则残留的幼根、幼芽有伸长 的可能性。为了进行土壤杆菌介导的基因导入，有必要使植物组织脱分化而 愈伤组织化，所以不优选幼根、幼芽这样地伸长。因此，与胚轴一起切除幼 根、幼芽，是本发明中的适宜方式。但是，通过在尚未长出幼根、幼芽的状 态的胚轴中仅去除胚轴，也能够实现本发明的目的。与共存步骤同时和/或 在共存步骤后物理地/化学地损伤上述部位这一点是本发明的最显著的特 征。

在本说明书中，“在共存步骤之后”是指：在共存步骤后进行的休眠步骤 中，对在土壤杆菌共存下培养的小麦属植物的上述部位进行物理的/化学的 损伤。

此外，在本说明书中，“与共存步骤同时”是指：在进行共存步骤的期间 物理地/化学地损伤上述部位。这样的情况也包含在本发明中，作为一个方 式。

此外，在本说明书中，“与共存步骤同时和/或在共存步骤之后”是指：

1)在共存步骤中损伤上述部位的实施方式，例如，在共存步骤中将植 物组织从共存培养基取出，进行损伤处理，再放回共存培养基的实施方式；

2)在共存步骤后、休眠步骤前损伤上述部位的实施方式；

3)在休眠步骤中损伤上述部位的方式，例如，在休眠步骤中将植物组 织从休眠培养基取出，进行损伤处理，再放回休眠培养基的实施方式；

和

4)在上述1)～3)中任意的多个阶段中损伤上述部位的实施方式。这些实 施方式全部包含在本发明中。

作为进行上述的损伤的时期，并非限定，优选在共存步骤开始后7天以 内进行。更优选在共存步骤开始后1天～3天进行。若在共存步骤开始后1 天～3天切除幼根、幼芽和胚轴，则无论是着床于共存培养基直至切除、还 是切除前转移至下述的休眠培养基，均可见愈伤组织诱导率和基因导入效率 的提高，如实施例2和实施例3所示。

(3)关于休眠步骤

本发明的转化植物的制作方法中，在上述共存步骤后进一步经过休眠步 骤、再分化步骤，制作转化植物。

在休眠步骤中，在共存步骤后将植物组织用休眠培养基进行培养。本步 骤是在共存步骤后从植物细胞除去土壤杆菌的同时、进行植物细胞的增殖的 步骤。

本步骤中使用的培养基在本说明书中中称作“休眠培养基”。休眠培养基 可以是植物细胞培养中通常使用的，可以列举出例如以LS无机盐类(非专利 文献27)、N6无机盐类(非专利文献28)为基础的培养基等。而且，本步骤中 的休眠培养基优选包含抗生素。休眠培养基中所含的抗生素与下述的选择步 骤中使用的选择用抗生素不同，其以土壤杆菌的除菌为目的。并非限定，作 为抗生素，可以优选使用头孢噻肟和/或羧苄西林。

本步骤中的休眠培养基中优选包含植物生长调节剂。作为植物生长调节 剂，优选包含属于生长素类的毒莠定和/或2，4-D。生长素类一般具有使植物 组织脱分化的作用，因而本步骤和接下来的选择步骤中，基本上所有植物组 织的一部分或全部成为脱分化组织(愈伤组织)。本说明书中使用的术语“脱分 化组织”或“愈伤组织”是指：通过用含生长素和细胞分裂素等植物生长调节 剂的培养基培养经分化的植物组织的一部分(外植体)而得到的组织，该组织 是无定形的未分化状态的细胞块，其不具有作为原来的植物组织的形态。因 此，所有涉及脱分化组织的实施方式，包括以脱分化组织的状态开始进行共 存步骤的情况，以及分化的植物组织在共存步骤中或后续的选择步骤中全部 脱分化和部分脱分化的情况等等，均在本发明的范围内。

本步骤中“培养”是指：使植物组织着床于固体化的休眠培养基上或液体 休眠培养基中，使之在合适的温度、明暗条件和时间内生长发育。在本发明 中，对培养基的形态没有特殊限制，能够对植物组织充分供给培养基成分即 可。休眠培养基的固体化可以通过添加本技术领域公知的固体化剂来进行， 作为这样的固体化剂，已知有例如琼脂糖等。本步骤中的培养温度可以适宜 地选择，优选在20℃-35℃、更优选25℃进行。此外，本步骤的培养优选在 暗处进行，但不限于此。本步骤的培养时间也可以适宜选择，优选为1天-10 天、更优选为5天。

(4)选择步骤

以下记载的选择步骤和再分化步骤为在利用土壤杆菌的植物的转化方 法中通常采用的方法。而且，在本发明的转化植物的制作方法中，该选择 步骤不是必需的。这是因为，例如在进行后述的转化提高处理的情况下，即 使不经过选择步骤，也能够获得目的转化体。而且，在进行选择步骤的情况 下，以下的记载仅用于示例，本发明不受以下的记载的限定。

本步骤是从上述步骤获得的组织中根据基因导入的有无来选择转化体 的步骤。本步骤中使用的培养基在本说明书中称作“选择培养基”。可作为选 择培养基使用的培养基可以列举出例如：以LS无机盐类(非专利文献27)、 N6无机盐类(非专利文献28)为基本成分的培养基，具体地有例如LSD1.5培 养基等。

根据一般的使用土壤杆菌的转化法，选择培养基中添加生长素类、优选 2，4-D和/或毒莠定。在本发明中，选择培养基中包含植物生长调节剂也是优 选的方式。本选择步骤中使用的生长素类没有特殊限制，优选2，4-D和/或毒 莠定。而且，视需要可以加入各种添加剂。

转化植物的选择，可以通过例如用含适当选择药物的选择培养基培养经 过上述共存步骤和/或休眠步骤的植物，根据有无对选择药物的抗性来进行。 作为可以在本步骤中使用的选择药物，可使用本技术领域通常使用的选择药 物。例如，作为选择药物，可以使用抗生素或除草剂。作为抗生素，可以使 用例如潮霉素(Hygromycin)、卡那霉素或灭瘟素S(blastcidin S)等。而且，作 为除草剂，可以使用例如草胺膦(phosphinothricin)、双丙氨膦(bialaphos)或草 甘膦(glyphosate)等。

为了进行本选择步骤，插入土壤杆菌中的T-DNA中的DNA，不仅要包 含希望在植物中表达的基因，还必须包含例如对选择药物的抗性基因等。这 样的对选择药物的抗性基因在本技术领域是公知的。在本步骤中，例如在含 潮霉素的选择培养基中进行选择的情况下，除了希望在植物内表达的基因 外，还必须导入潮霉素抗性基因。

或者，转化植物的选择可以基于植物细胞的糖营养缺陷性(糖要求性)来 进行。已知植物细胞能够利用的糖有蔗糖、葡萄糖等，但不能利用甘露糖。 因此，用仅含甘露糖作为碳源的培养基培养植物组织时，由于没有可利用的 糖，植物组织会枯死。基于糖营养缺陷性的选择正是利用了这一原理。即， 为了利用该选择方法，插入土壤杆菌中的T-DNA中的DNA除了希望在植 物中表达的基因外，还必须包含磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose  isomerase：PMI)基因。此处，导入了PMI基因的植物细胞能够利用甘露糖 作为碳源。因此，仅有用如上述的土壤杆菌转化了的植物组织能够在仅以甘 露糖为碳源的培养基上生长发育，这样就能够仅选择出转化植物组织(非专 利文献8)。这样的方法也可以针对其它糖进行。例如，导入了木糖异构酶基 因的植物细胞能够利用木糖作为碳源，因此适用于这种方法。

此外，可以导入容易检测的基因作为筛选的指标，通过有无该基因的表 达来进行选择。作为这种作为筛选的指标的基因，可以列举出GFP基因等。 检测表达这些基因的细胞、组织的方法是本技术领域公知的。

本步骤可以变更培养基的成分组成，反复进行多轮。例如，在多轮选择 步骤中，通过在各轮选择步骤中提高选择药物的浓度，可以增强药物选择的 切实可行性，提高获得转化植物体的可能性。本选择步骤优选进行至少1轮、 更优选进行2轮。此外，在进行多轮选择步骤的情况下，通过切割取下用含 选择药物的培养基培养的组织中的增殖部分，仅将该增殖部分用于下一轮选 择步骤，可以高效地获得转化组织。

本步骤中“培养”是指：使植物组织着床于固体化的选择培养基上或液体 选择培养基中，使之在合适的温度、明暗条件和时间内生长发育。在本发明 中，对培养基的形态没有特殊限制，能够对培养基成分充分供给植物组织即 可。选择培养基的固体化可以利用诸如上述的琼脂糖等进行。本步骤中的培 养温度可以适宜地选择，优选在20℃-35℃、更优选在25℃进行。此外，本 步骤的培养优选在暗处进行，但不限于此。本步骤的培养时间也可以适宜选 择，例如，在进行2轮选择步骤的情况下，可以第1轮选择进行2周、第2 轮选择进行3周，共计5周。此外，多轮选择步骤整体优选进行3-8周、更 优选4-6周。此外，在进行多轮的选择的情况下，可以变更每轮的培养时间、 温度和明暗条件。

(5)再分化步骤

将用休眠培养基培养得到的组织，视需要进行选择后，进行用再分化培 养基进行再分化的步骤。本步骤中使用的培养基在本说明书中称作“再分化 培养基”。再分化培养基不含生长素类。

作为再分化培养基，可以列举出例如以LS无机盐类、N6无机盐类为基 本成分的培养基，具体例如有LSZ培养基等。

再分化培养基可以包含选择药物。可以在本步骤中使用的选择药物与选 择步骤中定义的相同。然而，在本步骤中，并非一定要使用与选择步骤中使 用过的选择药物相同的选择药物。在这种情况下，必须从土壤杆菌向植物中 导入针对2种以上的选择药物的抗性基因。

本发明中“再分化”是指：全部或部分脱分化的植物组织重新获得原植物 组织或植物体的性质。若在共存步骤和/或选择步骤中使用生长素类，植物 组织的全部或一部分脱分化。因此，通过进行本步骤，脱分化组织发生再分 化，可以获得完整的转化植物体。

本步骤中“培养”是指：使植物组织着床于固体化的再分化培养基上或液 体再分化培养基中，使之在合适的温度、明暗条件和时间内生长发育。在本 发明中，对培养基的形态没有特殊限制，能够对植物组织充分供给培养基成 分即可。再分化培养基的固体化可以利用诸如上述的琼脂糖等进行。本步骤 中的培养温度可以适宜地选择，优选在20℃-35℃、更优选25℃进行。此外， 本步骤的培养优选在16-24小时/天的照明下进行，但不限于此。本步骤的培 养时间也可以适宜选择，优选7天-21天，更优选14天。

2.关于本发明中采用的转化提高处理

此外，在本发明的基因导入方法和转化植物的制作方法中，可以进行下 述的转化提高处理。在本说明书中，“转化提高处理”是指：用于实现转化效 率的提高的处理。作为这样的转化提高处理，并非限定，包括例如以下这样 的处理或者它们的组合。这样的处理可以在土壤杆菌接种前实施，也可以与 土壤杆菌接种同时进行，或者还可以在土壤杆菌接种后实施，在土壤杆菌接 种后实施时，可以在切除胚轴前或后进行。

a)离心处理(参照：WO2002/012520：专利文献3)、

b)向共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜(参照：AgNO₃(Zhao等2001： 非专利文献9、Ishida等2003：非专利文献11、专利文献4)； CuSO₄(WO2005/017152：专利文献7))、

c)热处理(参照：WO1998/054961：专利文献2)、

d)热和离心处理(参照：WO2002/012521：专利文献5)、

e)加压处理(参照：WO2005/017169：专利文献6)、

f)在粉末存在下接种土壤杆菌的处理(参照：WO2007/069643：专利文献 8)、以及

g)在共存培养基中添加半胱氨酸的处理(Frame等2002：非专利文献10)。

这其中，离心处理、热处理、热和离心处理、加压处理、粉末的添加均 是提高基因导入效率的处理，而硝酸银、硫酸铜的添加具有提高愈伤组织诱 导率的效果。此外，在再分化培养基中添加硫酸铜，可以提高再分化效率。

并非限定，离心处理可以采用例如WO02/012520(专利文献3)所述的方 法来进行。例如，在使植物材料与土壤杆菌接触之前，以100G～25万G、 优选500G～20万G、更优选1000G～15万G的离心加速度处理1秒～4小时、 更优选1秒～2小时。

此外，离心处理可以在共存步骤后进行。本发明人等发现：若对小麦进 行离心处理，则具有提高愈伤组织诱导率的效果。这种情况下的离心处理条 件可以与专利文献3所述的条件相同。具体地，可以在通常100G～25万G、 500G～20万G、优选1000G～15万G、最优选1100G～11万G左右的离心加 速度范围进行。此外，离心处理的时间可以根据离心加速度适宜选择，通常 优选进行1秒钟以上。对离心时间的上限没有特殊限制，通常10分钟左右 即可实现目的，可以进行1秒钟～4小时、更优选1秒钟～2小时处理。此外， 在离心加速度大的情况下，离心处理时间即使是极短时间、例如1秒以下也 能够显著提高基因导入效率。另一方面，在离心加速度小的情况下，通过长 时间进行离心处理，能够显著提高基因导入效率。而且，合适的离心处理条 件可以通过常规实验容易地设定。

如以上所述的离心处理可以在共存培养前进行，或者也可以在共存培养 后、切除胚轴前或后进行。因此，在本发明中，共存培养前和/或共存培养 后进行植物材料的离心处理是适宜方式。

在共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜，记载于例如Zhao等2001(非 专利文献9)、Ishida等2003(非专利文献11)、WO2005/017152。硝酸银和/ 或硫酸铜可以以例如1μM～50μM、优选1μM～10μM的浓度添加到共存培养 基中。

热处理可以采用例如WO1998/054961(专利文献2)所述的方法来进行。 例如，在使植物材料与土壤杆菌接触前，于33℃～60℃、优选37℃～52℃处 理5秒～24小时、优选1分钟～24小时。

热和离心处理可以采用例如WO2002/012521(专利文献5)所述的方法来 进行。热处理以及离心处理的条件可以采用例如上述条件。

加压处理可以采用例如WO2005/017169(专利文献6)所述的方法来进 行。并非进行限定，加压处理优选在1.7个大气压～10个大气压的范围、更 优选2.4个大气压～8个大气压的范围进行。

此外，加压处理可以在共存步骤后进行。本发明人等发现：若对小麦进 行加压处理，则具有提高愈伤组织诱导率的效果。这种情况下的加压处理的 条件可以与专利文献6所述的方法相同。此外，加压处理可以在共存培养前 进行，或者也可以在共存培养后、切除胚轴前或后进行。因此，在本发明中， 共存培养前和/或共存培养后进行植物材料的加压处理是适宜方式。

在粉末存在下接种土壤杆菌的处理，可以采用例如WO2007/069643(专 利文献8)所述的方法。具体地，可以采用例如下述方法来进行：将土壤杆菌 悬浊液与粉末混合来接种植物材料，或者，将植物与粉末混合，并用土壤杆 菌对其进行接种。对于粉末没有限制，可以是多孔质粉末、玻璃棉或活性炭， 优选多孔性陶瓷、玻璃棉或活性炭，更优选羟基磷灰石、硅胶、玻璃棉。

在共存培养基中添加半胱氨酸的处理，可以以10mg/L～1g/L、优选 50mg/L～750mg/L、更优选100mg/L～500mg/L在共存培养基中添加半胱氨酸。

本领域技术人员可以在适宜的时机/条件下进行这些处理。此外，从提 高转化效率的角度出发，更加优选对它们进行适宜组合。因此，优选的转化 提高处理是离心处理、热处理、热和离心处理、加压处理、在粉末存在下接 种土壤杆菌的处理、或者在共存培养基中添加半胱氨酸的处理，或者所述处 理的组合。而且，如下述的实施例所示，离心处理与在共存培养基中添加 AgNO₃和/或CuSO₄的处理的组合也是优选的本发明的方式。

3.本发明的方法的效果

根据本发明的基因导入方法与本发明的转化植物的制作方法，能够以高 效率进行小麦属植物的转化。因此，能够实现植物的转化效率的提高。

在本说明书中“转化效率高”是一个包含以高效率将目的基因导入植物 细胞、从未成熟胚等以高效率诱导愈伤组织、以及从转化愈伤组织以高效率 引起再分化的概念。此外，在本说明书中“转化效率提高”是一个包含目的基 因对植物细胞的导入效率提高、未成熟胚等的愈伤组织诱导率提高、以及转 化愈伤组织的再分化效率提高的概念。而且，在后述的实施例2中，实际揭 示了与传统的方法相比，本发明的基因导入方法与本发明的转化植物的制作 方法实现了愈伤组织形成率的提高和基因导入效率的提高。

而且，根据本发明的基因导入方法与本发明的转化植物的制作方法，还 可以得到植物的转化效率的重现性高、转化实验间的偏差少、稳定地获得转 化植物等有利效果。这些效果在广义上也包含在上述的“转化效率高”、和“转 化效率提高”的概念中。

植物组织是否接受了基因导入，可以采用公知的各种方法来确定。例如 通过使转化的基因为GUS(β-葡糖醛酸酶)基因、萤光素基因或者GFP基因等 报告基因，采用简便公知的方法目测观察这些报告基因的表达部位，可以确 认有无转化。此外，可以利用抗生素抗性基因、除草剂抗性基因等选择标记 基因的表达，通过用含抗生素或者除草剂的培养基培养植物细胞、或者用抗 生素溶液、除草剂溶液处理植物，以其抗性的表达为指标，来确认有无转化。

为了更切实地确定是否发生了基因导入，例如可以这样进行：采用 Southern杂交法确认导入基因整合到植物染色体上、以及确认导入基因在子 代植物中的表达(遗传给子代)等。Southern杂交法可以按公知方法进行，例 如按分子克隆(Molecular Cloning)(非专利文献26)中记载的方法进行。此外， 子代植物中表达的确认，可以通过考察GUS基因等报告基因的表达、除草 剂耐性基因等选择标记基因的表达的方法来施行。具体而言，可以按非专利 文献4记载的方法进行，但不限于此。

基因导入效率可以采用本领域技术人员一般使用的计算方法来确定。例 如，可以通过用发生了基因导入的植物数除以接种了土壤杆菌的植物组织数 而求出。

关于愈伤组织形成率，可以例如通过目测分等级评价愈伤组织是否形成 并取平均值。例如，可以像后述实施例那样用3个等级评价未成熟胚的愈伤 组织形成：1(胚盘的一半以上愈伤组织化)、0.5(胚盘的一部分愈伤组织化)、 0(无愈伤组织形成)(后述实施例中的愈伤组织形成指数)。或者，可以通过用 愈伤组织形成数除以接种了土壤杆菌的植物组织数来求出。

对于转化愈伤组织的再分化效率，例如可以通过像愈伤组织形成率那 样，通过用再分化数除以接种了土壤杆菌的植物组织数来求出。

实施例

以下，通过实施例说明本发明，但实施例仅为举例，并不是对本发明的 限制。本发明的范围应以权利要求书的记载为准。而且，本领域技术人员基 于本说明书的记载，可以容易地进行修正、变更。

实施例1

共存培养基组成对基因导入效率的效果

材料和方法

无菌采集开花后第14天的普通小麦(品种：Bobwhite)的未成熟胚(大小 1.5-2.5mm)，用Inf液体培养基(1/10浓度的MS无机盐和MS维生素、10g/l 葡萄糖、0.5g/l MES、pH5.8)洗涤1次。用于提高基因导入效率的前处理 (15,000rpm、10分钟的离心处理)。在含100μM乙酰丁香酮的Inf液体培养 基中悬浮约1.0x10⁹cfu/ml的土壤杆菌系EHA101(pIG121Hm)(非专利文献 3)，作为接种源。在离心处理后的未成熟胚中加入接种源，搅拌30秒钟后， 室温静置5分钟。使接种了土壤杆菌的未成熟胚以胚盘在上的方式着床于含 100μM乙酰丁香酮的Co-Cul共存培养基(1/10浓度的MS无机盐和MS维生 素、10g/l葡萄糖、0.5g/l MES、pH5.8、固体化剂为8g/l琼脂糖)和含5μM AgNO₃和5μM CuSO₄的Co-Cul共存培养基。对照的培养基是含0.5mg/l 2，4-D和 2.2mg/l毒莠定的Co-Cul共存培养基。

从23℃、黑暗条件进行了2天培养的未成熟胚用手术刀和镊子去除幼 根、幼芽和胚轴，着床于含MS无机盐和MS维生素、40g/l麦芽糖、0.5g/l 谷氨酰胺、0.1g/l酪蛋白水解物、0.75g/l六水合氯化镁、1.95g/l MES、pH5.8、 固体化剂2g/l Gelrite、100mg/l抗坏血酸、5μM AgNO₃、250mg/l羧苄西林、 100mg/l头孢噻肟、2.2mg/l毒莠定、0.5mg/l 2，4-D的休眠培养基，25℃、黑 暗条件下培养5天。将未成熟胚浸渍于含0.1％Triton X-100的0.1M磷酸缓 冲液(pH 6.8)中，37℃静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加了包含1.0mM 5- 溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)和20％甲醇的磷酸缓冲液。37℃处理 24小时后，考察了GUS基因的表达。

结果

在用包含2，4-D和毒莠定作为植物生长调节剂的对照的共存培养基培养 的未成熟胚方面，在X-gluc染色后，染色的25个未成熟胚中均未见显示 GUS基因的瞬时表达的蓝色斑点。与此相对，在用不含植物生长调节剂的 共存培养基培养的未成熟胚方面，18个未成熟胚中有3个未成熟胚可见直 径1mm以上的蓝色斑点。而且，在用添加了硝酸银和硫酸铜的不含植物生 长调节剂的共存培养基培养的未成熟胚方面，18个未成熟胚中的7个未成 熟胚可见直径1mm以上的蓝色斑点。

这样可知：通过从共存培养基除去植物生长调节剂，基因导入效率提高； 通过添加硝酸银、硫酸铜，进一步促进了基因导入。

实施例2

幼根、幼芽和胚轴的切除对愈伤组织形成和基因导入效率的效果(着床于共存培养基直至切除)

材料和方法

无菌采集开花后第14天的普通小麦(品种：Bobwhite)的未成熟胚(大小 1.5-2.5mm)，用Inf液体培养基(1/10浓度的MS无机盐和MS维生素、10g/l 葡萄糖、0.5g/l MES、pH5.8)洗涤1次。进行用于提高基因导入效率的前处 理(15,000rpm、10分钟的离心处理)。在含100μM乙酰丁香酮的Inf液体培 养基中悬浮约1.0x10⁹cfu/ml的土壤杆菌系EHA101(pIG121Hm)(非专利文献 3)，作为接种源。在离心处理后的未成熟胚中加入接种源，搅拌30秒钟后， 室温静置5分钟。对于对照的未成熟胚，用手术刀和镊子去除幼根、幼芽和 胚轴后，接种了土壤杆菌。对于其他的未成熟胚，在保留幼根、幼芽和胚轴 的状态下，接种了土壤杆菌。使接种了土壤杆菌的未成熟胚以胚盘在上的方 式着床于含100μM乙酰丁香酮、5μM AgNO₃和5μM CuSO₄的Co-Cul共存 培养基(1/10浓度的MS无机盐和MS维生素、10g/l葡萄糖、0.5g/l MES、 pH5.8、固体化剂为8g/l琼脂糖)。23℃、黑暗条件下进行共存培养。

共存培养开始后第1、2、3天分别从约40个的未成熟胚用手术刀和镊 子去除幼根、幼芽和胚轴，着床于含MS无机盐和MS维生素、40g/l麦芽糖、 0.5g/l谷氨酰胺、0.1g/l酪蛋白水解物、0.75g/l六水合氯化镁、1.95g/l MES、 pH5.8、固体化剂为2g/l Gelrite、100mg/l抗坏血酸、5μM AgNO₃、250mg/l 羧苄西林、100mg/l头孢噻肟、2.2mg/l毒莠定、0.5mg/l 2，4-D的休眠培养基。 对于接种土壤杆菌之前去除了幼根、幼芽和胚轴的对照的未成熟胚，共存培 养开始后第2天使其着床于休眠培养基。此外，对于一部分的未成熟胚，在 不除去幼根、幼芽和胚轴的状态下使其在共存培养开始后第2天着床于休眠 培养基。25℃、黑暗条件下培养7-9天后，采用以下3个等级评价了未成熟 胚的愈伤组织形成：1(胚盘的一半以上愈伤组织化)、0.5(胚盘的一部分愈伤 组织化)、0(无愈伤组织形成)(愈伤组织形成指数)。

此外，对于共存培养开始后第2天去除了胚轴的未成熟胚、和接种土壤 杆菌之前去除了胚轴的对照的未成熟胚中的一部分，将其浸渍于含 0.1％Triton X-100的0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)，37℃静置1小时。除去磷酸 缓冲液后，添加了包含1.0mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)和 20％甲醇的磷酸缓冲液。37℃处理24小时后，考察了GUS基因的表达。

结果

1)愈伤组织形成

愈伤组织形成的结果如图1所示。在图1中，纵轴表示未成熟胚的愈伤 组织形成，横轴表示自接种土壤杆菌后、直至从未成熟胚切除幼根、幼芽和 胚轴并着床于休眠培养基的天数。共存培养开始后第1天去除幼根、幼芽和 胚轴并着床于休眠培养基的未成熟胚显示出最高的愈伤组织形成率。随着直 至去除幼根、幼芽和胚轴的期间延长，愈伤组织形成率降低。与共存培养开 始后第2天未去除幼根、幼芽和胚轴而着床于休眠培养基的未成熟胚(图1： 2天无切除)相比，同日去除幼根、幼芽和胚轴后着床于休眠培养基的未成熟 胚显示出高的愈伤组织形成率。此外，在去除幼根、幼芽和胚轴后接种土壤 杆菌的未成熟胚(图1：0天)中，基本未见愈伤组织形成。

去除幼根、幼芽和胚轴后接种了土壤杆菌的未成熟胚中的愈伤组织形成 指数为0.10(图1：0天)，未去除幼根、幼芽和胚轴而进行休眠培养的未成熟 胚中的愈伤组织形成指数0.33(图1：2天无切除)，与此相对，共存培养开始 后第1天去除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚中的愈伤组织形成指数是 0.51(图1：1天)，因此，愈伤组织形成率与接种土壤杆菌前切除幼根、幼芽 和胚轴的传统方法相比提高至5倍，而与不切除胚轴的传统方法相比提高至 1.5倍。

2)基因导入效率

对于去除幼根、幼芽和胚轴后接种土壤杆菌的未成熟胚，18个未成熟 胚中的1个未成熟胚了表达GUS基因。与此相对，对于共存培养开始后第 2天切除幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚，19个未成熟胚中的15个未成熟胚 可见GUS基因的表达。

实施例3

幼根、幼芽和胚轴的切除对愈伤组织形成和基因导入效率的效果(接种、共存培养开始后第2天着床于休眠培养基，无论第几天进行切除)

材料和方法

无菌采集开花后第14天的普通小麦(品种：Bobwhite)的未成熟胚(大小 1.5-2.5mm)，用Inf液体培养基(1/10浓度的MS无机盐和MS维生素、10g/l 葡萄糖、0.5g/l MES、pH5.8)洗涤1次。进行用于提高基因导入效率的前处 理(15,000rpm、10分钟的离心处理)。在含100μM乙酰丁香酮的Inf液体培 养基中悬浮约1.0x10⁹cfu/ml的土壤杆菌系EHA101(pIG121Hm)(非专利文献 3)，作为接种源。在离心处理后的未成熟胚中加入接种源，搅拌30秒钟后， 室温静置5分钟。使接种了土壤杆菌的未成熟胚以胚盘在上的方式着床于含 100μM乙酰丁香酮、5μM AgNO₃和5μM CuSO₄的Co-Cul共存培养基(1/10 浓度的MS无机盐和MS维生素、10g/l葡萄糖、0.5g/l MES、pH5.8、固体 化剂为8g/l琼脂糖)。23℃、黑暗条件下进行共存培养。

共存培养开始后第0、1、2、3、4、5天分别从15～16个未成熟胚用手 术刀和镊子去除了幼根、幼芽和胚轴。对于共存培养刚开始后(第0天)去除 了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚，用Co-Cul共存培养基培养2天后，着床 于含MS无机盐和MS维生素、40g/l麦芽糖、0.5g/l谷氨酰胺、0.1g/l酪蛋 白水解物、0.75g/l六水合氯化镁、1.95g/l MES、pH5.8、固体化剂为2g/l Gelrite、 100mg/l抗坏血酸、5μM AgNO₃、250mg/l羧苄西林、100mg/l头孢噻肟、2.2mg/l 毒莠定、0.5mg/l 2，4-D的休眠培养基。

而且，在本实施例中，无论第几天进行切除，均在接种开始共存培养后 第2天着床于休眠培养基。对于共存培养开始后第1天去除幼根、幼芽和胚 轴的未成熟胚，用Co-Cul共存培养基再培养1天后，着床于休眠培养基。 对于共存培养开始后第2天去除幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚，在去除幼根、 幼芽和胚轴后立即着床于休眠培养基。对于其他的未成熟胚，以带幼根、幼 芽和胚轴的状态、在共存培养开始后第2天全部着床于休眠培养基。着床于 休眠培养基后第1、2、3天(即共存培养开始后第3、4、5天)去除幼根、幼 芽和胚轴的未成熟胚继续用休眠培养基进行培养。此外，对于一部分的未成 熟胚，不去除幼根、幼芽和胚轴而在共存培养开始后第2天着床于休眠培养 基(无切除)。25℃、黑暗条件下从接种起培养7天后，采用以下3个等级评 价了未成熟胚的愈伤组织形成：1(胚盘的一半以上愈伤组织化)、0.5(胚盘的 一部分愈伤组织化)、0(无愈伤组织形成)(愈伤组织形成指数)。

将愈伤组织形成评价后的未成熟胚浸渍于含0.1％Triton X-100的0.1M 磷酸缓冲液(pH6.8)，37℃静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加了包含1.0mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)和20％甲醇的磷酸缓冲液。37℃、 处理24小时后，考察了显示GUS基因的表达的未成熟胚数。

结果

1)愈伤组织形成

愈伤组织形成的结果如图2所示。在图2中，纵轴表示未成熟胚的愈伤 组织形成指数，横轴表示自接种土壤杆菌后、直至从未成熟胚切除幼根、幼 芽和胚轴的天数。共存培养开始后第2天去除幼根、幼芽和胚轴并着床于休 眠培养基的未成熟胚显示出最高的愈伤组织形成指数。然后，随着直至去除 幼根、幼芽和胚轴的期间的延长，愈伤组织形成率降低。共存培养开始后第 2天未切除幼根、幼芽和胚轴而着床于休眠培养基的未成熟胚(无切除)显示 出与共存培养开始后第5天切除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚同等的愈伤 组织形成指数。此外，去除幼根、幼芽和胚轴后接种土壤杆菌的未成熟胚显 示出与共存培养后立即切除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚(第0天)同等的 愈伤组织形成指数。

去除幼根、幼芽和胚轴后接种了土壤杆菌的未成熟胚，以及共存培养后 立即切除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚中的愈伤组织形成指数为0.23(图 2：0天)，而未切除幼根、幼芽和胚轴就进行休眠培养的未成熟胚中的愈伤 组织形成指数是0.10(图2：无切除)。另一方面，共存培养开始后第1天去 除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚中的愈伤组织形成指数是0.40(图2：1天)。 共存培养开始后第2天去除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚中的愈伤组织形 成指数是0.80(图2：2天)。共存培养开始后第3天去除了幼根、幼芽和胚 轴的未成熟胚中的愈伤组织形成指数是0.30(图2：3天)。共存培养开始后 第4天去除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚中的愈伤组织形成指数是0.13(图 2：4天)。共存培养开始后第5天去除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚中的 愈伤组织形成指数是0.06(图2：5天)。因此，与第2天去除幼根、幼芽和 胚轴的数据比较(图2：2天)，愈伤组织形成率与在接种土壤杆菌前切除幼根、 幼芽和胚轴的传统方法相比提高至3.5倍(图2：0天)，与不切除胚轴的传统 方法相比提高至8倍(图2：无切除)。

2)基因导入效率

对于在共存培养后立即去除幼根、幼芽和胚轴然后接种土壤杆菌的未成 熟胚，15个未成熟胚中的1个未成熟胚表达GUS基因。与此相对，对于在 共存培养开始后第2天切除幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚，15个未成熟胚 中的8个未成熟胚可见GUS基因的表达。对于在共存培养开始后第3天切 除幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚，15个未成熟胚中的11个未成熟胚可见GUS 基因的表达。对于在共存培养开始后第4天切除幼根、幼芽和胚轴的未成熟 胚，15个未成熟胚中的9个未成熟胚可见GUS基因的表达。对于在共存培 养开始后第5天切除幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚，16个未成熟胚中的7 个未成熟胚可见GUS基因的表达。对于未切除幼根、幼芽和胚轴就进行休 眠培养的未成熟胚，15个未成熟胚中的3个未成熟胚表达了GUS基因。

实施例4

转化植物的制作

材料和方法

无菌采集在人工气象室KG-206SHL(小糸工业株式会社)、带空调机的温 室、和常规玻璃温室中分别栽培的开花后第14天的普通小麦(品种：Bobwhite) 的未成熟胚(大小1.5-2.5mm)，用Inf液体培养基(1/10浓度的MS无机盐和 MS维生素、10g/l葡萄糖、0.5g/l MES、pH5.8)洗涤1次。进行用于提高基 因导入效率的前处理(15,000rpm、10分钟的离心处理)。在含100μM乙酰丁 香酮的Inf液体培养基中悬浮约1.0x10⁹cfu/ml的土壤杆菌系 EHA101(pIG121Hm)(非专利文献3)，作为接种源。在离心处理后的未成熟胚 中加入接种源，搅拌30秒钟后，室温静置5分钟。使接种了土壤杆菌的未 成熟胚以胚盘在上的方式着床于含100μM乙酰丁香酮、5μM AgNO₃和5μM  CuSO₄的Co-Cul共存培养基(1/10浓度的MS无机盐和MS维生素、10g/l葡 萄糖、0.5g/l MES、pH5.8、固体化剂为8g/l琼脂糖)。23℃、黑暗条件下进 行共存培养。

共存培养后开始后第2天从未成熟胚用手术刀和镊子去除幼根、幼芽和 胚轴，着床于含MS无机盐和MS维生素、40g/l麦芽糖、0.5g/l谷氨酰胺、 0.1g/l酪蛋白水解物、0.75g/l六水合氯化镁、1.95g/l MES、pH5.8、固体化剂 为2g/l Gelrite、100mg/l抗坏血酸、5μM AgNO₃、250mg/l羧苄西林、100mg/l 头孢噻肟、2.2mg/l毒莠定、0.5mg/l 2，4-D的休眠培养基。25℃、黑暗条件下 培养5天后，将未成熟胚着床于在休眠培养基中添加15mg/l的潮霉素而得 到的1次选择培养基。在相同条件下培养2星期后，将未成熟胚着床于在休 眠培养基中添加30mg/l的潮霉素而得到的2次选择培养基。

相同条件下培养3星期后，着床于添加有30mg/l的潮霉素的LSZ培养 基(非专利文献4)，25℃、照明下培养2星期。将再分化的植物着床于添加 有15mg/l的潮霉素的LSF培养基(非专利文献16)，相同条件下培养2星期。 将可见生根的植物着床于不含潮霉素的LSF培养基，培养1-2星期。将充分 生根的植物移植到装有土的钵中，在人工气象机中进行栽培。将再分化的植 物的叶的一部分浸渍于含0.1％Triton X-100的0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)，37 ℃静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加了包含1.0mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基 -β-D-葡糖醛酸(X-gluc)和20％甲醇的磷酸缓冲液。37℃处理24小时后，考 察了GUS基因的表达。

结果

2008年4月～5月、2008年12月～2009年3月合计进行了7次试验。结 果如表1所示。采集于人工气象室(人工气象机)、带空调机的温室(空调温室)、 常规玻璃温室(常规温室)中栽培的作为材料的小麦。在表1中，接种了的未 成熟胚数为(A)，潮霉素耐性、GUS阳性的植物个体数为(B)，以(B)/(A)表示 的转化效率示于最右栏。

在任何试验中，从接种的未成熟胚均获得了显示潮霉素耐性的1～2个个 体的独立的再分化植物。所得植物均表达GUS基因，显示其为经基因导入 的转化植物。这些转化植物均显示正常形态，且具有可育性。可知：这样通 过本方法，即使在以不同时期、不同环境下栽培的植物作为材料的情况下， 也能够稳定地获得转化小麦。

[表1]

小麦转化结果

HmR：潮霉素耐性、GUS+：GUS阳性

实施例5Southern分析

材料和方法

从实施例3中得到的显示GUS基因表达的转化植物的叶，按小鞠等的 方法(非专利文献29)抽提了DNA。将抽提出的DNA用限制酶HindIII处理， 采用以GUS基因为探针的Southern法进行了导入基因的检测。Southern法 按分子克隆(非专利文献26)中描述的方法进行。

结果

任何转化体均显示与GUS探针杂交的条带。其样式(pattern)因转化体而 异，这显示：导入基因随机地插入到植物的染色体上。显示GUS阳性的个 体的条带数为1-3条，可知插入的导入基因的拷贝数都很少(表1)。以1～3 个的拷贝数导入了GUS基因的T0植物的个体数如表2所示。

[表2]

转化当代植物(T0)中的GUS基因拷贝数

 GUS基因拷贝数     1    2     3  T0植物个体数     3    3     1

实施例6导入基因向后代的遗传

材料和方法

栽培实施例3中得到的转化植物，获得了T1种子。将这些种子播种于 培养土，在温室中进行栽培。从播种后第11天的幼苗切取叶，插入含200mg/l 的潮霉素的ELA培养基(非专利文献16)。25℃、照明下培养6天后，观察 叶片，进行绿色(潮霉素耐性)和黄色(潮霉素敏感性)的判定。

结果

在调查的4个系统中，子代植物中均显示了潮霉素耐性与敏感性的分 离。分离比均显示3∶1，可以确认导入基因按孟德尔法则遗传给后代植物(表 3)。

[表3]

参考例利用传统方法进行小麦转化的补充试验

材料和方法

1)Wan和Layton(2006)的传统方法

作为传统方法，按照Wan和Layton(2006)(非专利文献23)的方法，以普 通小麦(品种：Bobwhite)作为材料，对于刚采集后的未成熟胚和用CM4C培 养基(MS无机盐和MS维生素、0.5g/l谷氨酰胺、0.1g/l酪蛋白水解物、0.75g/l 六水合氯化镁、40g/l麦芽糖、0.5mg/l 2，4-D、2.2mg/l毒莠定、1.95g/l MES、 pH5.8、固体化剂为2g/l Gelrite、100mg/l抗坏血酸)培养2天的未成熟胚(前 培养未成熟胚)，将EHA101(pIG121Hm)悬浮于MS无机盐和MS维生素的浓 度减少至1/10的CM4C液体培养基中，并进行接种。将接种后的未成熟胚 和前培养未成熟胚着床于在MS无机盐和MS维生素的浓度减少至1/10的 CM4C培养基中添加10g/l葡萄糖和200μM乙酰丁香酮而成的共存培养基。

将共存培养后的未成熟胚和前培养未成熟胚浸渍于含0.1％Triton X-100 的0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)，37℃静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加了 包含1.0mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)和20％甲醇的磷酸缓 冲液。37℃处理24小时后，考察了GUS基因的表达。

关于Wan和Layton(2006)的方法，登载该文献的书籍的序言中描述：该 书籍中记载的各规程是各领域的领导者、经验人士所提供的最有效的实验方 法(非专利文献32)。

结果

在Wan和Layton(2006)的方法中，进行基因导入的结果如表4所示。在 表4中，GUS++代表未成熟胚显示多个蓝色斑点，GUS+代表未成熟胚显示 1个蓝色斑点。在用Wan和Layton(2006)的方法进行接种的未成熟胚和前培 养未成熟胚方面，供试的组织中均未见表示GUS基因的瞬时表达的蓝色斑 点。

虽然这样进行了传统方法的补充试验，但无法重现对供试的材料的基因 导入。

[表4]

Wan和Layton(2006)的方法的补充实验

GUS++，一个未成熟胚有多个蓝色点

GUS+，一个未成熟胚有一个蓝色点

实施例7

离心处理的时期对转化植物的制作的效果

材料和方法

以pIG121Hm作为模板，用BglII-Icat_Fw(5’-ACT CTA GAA CAT AGA  TCT CTA CAG GGT AAA TTT CTA G-3’：SEQ ID NO：1)和 BamHI-GNos_Rv(5’-TTT GGA TCC GCG TCG ACG CGT CGA CGC GTC  CTA GAA GCT AAT T-3’：SEQ ID NO：2)的引物组进行PCR，得到了 Icat-GUS-Tnos片段。对该PCR产物进行电泳、切出，并通过β-琼脂糖酶处 理进行纯化，克隆至pUC19/SmaI载体，得到了“pUC-IcatGusTnos”。将该 pUC-IcatGusTnos用BamHI+BglI+BglII消化，回收IcatGusTnos/BamHI+ BglII片段，克隆至pIG121Hm/BamHI+BAP载体。对所得构建物进行测序， 将确认P35S-HPT脱落者命名为“pIG121del”。

以pSB200作为模板，用BamHI-Pubi_Fw(5’-ACT CTA GAA CAT AGA  TCT CTA CAG GGT AAA TTT CTA G-3’：SEQ ID NO：3)和 Bar-Iubi_Rv(5’-TCG TTC TGG GTC CAT ATC TCA TTG CCC CCC GGG  ATG CTC TAG AGT C-3’：SEQ ID NO：4)的引物组进行PCR，得到了片段 A。然后，以pCR-35SBAR作为模板，使用Iubi-Bar Fw(5’-GGG GGG CAA  TGA GAT ATG GAC CCA GAA CGA CGC CCG GCC GAC ATC-3’：SEQ  ID NO：5)和pIG121-Bar_Rv(5’-CTT Tgg atc ccg gtc ggc tac tac tcT CAG ATC  TCG GTG ACG GG-3’：SEQ ID NO：6)的引物组进行PCR，得到了片段B。 对片段A和B进行电泳、切出，并通过β-琼脂糖酶处理进行纯化，将两者 混合作为模板，使用BamHI-Pubi_Fw和pIG121-Bar_Rv的引物组进行PCR， 得到了Pubi-Iubi-BAR片段。对该PCR产物进行电泳、切出，并通过beta- 琼脂糖酶处理进行纯化，用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen)进行克隆，得到了“pCR4-PubiIubiBAR”。将pCR4-PubiIubiBAR 用BamHI-HF进行消化，电泳并切出，通过β-琼脂糖酶处理进行纯化后，进 行连接，得到了“pIG121-PubiIubiBAR”。将pIG121-PubiIubiBAR导入 EHA105(Hood等(1993)Transgenic Research 2：208-218)，得到了 EHA105(pIG121-PubiIubiBAR)。

无菌采集在带空调机的温室中栽培的开花后第14天的普通小麦(品种： Fielder)的未成熟胚(大小1.5-3.0mm)，用Inf液体培养基洗涤1次。对于未成 熟胚各约50个，分A、B、C3个区分别采用以下的方法进行接种、共存培 养和胚轴的切除。A区的未成熟胚用Inf液体培养基洗涤1次后，在Inf液 体培养基中进行用于提高基因导入效率的前处理(15,000rpm、10分钟的离心 处理)。B、C区的未成熟胚在相同液体培养基中室温静置10分钟。在含100μM 乙酰丁香酮的Inf液体培养基中悬浮约1.0x10⁹cfu/ml的土壤杆菌系EHA101 (pIG121Hm)，作为接种源。对A、B、C区的未成熟胚分别加入接种源，搅 拌30秒钟后，室温静置5分钟。将接种了土壤杆菌的未成熟胚以胚盘在上 的方式着床于含100μM乙酰丁香酮、5μM AgNO₃和5μM CuSO₄的Co-Cul 共存培养基。23℃、黑暗条件下进行共存培养。

共存培养后开始后第2天从A区的未成熟胚用手术刀和镊子去除幼根、 幼芽和胚轴，着床于休眠培养基(组成记载于实施例1)。同样地对于B区的 未成熟胚用手术刀和镊子去除幼根、幼芽和胚轴后，在LS-inf液体培养基中 进行15,000rpm、10分钟的离心处理，然后着床于休眠培养基。对于C区 的未成熟胚，在LS-inf液体培养基中进行15,000rpm、10分钟的离心处理后， 用手术刀和镊子去除幼根、幼芽和胚轴，着床于休眠培养基。将A、B、C 区全部的未成熟胚在25℃、黑暗条件下培养5天后，采集一部分的未成熟 胚，浸渍于含0.1％Triton X-100的0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)，37℃静置1小 时。

除去磷酸缓冲液后，添加包含1.0mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸 (X-gluc)和20％甲醇的磷酸缓冲液。37℃处理24小时后，对于各个未成熟胚， 采用以下6个等级评价了GUS基因的表达：4(在胚盘的75％以上中表达)、 3(在胚盘的50～74％中表达)、2(在胚盘的25～49％中表达)、1(在胚盘的 5～24％中表达)、0.5(在胚盘的1～4％中表达)、0(无表达)。对于余下的未成 熟胚，将未成熟胚着床于在休眠培养基中添加5mg/l的草胺膦(PPT)而成的1 次选择培养基。在相同条件下培养2星期后，将未成熟胚着床于在休眠培养 基中添加10mg/l的PPT而成的2次选择培养基。

在相同条件下培养3星期后，着床于添加有5mg/l的PPT的LSZ培养 基，25℃、照明下培养2星期。将再分化的植物着床于添加有5mg/l的PPT 的LSF培养基，在相同条件下培养2星期。将可见生根的再分化个体作为转 化体，调查了其数量。

结果

休眠培养第5天采集一部分各试验区的未成熟胚，进行GUS基因的表 达，结果如图3所示。图3中的纵轴是以GUS基因的表达表示的基因导入 效率。对于任何区，均有半数以上的供试未成熟胚显示GUS基因的表达， 基因导入的程度任何区均是等同的。这表明：在本方法中，离心处理可以在 接种土壤杆菌之前进行，也可以在共存培养后进行，此外，在共存培养后进 行时，可以在切除胚轴前、或切除后进行。

表5显示各区的未成熟胚中的转化效率。在表5中，接种的未成熟胚数 为(D)，草胺膦(PPT)耐性的植物个体数为(E)，(E)/(D)表示转化效率，示于最 右栏。

对于任何试验，均从接种的未成熟胚以20％以上的高效率得到了显示 PPT耐性的独立的再分化植物。这些转化植物均显示正常形态。可知：这样 通过本方法，即使是在不同异时期(共存培养前后、或者切除胚轴前后)进行 离心处理的情况下，也能够稳定地高效率地获得转化小麦。

[表5]

不同时期进行离心处理的未成熟胚中的转化结果

实施例8后代植物中的Southern分析

材料和方法

对于从实施例3中得到的显示GUS基因表达阳性的独立的3个系统的 转化植物、以及这些转化植物自交得到的后代种子生长发育得到的T1代的 GUS基因表达显示阳性或者阴性的各转化植物，按小鞠等的方法从其叶中 抽提了DNA。将抽提出的DNA用制限酶HindIII处理，采用以GUS基因为 探针的Southern法进行了导入基因的检测。Southern法按分子克隆中描述的 方法进行。

结果

转化本代和T1代中GUS基因表达显示阳性的任何转化体均显示出与 GUS探针杂交的条带。其样式因转化系统而异，此外，同一系统中，本代 植物与T1植物显示的条带数和大小在任何系统中均是相同的。而且，对于 T1代中显示GUS基因表达阴性的植物，在任何系统中均未观察到与GUS 探针杂交的条带。由此可以在分子水平确认：导入基因能够稳定遗传给子代 植物。

实施例9

共存培养基中植物激素的添加对转化植物的制作的效果

材料和方法

无菌采集在带空调机的温室中栽培的开花后第14天的普通小麦(品种： Fielder)的未成熟胚(大小1.5-3.0mm)，用Inf液体培养基洗涤1次。在Inf液 体培养基中进行用于提高基因导入效率的前处理(15,000rpm、10分钟的离心 处理)。在含100μM乙酰丁香酮的Inf液体培养基中悬浮约1.0x10⁹cfu/ml的 土壤杆菌系EHA101(pIG121Hm)，作为接种源。在各未成熟胚中分别加入接 种源，搅拌30秒钟后，室温静置5分钟。使接种了土壤杆菌的未成熟胚以 胚盘在上的方式分别着床于在含100μM乙酰丁香酮、5μM AgNO₃和5μM CuSO₄的Co-Cul共存培养基中添加5μM浓度的细胞分裂素或者4PU而成的 培养基、或添加0.5μM和5μM浓度的2，4-D、二氯甲氧苯酸、或者毒莠定而 成的培养基。23℃、黑暗条件下进行共存培养。对照是不含任何植物激素的 Co-Cul共存培养基。

共存培养后开始后第2天用手术刀和镊子去除幼根、幼芽和胚轴，着床 于休眠培养基(组成如实施例1中记载)。将未成熟胚在25℃、黑暗条件下培 养5天后，从各区采集10～19个未成熟胚，浸渍于含0.1％Triton X-100的0.1M 磷酸缓冲液(pH6.8)中，37℃静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加了包含 1.0mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)和20％甲醇的磷酸缓冲液。 37℃处理24小时后，对于各个未成熟胚，采用以下6个等级评价了GUS基 因的表达：4(在胚盘的75％以上中表达)、3(在胚盘的50-74％中表达)、2(在 胚盘的25～49％中表达)、1(在胚盘的5～24％中表达)、0.5(在胚盘的1～4％中 表达)、0(无表达)。

结果

休眠培养第5天采集各试验区的未成熟胚中的一部分，进行了GUS基 因的表达，结果如图4、5和6所示。而且，图4、5和6中的纵轴表示对于 各个未成熟胚，采用以下6个等级对GUS基因的表达进行评价而得到的平 均值：4(在胚盘的75％以上中表达)、3(在胚盘的50-74％中表达)、2(在胚盘 的25～49％中表达)、1(在胚盘的5～24％中表达)、0.5(在胚盘的1～4％中表达)、 0(无表达)。即，代表用GUS基因的表达表示的基因导入效率。

如图4所示，在共存培养基中添加了5μM浓度的细胞分裂素或者4PU 的试验区均获得了显示GUS基因的表达的未成熟胚。其表达的程度与用未 添加植物激素的共存培养基培养的未成熟胚中的表达相比，显示出稍低的 值。

如图5所示，用分别包含0.5μM浓度的2，4-D、毒莠定、二氯甲氧苯酸 的共存培养基培养的未成熟胚中的GUS基因的表达与用未添加植物激素的 共存培养基培养的未成熟胚中的表达相比，显示出等同或稍低的值。

如图6所示，在共存培养基中分别添加了5μM浓度的2，4-D、毒莠定、 二氯甲氧苯酸的试验区均获得了表达GUS基因的未成熟胚。其表达的程度 与用未添加植物激素的共存培养基培养的未成熟胚中的表达相比，均显示出 低的值。

由这些结果可以判明：在本方法中，向共存培养基中添加细胞分裂素和 低浓度的生长素的情况下的基因导入效率与未添加植物激素的共存培养基 中的结果相比，等同或稍逊。

由以上可知：若添加高浓度的生长素，则基因导入效率与未添加植物激 素的培养基相比降低。

实施例10

未成熟胚的大小对转化植物的制作的效果

材料和方法

像实施例7那样制作了载体EHA105(pIG121-PubiIubiBAR)。无菌采集 在带空调机的温室中栽培的开花后第14天的普通小麦(品种：Fielder)的未成 熟胚(大小1.2-3.0mm)，用Inf液体培养基洗涤1次。在Inf液体培养基中进 行了用于提高基因导入效率的前处理(7,500rpm、10分钟的离心处理)。在含 100μM乙酰丁香酮的Inf液体培养基中悬浮约1.0x10⁹cfu/ml的土壤杆菌系 EHA105(pIG121-PubiIubiBAR)，作为接种源。在各未成熟胚中分别加入接种 源，搅拌30秒钟后，室温静置5分钟。将接种了土壤杆菌的未成熟胚按大 小分成1.2-1.8mm、1.8-2.2mm和2.2-3.0mm的各实验区，并以胚盘在上的方 式着床于含100μM乙酰丁香酮、5μM AgNO₃和5μM CuSO₄的Co-Cul共存 培养基。23℃、黑暗条件下进行共存培养。

共存培养后开始后第2天用手术刀和镊子去除幼根、幼芽和胚轴，着床 于休眠培养基(组成如实施例1记载)。将未成熟胚于25℃、黑暗条件下培养 5天。将未成熟胚着床于在休眠培养基中添加5mg/l的草胺膦(PPT)而成的1 次选择培养基。相同条件下培养2星期后，将未成熟胚着床于在休眠培养基 中添加10mg/l的PPT而成的2次选择培养基。

相同条件下培养3星期后，着床于添加有5mg/l的PPT的LSZ培养基， 25℃、照明下培养2星期。将再分化的植物着床于添加有5mg/l的PPT的 LSF培养基，同条件培养2星期。将可见生根的植物着床于不含潮霉素的 LSF培养基，培养1-2星期后，将生根、且生长发育旺盛的再分化个体作为 转化体，调查了其数量。

结果

表6显示了各区的未成熟胚的转化效率。在表6中，接种的未成熟胚数 为(A)，PPT耐性的植物个体数为(B)，以(B)/(A)表示转化效率示于最右栏。

对于任何实验区，均从接种的未成熟胚获得了显示PPT耐性的独立的再 分化植物。特别是，对于接种时的大小为2.2-3.0mm的未成熟胚，从70％以 上的接种的未成熟胚获得了转化植物，这表明通过本方法能够实现高效率的 转化。

[表6]

不同大小的未成熟胚中的转化结果