NFAT信号抑制剂和钙调磷酸酶抑制剂

摘要

本发明提供具有NFAT信号抑制作用、钙调磷酸酶抑制作用、育发作用的医药品、外用剂、化妆品。该NFAT信号抑制剂以美洲当归或者其提取物作为有效成分。

说明书

技术领域

本发明涉及NFAT(nuclear factor of activated T cells，活化T细胞 核因子)信号抑制剂和钙调磷酸酶抑制剂。

背景技术

活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，以下简称为 NFAT)是作为活化对于T细胞活化很重要的白细胞介素-2 (Interleukin-2，IL-2)的转录的因子被发现的，有报道通过作为免疫 抑制剂的环孢霉素A(以下简称为CsA)和他克莫司(以下简称为 FK506)的目标丝氨酸/苏氨酸磷酸酶钙调磷酸酶(Calcineurin)进行其 转录活性调节(参照图2)。也就是说CsA和FK506通过抑制NFAT信 号来抑制T细胞活化。CsA和FK506不仅作为移植免疫抑制剂被认可， 也作为已知干预免疫系统的关节风湿病、干癣、特应性皮炎的治疗药 被认可。将这样的NFAT通过结合于NFAT结合序列(在图2中为“NFAT 位点”)促进该NFAT结合序列下游的基因转录的体系称为“NFAT信 号”。

另一方面，报道有通过抑制NFAT信号可以期待育发(包含生发) 效果(非专利文献1)。此外，也报道了能够将抑制NFAT信号的CsA 的衍生物用作育发剂(专利文献1和2)。

此外，NFAT不限于育发作用和对免疫系统的作用，还在通过心 肌·骨骼肌的分化调节进行的肌肉组织形成、脑中神经网络的形成、 通过成骨细胞分化调节进行的骨代谢等很多脏器中显现，被视为作为 实现重要作用的“多功能转录因子”。

作为NFAT信号在生物体中带来的作用如上所述，但是有报告称 通过抑制NFAT信号，可以期待有抑制免疫作用(非专利文献2)、治 疗干癣(非专利文献3)、治疗特应性皮炎(非专利文献4)、抑制(心) 肌肥大(非专利文献5)、作为抗风湿病药的可能性(非专利文献6) 以及抑制破骨细胞分化作用(非专利文献7)等。此外，如前所述因为 NFAT介入了产生免疫性细胞因子IL-2的路径，所以NFAT信号抑制 剂对于包含自身免疫疾病在内的被认为是免疫性细胞因子干预的疾病 的治疗或者预防是有用的。作为相关的对象疾病，例如可以列举各种 癌症、各种白血病、各种肝炎、各种传染病、全身性红斑狼疮、炎症 性肠病(溃疡性大肠炎、克罗恩病)、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖 尿病、消化性溃疡、败血症性休克、结核、不孕症、动脉硬化、白塞 病(Behcet′s disease)、哮喘、肾炎、急性细菌性脑膜炎、急性心肌梗 塞、急性胰腺炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、细菌性肺 炎、慢性胰腺炎、末梢血管疾病、败血症、间质性肝病、局限性回肠 炎、多发性硬化症等。因此，若NFAT信号抑制剂重新被认定，就可 以期待其作为免疫抑制剂、干癣治疗剂、特应性皮炎治疗剂、(心)肌 肥大抑制剂、抗风湿药、骨代谢疾病治疗剂以及如上述列举的疾病的 新型医药用途。此外，若NFAT信号抑制剂重新被认定，就可以期待 其作为育发剂、生发促进剂的医药外用品和化妆品的用途。

另一方面，对于属于当归属的植物，也有报道称对于其提取物确 认有育发、生发或者养发的效果(专利文献3～6)。具体来说，在专利 文献3中公开了含有当归(Angelica sinensis)提取物的养发·育发剂。 在专利文献4中，公开了含有灰叶当归(Angelica glauca)的精油的养 发剂。在专利文献5中，公开了含有兴安白芷(Angelica dahurica Benth. Et Hook.)提取物的生发·育发促进品。在专利文献6中公开了含有明 日叶(Angelica keiskei Koidz)的提取物的育发养发等美发品。

但是，对于这些属于当归属的植物，没有启示其与NFAT信号的 关联性的报告，对于紫茎当归(Angelica atropurpurea)，至今不知其具 有育发、生发等的作用，也不知其具有适用于皮肤这样的用途。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第01/035914号小册子(日本特表 2003-514000号公报)

专利文献2：国际公开第2004/041221号小册子(日本特表 2006-508103号公报)

专利文献3：日本特许3527584号公报

专利文献4：日本特开2005-89392号公报

专利文献5：日本特开平1-38013号公报

专利文献6：日本特开昭63-145216号公报

非专利文献

非专利文献1：Gafter-Gvili A，Sredni B，Gal R，Gafter U，and  Kalechman Y、″Cyclosporin A-induced hair growth in mice is associated  with inhibition of calcineurin-dependent activation of NFAT in follicular  keratinocytes″Am J Physiol Cell Physiol，284：C1593-C603，2003

非专利文献2：Lee M and Park J、″Regulation of NFAT activation：a  potential therapeutic target for immunosuppression″Mol Cells，22：1-7， 2006

非专利文献3：Feldman S、″Advances in psoriasis treatment″ Dermatol Online J，6：4，2000

非专利文献4：Hultsch T、″Immunomodulation and safety of topical  calcineurin inhibitors for the treatment of atopic dermatitis″Dermatology， 211：2，2005

非专利文献5：Molkentin JD，Lu JR，Antos CL，Markham B， Richardson J，Robbins J，Grant SR，and Olson EN、″A  calcineurin-dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy″ Cell，93：215-228，1998

非专利文献6：Urushibara M，Takayanagi H，Koga T，Kim S，Isobe M， Morishita Y，Nakagawa T，Loeffler M，Kodama T，Kurosawa H，and  Taniguchi T、″Antirheumatic drug，leflunomide，inhibits osteoclastgenesis  by interfering with RANKL-stimulated induction of NFATc1″Arthritis and  Rheumatism，50：794-804，2004

非专利文献7：Takayanagi H，Kim S，Koga T，Nishina H，Isshiki M， Yoshida H，Saiura A，Isobe M，Yokochi T，Inoue J，Wagner EF，Mak TW， Kodama T，and Taniguchi T、″Induction and activation of the transcription  factor NFATc1(NFAT2)integrate RANKL signaling in termial  differentiation of osteoclasts″Developmental Cell，3：889-901，2002

发明内容

本发明涉及以下1)～9)。

1)将美洲当归(American angelica)或者其提取物作为有效成分 的NFAT信号抑制剂。

2)将美洲当归或者其提取物作为有效成分的钙调磷酸酶抑制剂。

3)将美洲当归或者其提取物作为有效成分的外用剂。

4)将美洲当归或者其提取物作为有效成分的育发剂。

5)一种NFAT信号抑制方法，其特征在于，使美洲当归或者其提 取物接触作为对象的人的细胞或者组织。

6)一种钙调磷酸酶抑制方法，其特征在于，使美洲当归或者其提 取物接触作为对象的人的细胞或者组织。

7)一种育发方法，其特征在于，将美洲当归或者其提取物涂布于 作为对象的人的头皮。

8)美洲当归或者其提取物用于制造NFAT信号抑制剂的用途。

9)美洲当归或者其提取物用于制造钙调磷酸酶抑制剂的用途。

附图说明

[图1]是作为测定NFAT信号抑制作用的方法的一个例子所举的报 告实验的简要构成图。

[图2]是表示NFAT和NFAT结合部位的结合以及促进其下游的基 因转录的NFAT信号的简要构成图。

具体实施形态

本发明涉及提供具有NFAT信号抑制作用、钙调磷酸酶抑制作用、 育发作用的医药品、外用剂、化妆品等。

本发明者们构筑了评价对于NFAT信号传达的作用的体系，全面 解析了针对各种植物的NFAT信号抑制作用，其结果发现了，美洲当 归或者其提取物具有优异的NFAT信号抑制作用、钙调磷酸酶抑制作 用，其作为发挥预防或治疗由NFAT产生的促进转录活性的亢进所引 起的疾病和钙调磷酸酶参与的信号传达亢进所引起的疾病、或者育 发·养发等的效果的医药品、化妆品等是有用的。

因为本发明的NFAT信号抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂、外用剂、 育发剂的有效成分是天然物质的美洲当归或者由其得到的成分，所以 能够安全使用。而且，通过该NFAT信号抑制剂等，能够预防或者治 疗由NFAT产生的促进转录活性的亢进引起的症状和疾病、钙调磷酸 酶干预信号传达亢进引起的症状和疾病、或者能够育发·养发。

在本发明中，美洲当归是指学名称为紫茎当归(Angelica  atropurpurea)，分类为伞形科的植物。

在本发明中，美洲当归可以直接使用其全草、叶、茎、花、果实、 种子、根茎或者根等，或者将其干燥粉碎后使用。

作为美洲当归的提取物，除包含将所述使用部分、优选为根茎或 者根直接使用或者将其干燥后切断为适当大小、将粉碎加工而成的产 物进行提取所得到的提取物，其稀释液、其浓缩液或者其干燥粉末之 外，还包含进一步进行分离精制得到的较高活性的组分(成分)。

提取除了在室温或者经过加热的状态下浸透于溶剂或者使用索式 提取器(Soxhlet extractor)等的提取器具进行溶剂提取之外，还可以列 举通过使用水蒸气蒸馏等的蒸馏法进行提取的方法、以二氧化碳在超 临界状态下进行的超临界提取法、或者进行压榨得到提取物的压榨法 等进行提取。

作为为了得到植物的提取物所使用的提取溶剂，也可以使用极性 溶剂或者非极性溶剂的任意一种。作为提取溶剂，例如可以列举水； 甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等的醇类；丙二醇、丁二醇等的多元醇类； 丙酮、甲基乙基酮等的酮类；醋酸甲酯、醋酸乙酯等的酯类；四氢呋 喃、二乙基醚等的链状和环状醚类；聚乙二醇等的聚醚类；角鲨烷、 己烷、环己烷、石油醚等的烃类；甲苯等的芳香族烃类；二氯甲烷、 三氯甲烷、二氯乙烷等的卤化烃类；以及二氧化碳等。或者也可以利 用2种以上上述溶剂组合而成的混合物，例如以20～80％的乙醇水溶液、 苯∶醋酸乙酯(4∶1)混合液、1，3-丁二醇水溶液的方式进行利用。

其中，优选为无水醇，更优选使用无水乙醇。

此外，已知美洲当归含有8-甲氧基补骨脂素(8-methoxypsoralen) (8-MOP)和5-甲氧基补骨脂素(5-MOP)等光敏性物质，从将其除 去的观点出发，优选用乙醇水溶液预清洗美洲当归之后，进行上述溶 剂提取。另外，作为预清洗时使用的乙醇水溶液没有特别的限定，但 是可以使用例如10～60Vol％的乙醇水溶液。此外，提取时所用的乙醇 优选为比预清洗时使用的乙醇含量更高的乙醇，更优选为无水乙醇。

进一步，为了将光敏性物质降低至检测限以下的水平，优选使用 25～45Vol％的乙醇水溶液进行多次预清洗、例如3次以上。另外，作为 预清洗的次数没有特别的限制，但是为了较高地维持由有效成分产生 的育发活性、NFAT信号抑制活性、钙调磷酸酶抑制活性，优选为9次 以内。即，通过使用25～45Vol％乙醇进行2～9次预清洗，可以大幅度 降低光敏物质的同时，较高地维持育发活性、NFAT信号抑制活性、钙 调磷酸酶抑制活性。

此外，作为提取物的分离精制手段，例如可以列举对提取物进行 活性炭处理、液液分配、柱色谱分析、液相色谱分析、凝胶过滤、精 密蒸馏等。

本发明的美洲当归提取物，可以直接使用这样得到的提取液或者 组分，也可以作为用适当的溶剂经过稀释后的稀释液使用，或者也可 以制成浓缩提取物或者干燥粉末、也可以调制成膏状。此外，冷冻干 燥后，可以用使用时、通常提取时使用的溶剂，例如水、乙醇、丙二 醇、丁二醇、水·乙醇混合液、水·丙二醇混合液、水·丁二醇混合 液等的溶剂进行稀释使用。此外，也可以内包于脂质体等的囊泡和微 胶囊等中进行使用。

美洲当归或其提取物如后述实施例所示，具有NFAT信号抑制作 用、钙调磷酸酶抑制作用以及育发作用。

NFAT信号抑制作用可以将NFAT信号抑制率作为指标进行评价。 在美洲当归提取物中，NFAT信号抑制率为101.3％。在此，简要的说， NFAT信号抑制率是指相对于不使提取物产生作用时的由NFAT产生的 转录活性，使提取物作用时的该转录活性的降低率。

作为测定NFAT信号抑制作用的方法，没有特别的限定，但是例 如，可以列举使用已经导入了质粒(Plasmid)的宿主的报告实验 (Reporter assay)，所述质粒具有公知的NFAT结合序列和该NFAT结 合序列下游的报告基因(参照图1)。另外，由于NFAT的活性依赖于 钙离子，所以报告实验是在使钙离子流入宿主的条件下进行的。作为 报告基因，没有特别的限定，也可以使用以前在生化实验领域中使用 的任何报告基因。例如，作为报告基因，可以列举萤光素酶基因、β 葡萄糖醛酸酶基因(GUS基因)以及绿色荧光蛋白基因(GFP基因) 等。

NFAT结合序列是由NFAT结合的序列构成的寡核苷酸，例如，可 以列举GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT(pNFAT-Luc、 Stratagene、序列号1)的碱基序列。另外，在上述的质粒中，也可以 将这样的NFAT结合序列作为1组连接数组并导入。通过将多个NFAT 结合序列连接起来进行使用，可以更高灵敏度地测定由NFAT产生的 转录促进活性。另外，上述NFAT信号抑制率是由上述报告实验算出 的值。

此外，钙调磷酸酶抑制作用可以将由钙调磷酸酶产生的脱磷酸化 活性的抑制率作为指标进行评价。在美洲当归提取物中，钙调磷酸酶 活性抑制率为43.5％。在此，简单的说，钙调磷酸酶活性抑制率是指相 对于不使提取物作用时由钙调磷酸酶产生的磷酸化肽(基质)的脱磷 酸化活性，使提取物作用时该脱磷酸化活性的降低率。

钙调磷酸酶(Ca²⁺/calmodulin-regulated Ser/Thr phosphatase)关系 到Ca²⁺介入的信号传达体系，使含有NFAT的特定磷酸化蛋白质的特 定磷酸基游离。作为测定钙调磷酸酶抑制作用的方法，没有特别的限 定，例如可以列举将公知的构成钙调磷酸酶的基质的磷酸化蛋白质或 者肽作为基质使用，检测来自基质的磷酸基的游离的方法。作为构成 钙调磷酸酶的基质的磷酸化肽，例如可以列举RII磷酸化肽 (DLDVPIPGRFDRV[pS]VAAE)。因此，钙调磷酸酶抑制活性可以在 钙调磷酸酶以及基质的存在下使提取物作用，通过测定此时游离的磷 酸来进行测定。游离的磷酸没有特别的限定，例如可以使用孔雀绿 (Malachite green)试剂进行定量。

育发作用是指通过作用于毛囊、促进毛发生长，增加粗度、促进 从毛发周期的休止期向成长期的移动，抑制从成长期向退化期的移动， 而使毛发的量增加。因此，育发中包含生发、养发以及预防脱发的概 念。作为测定育发作用的方法，没有特别的限定，例如可以列举器官 培养独立毛囊，测定培养期中的毛发的伸长量的方法。

在本发明中，NFAT信号抑制作用由于是指对NFAT直接或者间接 地作用来降低由NFAT正向控制的转录(转录促进活性)，抑制细胞和 组织中NFAT信号的作用，因此，通过将美洲当归或者其提取物与作 为对象的细胞和组织、例如人的细胞或者组织相接触，从而可以抑制 该细胞和组织中的NFAT信号。由此，在该细胞和组织中可以在转录 水平上抑制通过NFAT信号产生的各种基因表达。

因此，本发明的NFAT信号抑制剂可以作为对由NFAT产生的转录 促进活性的亢进引起的症状和疾病的治疗剂或者预防剂来使用。作为 由NFAT产生的转录促进活性的亢进引起的症状和疾病，可以列举免 疫性疾病、干癣、特应性皮炎、包括心肌的肌肥大症、风湿病、骨代 谢疾病、各种癌、各种白血病、各种肝炎、各种传染病、全身性红斑 狼疮、炎症性肠病(溃疡性大肠炎、克罗恩病)、多发性硬化症、胰岛 素依赖性糖尿病、消化性溃疡、败血症性休克、结核、不孕症、动脉 硬化、白塞病、哮喘、肾炎、急性细菌性脑膜炎、急性心肌梗塞、急 性胰腺炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、细菌性肺炎、慢 性胰腺炎、末梢血管疾病、败血症、间质性肝病、局限性回肠炎、多 发性硬化症等。此外，如前所述，通过抑制NFAT信号可以期待育发 (包含生发)的效果，如实施例4所示，由于实际确认美洲当归的提 取物有育发作用，所以本发明的NFAT信号抑制剂可以作为育发剂或 者生发促进剂使用。

此外，钙调磷酸酶抑制作用是指使钙调磷酸酶的活性降低的作用， 由此能够抑制在细胞或者组织中钙调磷酸酶参与的信号传达。即，通 过将美洲当归或者其提取物与作为对象的细胞或者组织，例如人的细 胞或者组织接触，可以抑制在该细胞或组织中钙调磷酸酶参与的信号 传达，这样，在该细胞或者组织中，可以抑制由钙调磷酸酶参与的信 号传达所产生的各种事件。

因此，本申请发明的钙调磷酸酶抑制剂可以作为对于钙调磷酸酶 参与的信号传达的亢进引起的症状或者疾病的治疗剂或者预防剂使 用。作为钙调磷酸酶参与的信号传达的亢进所引起的症状或者疾病， 除了上述列举的由NFAT的转录促进活性的亢进引起的症状或者疾病 之外，还可以列举各种过敏性疾病、精神分裂症等的精神疾病等。

这样，美洲当归或者其提取物可以作为发挥NFAT信号抑制作用、 钙调磷酸酶抑制作用、育发作用的医药品、外用剂、化妆品等使用。

作为医药品使用的情况下，其剂型没有特别的限定，例如可以列 举散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、片剂等的固体制剂、水剂、悬浊剂、 乳剂等的液剂、软膏剂等。

作为口服给药的医药品使用的情况下，除了美洲当归或者其提取 物之外，可以根据口服给药剂的形态添加通常使用的赋形剂、崩解剂、 结合剂、润滑剂、表面活性剂、醇类、水、水溶性高分子、甜味剂、 矫味剂、酸味剂等，按照常用方法进行制造。作为口服给药用医药品， 可以列举免疫抑制剂、干癣治疗剂、(心)肌肥大抑制剂以及抗风湿药 等。

作为经皮给药的医药品使用的情况下，除了美洲当归或者其提取 物之外，可以根据经皮给药剂的形态添加通常使用的植物油、动物油、 合成油、脂肪酸、以及天然、合成的甘油酯等的油性基剂、润滑剂、 表面活性剂、醇类、增粘剂等，依照常用方法进行制造。作为经皮给 药用医药品，可以列举免疫抑制剂、干癣治疗剂、特应性皮炎治疗剂、 生发促进剂等。

此外，外用剂以及育发剂是作为例如皮肤用的医药部外品使用的， 以适应使用形态的剂型提供。作为具体的剂型没有特别的限定，但是 可以列举例如软膏、水剂、提取物制剂、乳液剂、滋补剂、喷剂以及 乳剂等。

在该药品部外品中除了美洲当归或者其提取物之外，可以任意组 合助剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、吸收促进剂以及表面活性剂等的 药学上容许的载体来进行配合。此外，在育发剂中，除了上述有效成 分之外，可以根据需要适当配合通常使用的养发药效剂，例如，毛囊 赋活剂、血液循环促进剂、抗菌剂、抗炎症剂、保湿剂、抗脂漏剂、 局部刺激剂、抗雄性荷尔蒙剂、钾通道开放剂、抗氧化剂等，来实现 育发效果的提高。作为毛囊赋活剂，可以列举二氢黄酮醇类 (Flavanonol)、N-乙酰基-L-蛋氨酸、泛酸及其衍生物、腺嘌呤核苷及 其衍生物、天冬氨酸钾、十五烷酸甘油酯、6-苄基氨基嘌呤、单硝基愈 创木酚钠等。作为血液循环促进剂，可以列举二氧化碳、烟酸酰胺、 烟酸苄酯、当药提取物、胡萝卜提取物、卡普氯铵(Carpronium chloride)、 维生素E及其衍生物等。作为抗菌剂，可以列举异丙基甲基苯酚、苯 扎氯铵、羟甲辛吡酮(Octopirox)、吡硫锌、日柏醇(Hinokitiol)等。 作为抗炎症剂，可以列举甘草提取物、甘草酸及其衍生物、甘草次酸 及其衍生物、甘菊环烃、愈疮木薁、黄芩提取物、母菊提取物、山白 竹提取物、白桦提取物、锦葵提取物、桃叶提取物、欧蓍草提取物等。 作为保湿剂，可以列举小连翘提取物、燕麦提取物、甘油、晚香玉多 糖、冬虫夏草提取物、延命草提取物、大麦提取物、葡萄提取物、丙 二醇、桔梗提取物、薏苡仁提取物等。作为抗脂漏剂，可以列举硫磺、 卵磷脂、何首乌提取物、噻克索酮等。作为局部刺激剂，可以列举樟 脑、辣椒酊等。作为抗雄性荷尔蒙剂，可以列举醋酸环丙孕酮 (Cyproterone acetate)、11α-羟孕酮、氟他胺(Flutamide)、3-脱氧腺苷、 醋酸氯地孕酮、炔雌醇、螺内酯、表睾酮、非那雄胺、芦荟、秦椒、 丁香提取物、收敛性胡桃(Juliania adstringens)提取物、人参等。作 为钾通道开放剂，可以列举米诺地尔、克罗卡林(Cromakalim)、二氮 嗪及其衍生物、吡那地尔(Pinacidil)等。作为抗氧化剂，可以列举红 茶提取物、茶提取物、刺玫果提取物、黄杞提取物、维生素C及其衍 生物、赤藻糖酸、没食子酸丙酯、二丁基羟基甲苯等。

作为化妆品使用的情况下，作为剂型没有特别的限定，例如可以 列举油包水型或者水包油型的乳化化妆品、乳霜、乳液、凝胶、泡沫、 精华液、粉底、面膜(pack)、膏棒(stick)以及粉末等。在该化妆品 中，除了植物的提取物之外还可以任意组合作为化妆品成分通常使用 的油分、表面活性剂、紫外线吸收剂、醇类、螯合剂、pH值调节剂、 防腐剂、增粘剂、色素类、香料以及各种皮肤营养剂等进行配合。具 体来说，可以添加皮肤化妆品中配合的药效成分，例如微粒子氧化锌、 氧化钛、Parsol MCX、Parsol 1789等的紫外线吸收剂，抗坏血酸等的 维生素类、透明质酸钠、凡士林、甘油、尿素等的保湿剂，荷尔蒙剂， 以及曲酸、熊果苷、胎盘提取物、噜忻喏(Rucinol)等的其他美白成 分，类固醇剂，以花生四烯酸代谢物或者组胺等所代表的化学传达物 质产生·释放抑制剂(吲哚美辛、布洛芬)，受体拮抗剂等的抗炎症剂， 抗雄性荷尔蒙剂，维生素A酸、蜂王浆提取物、蜂王浆酸等的皮脂分 泌抑制剂，烟酸生育酚酯、前列地尔、盐酸苯氧丙酚胺、盐酸妥拉唑 啉等的末梢血管扩张剂以及具有末梢血管扩张作用的二氧化碳等，米 诺地尔、卡普氯铵、辣椒酊、维生素E衍生物、银杏提取物、当药提 取物等的血液循环促进剂，十五烷酸甘油酯、烟酸酰胺等的细胞赋活 剂，日柏醇、L-薄荷脑、异丙基甲基苯酚等的杀菌剂，甘草酸及其衍 生物或者其盐等的药剂，神经酰胺以及神经酰胺类似化合物等进行配 合。

此外，在上述医药品、医药部外品、化妆品中，可以根据需要适 当组合例如粉笔、滑石、漂白土(Fuller’s earth)、高岭土、淀粉、胶、 硅胶聚丙烯酸钠等的粉体；例如矿油、植物油、硅油等的油或者油状 物质；例如山梨糖醇酐三油酸酯、山梨糖醇酐三硬脂酸酯、甘油单油 酸酯、高分子硅酮表面活性剂等的乳化剂；对羟基苯甲酸酯等的防腐 剂；丁羟基甲苯等的抗氧化剂；甘油、山梨糖醇、2-吡咯烷酮-5-羧酸 酯、邻苯二甲酸二丁酯、明胶、聚乙二醇等的湿润剂、如三乙醇胺或 者氢氧化钠这样的带碱基的乳酸等的缓冲剂；甘油脂肪酸酯、山梨糖 醇酐脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、烷基葡萄糖苷等的表面活性剂；蜂蜡、 地蜡、石蜡等的蜡类；增粘剂；活性增强剂；着色剂、香料等来使用。

在上述医药、医药部外品或者化妆品中，美洲当归或者其提取物 的配合量以干燥物计算，优选为通常的医药、医药部外品或者化妆品 的全部组成的0.00001～5重量％、特别优选为0.0001～0.1重量％。此外， 作为医药品使用的情况下，美洲当归或者其提取物的给药量，作为固 体成分余量通常成人可以为1mg～1g/1天，作为外用剂使用的情况下， 优选为0.01mg～1g/1天。另外，本发明涉及的外用剂根据有效成分的含 量有所不同，例如为乳脂状、软膏状的情况下，优选皮肤面积每1cm²使用1～20mg，液状制剂的情况下同样优选使用1～20mg。

实施例

以下，通过实施例进一步具体地说明本发明。但是，本发明不限 定于这些实施例中的技术范围。

[实施例1]植物提取物的制造

在本实施例中制造了美洲当归的提取物。取10g美洲当归的根(美 国产)，加入100mL的95％乙醇，在室温下静置提取7天之后，过滤， 得到80mL提取液。蒸发残留物为0.7w/v％。

[实施例2]NFAT信号抑制效果

在本实施例中，构筑了用于验证NFAT信号抑制效果的评价系统， 并使用该评价系统对实施例1中制造的植物提取物检验其NFAT信号 抑制效果。

(1)用于评价系统的材料和方法

细胞培养

在上述评价系统中，从ATCC(American Type Culture Collection) 购入人体肾(HEK293)细胞进行使用。HEK293细胞在DMEM(High  glucose、10％heat-inactivated FBS)中于37℃、5％CO₂的条件下进行 培养。

质粒、转染

在上述评价系统中，使用将在NFAT结合序列的下游导入了荧火 虫荧光素酶的质粒pNFAT-Luc(Stratagene)转染到HEK293细胞上的 产物。详细来说，将在4串NFAT结合序列的下游导入了荧火虫荧光 素酶基因用于NFAT转录活性的评价的pNFAT-luc(STRATAGENE) 转染到HEK293细胞上。此外，以消除转染效率引起的不均为目的， 为了补正来源于荧火虫荧光素酶的信号，同时转染了在CMV promoter 的下游导入了海肾萤光素酶(Renilla luciferase)的pRL-CMV (Promega)。

转染使用LipofectAMINE 2000 reagent(Invitrogen)依照使用说明 书进行。转染8小时后交换培养基，培养一晚。之后，添加在实施例1 中制造的植物提取物(0.5vol％)，1小时后添加1μM的离子霉素 (Ionomycin)。8小时后进行萤光素酶报告实验。离子霉素是对钙离 子的特异离子载体，已知其可作为使钙离子流入细胞内的药剂。通过 添加离子霉素，活化了钙离子依赖性的脱磷酸酶的钙调磷酸酶，随之 NFAT转录活性上升，因此认为本系统适合于探索NFAT信号活化抑 制剂。

萤光素酶报告实验

萤光素酶报告实验使用Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega)，依照使用说明书进行。即，除去培养基之后，加入用PBS 稀释了2倍的Dual-Glo luciferase reagent，搅拌之后，在20分钟之后测 定荧火虫荧光素酶活性。之后，加入了等量的Dual-Glo Stop&Glo  reagent，在搅拌之后测定海肾萤光素酶活性。萤光素酶活性测定使用 MiniLumat LB 9506(EG&G BERTHOLD)进行，定量检测由萤光素酶 产生的发光量。两者萤光素酶活性的测定时间都为2秒钟。

NFAT信号抑制率的计算

所有的NFAT转录活性(萤火虫荧光素酶活性)都通过除以为了 补正转染效率而导入的海肾萤光素酶活性来进行补正。之后，通过以 下式子算出NFAT信号抑制率。

NFAT信号抑制率(％)＝100-(试验样品以及添加离子霉素组-无刺激 组)/(仅添加离子霉素组-无刺激组)×100

通过上述计算，可以算出测试样品对通过离子霉素刺激产生的 NFAT信号活化有百分之多少的抑制。

结果

由在实施例1中制造的美洲当归提取物产生的NFAT信号抑制率 为101.3％。由此结果可知美洲当归提取物抑制NFAT信号。即，美洲 当归提取物可以抑制由NFAT产生的正向控制的转录。因此，实施例1 制造的美洲当归提取物是优异的NFAT信号抑制剂，可以认定为例如 免疫抑制剂、干癣治疗剂、特应性皮炎治疗剂、育发剂、生发促进剂、 (心)肌肥大抑制剂以及抗风湿药等的候选物质。

[实施例3]当归属植物中的NFAT信号抑制率的比较

在本例中，调制了各种属于当归属的植物的提取物，并对NFAT 信号抑制作用进行了比较研讨。在本例中调制了如下的提取物。

<美洲当归>

取8g美洲当归(紫茎当归Angelica atropurpurea)的干燥根(美洲 产)，加入80mL的95vol％的乙醇，在室温下静置提取7天之后，过 滤，得到提取液(蒸发残留物1.0w/v％)。

<东当归>

取8g东当归(Angelica acutiloba)的干燥根茎(日本产)，加入80mL 的95vol％的乙醇，在室温下静置提取7天之后，过滤，得到提取液(蒸 发残留物0.6w/v％)。

<明日叶>

取8g明日叶(Angelica keiskei)的干燥叶(日本产)，加入80mL 的95vol％的乙醇，在室温下静置提取7天之后，过滤，得到提取液(蒸 发残留物1.9w/v％)。

<白芷>

取8g白芷(Angelica dahurica)的干燥根茎(中国产)，加入80mL 的95vol％的乙醇，在室温下静置提取7天之后，过滤，得到提取液(蒸 发残留物0.5w/v％)。

<当归>

取8g当归(Angelica sinensis)的干燥根茎(中国产)，加入80mL 的95vol％的乙醇，在室温下静置提取7天之后，过滤，得到提取液(蒸 发残留物0.7w/v％)。

<圆叶当归>

取8g圆叶当归(Angelica archangelica)(法国产)，加入80mL 的95vol％的乙醇，在室温下静置提取7天之后，过滤，得到提取液(蒸 发残留物1.0w/v％)。

使用如上调制的6种当归属植物提取物，与实施例2同样的方法 算出NFAT信号抑制率。其结果表示于表1中。

[表1]

由表1中可知，即使在当归属植物中美洲当归提取物相比于其他 的当归属植物提取物NFAT信号抑制率也表现出显著较高的值。由此 结果可见，美洲当归提取物是相比较于其他的当归属植物提取物更优 异的NFAT信号抑制剂，可认定为例如免疫抑制剂、干癣治疗剂、特 应性皮炎治疗剂、育发剂、生发促进剂、(心)肌肥大抑制剂以及抗 风湿药等的有力的候选物质。

[实施例4]

在本例中，使用能够验证对象物质的育发效果的体外(in vitro) 实验体系来验证在实施例1中制造的植物提取物的育发效果。

由猪毛囊器官培养评价毛发伸长

将食肉用猪种的臀部皮肤切成适当大小，除去多余的脂肪组织。 将猪皮在无菌条件下浸渍于洗必泰溶液(Hibitane)(将5％洗必泰溶 液(住友制药)用水稀释至5～20倍)中5分钟～10分钟进行消毒之后， 用D-PBS清洗数次。之后，在立体显微镜下从清洗后的猪皮上分离出 毛囊，并收集到William′s Medium E培养基(Invitrogen)中。

分离的毛囊放入24孔培养板中，每孔1根，培养板中每孔放有 400μL的William′s Medium E培养基(添加了1％Penicillin-Streptomycin 溶液(Invitrogen))。毛囊在37℃、5％CO₂条件下培养8天，在此期 间，每隔1天或者2天进行培养基的交换。

将实施例1中制造的美洲当归提取物添加到上述的培养基中(固 体成分浓度为0.0001重量％)，与溶剂对照的乙醇添加组一起培养8 天时间。用CCD相机(pixera model.No.PVC 100C)拍摄开始培养日 (第0天)和第8天的立体显微镜照片，从该照片中测定从毛球部基 底部至毛干顶端的长度。之后，将溶剂对照组的培养前后的毛发伸长 量作为100％，算出实施例1中制造的美洲当归提取物添加组的毛发伸 长率。

其结果可以确认，在美洲当归提取物添加组中，与溶剂对照组相 比较为113.1％的毛发伸长率。由该结果可知，美洲当归提取物具有育 发效果。即，可知美洲当归提取物可以作为优异的育发剂、具有育发 效果的外用剂使用。

[实施例5]

在本例中，使用能够验证对象物质的钙调磷酸酶抑制效果的市售 试剂盒来验证在实施例1中制造的植物提取物的钙调磷酸酶抑制效果。

钙调磷酸酶活性测定

钙调磷酸酶酶活性是使用将重组人体钙调磷酸酶(Recombinant  human calcineurin)作为酶、将作为钙调磷酸酶的基质肽的RII磷酸化 肽(DLDVPIPGRFDRV[pS]VAAE)作为基质使用的钙调磷酸酶检测试 剂盒(Calcineurin assay kit(BIOMOL))，如试剂盒附带的规定进行测 定。另外，实施例1制造的美洲当归提取物以1vol％的浓度使用。在实 施例1中制造的美洲当归提取物的钙调磷酸酶活性抑制效果是计算将 溶剂对照的钙调磷酸酶活性作为100％时的抑制率。

其结果，在美洲当归提取物添加组中，与溶剂对照组相比为43.5％。 由该结果可以明确，美洲当归提取物抑制钙调磷酸酶的活性。即，美 洲当归提取物能够抑制钙调磷酸酶参与的信号传达体系。因此，可以 明确，在实施例1中制造的美洲当归提取物可以作为优异的钙调磷酸 酶活性抑制剂使用。

[实施例6]

在本实施例中，用各种浓度的乙醇水溶液对美洲当归进行预清洗 之后，调制植物提取物。首先，在本例中，使用10～60vol％乙醇进行 单次预清洗，然后，调制植物提取物(样品1～6)。具体来说，是将 8g切成5mm四方形的当归根于160mL(10～60vol％)乙醇中搅拌浸渍 1昼夜之后，废弃提取液(清洗液)。之后，通过用80mL无水乙醇提 取3天从而得到提取物(下述，表2)。

[表2]

  样品名   预清洗溶液   样品1   10％乙醇   样品2   20％乙醇   样品3   30％乙醇   样品4   40％乙醇   样品5   50％乙醇   样品6   60％乙醇

接下来，在本例中，用30vol％的乙醇进行单次或者多次预清洗， 之后调制植物提取物(样品7～17)。具体来说，是将8g切成5mm四 方形的当归根在80、160或者320mL的30vol％乙醇中搅拌浸渍1昼夜， 废弃提取液(清洗液)，并将此操作重复进行1～9次。之后，通过用 80mL无水乙醇提取3天从而得到提取物(下述，表3)。

[表3]

  样品名   预清洗溶液的量(mL)   清洗次数(次数)   样品7   80   1   样品8   80   3   样品9   80   5   样品10   80   7   样品11   80   9   样品12   160   3   样品13   160   5   样品14   160   7   样品15   320   1   样品16   320   3   样品17   320   5

另外，在本实施例中，为了进行比较，调制了不进行上述预清洗 的植物提取物(样品18)。即，通过将8g切成5mm四方形的当归根 在80mL无水乙醇中提取3天时间，得到样品18的提取物。

对于如上准备的样品1～18，用与上述实施例2同样的方法测定 NFAT信号抑制活性。此外，通过HPLC分析如下测定样品1～18中所 含的光敏物质(5-MOP以及8-MOP)的量。首先，在甲醇中溶解规定 量的5-MOP或者8-MOP，并分别调制1、5、10、100以及1000ppm 溶液。接下来将5μl每种溶液供给HPLC分析，根据UV吸收面积制作 标准曲线。在同一条件下，将样品1～18每个提供5μl于HPLC分析， 根据UV吸收面积使用标准曲线求得浓度。另外，任意一个样品每个 都进行3次测定，使用其平均值。在HPLC分析中使用Agilent 1100 Series，以C18反相柱(Inertsil ODS-3：4μMφ2.1×150mm)，在流速 为0.2mL/min、洗脱液(乙腈/0.1％甲酸＝0/100(0min)→100/0(30min) →100/0(40min))、温度40℃，检测UV254nm的条件下进行测定。 另外，5-MOP以及8-MOP的保持时间分别为14.7min和13.6min。

对样品1～18经过测定的NFAT信号抑制活性以及5-MOP浓度和 8-MOP浓度表示于表4中。

[表4]

由表4可知，通过使用乙醇水溶液进行预清洗，可以降低光敏物 质的量。特别是可知，作为预清洗，使用30～40Vol％乙醇可以在保持 NFAT信号抑制活性的同时，大幅度降低作为光敏物质的8-MOP以及 5-MOP的量。进一步，由表4可知，使用30～40Vol％乙醇的情况下， 通过进行多次预清洗，可以将光敏物质降低到检测界限以下的水平。 如上表明，由本实施例，通过使用25～45Vol％的乙醇水溶液进行预清 洗，可以在较高地维持NFAT信号抑制活性的同时，调制基本不具有 光敏物质的植物提取物。