一种对脱毒后的百日咳疫苗抗原溶液进行纯化的方法

摘要

本发明提供的对脱毒后的百日咳疫苗抗原溶液进行纯化的方法，包括对脱毒后的百日咳疫苗抗原溶液的电导率和pH进行预调整、采用中空纤维超滤系统进行超滤、用洗滤液对中空纤维超滤系统进行洗滤和淋洗等步骤，将洗滤后的百日咳抗原溶液和淋洗得到的淋洗液合并即得到纯化的百日咳疫苗抗原溶液。本发明采用中空纤维超滤法对脱毒后的无细胞百日咳抗原溶液进行纯化，除去脱毒剂和在脱毒过程中产生的色素分子。对利用此法纯化得到的百日咳疫苗原液进行检测，其戊二醛、赖氨酸含量和原液外观均达到《中国药典(2010年版)》三部规定的标准。该方法具有工作效率高、回收率高、产品的效价高、适合工业化生产、可实现全封闭操作降低污染风险等特点。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及对脱毒后的百日咳疫苗抗原溶液进行纯化的 方法，尤其是采用中空纤维超滤法对脱毒后的无细胞百日咳抗原溶液进行纯化 的方法。

背景技术

百日咳(pertussis，whooping cough)是由革兰氏阴性百日咳杆菌引起的一 种具有强传染性的呼吸系统疾病，典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性 尾声或伴有呕吐，新生儿及婴幼儿患者会引起呼吸暂停和发绀。百日咳在发病 初期传染力极强，不易诊断，因此进行疫苗接种是预防和控制百日咳最经济最 有效的手段。目前市场上的百日咳疫苗主要有全菌体百日咳疫苗和无细胞百日 咳疫苗两种，后者属于百日咳疫苗的升级产品，其仅含提纯的有效抗原而没有 百日咳菌体，因此大大降低了注射后的不良反应而保留了良好的免疫效果，因 此被广泛使用。根据有效抗原纯化的方法不同，无细胞百日咳疫苗的生产工艺 可以分为离心共纯化和柱层析单独纯化两种。一种是我国和日本大部分厂商采 用的离心共纯化工艺，即细菌培养液收获后，通过硫酸铵盐析、高盐溶液浸提 和蔗糖密度梯度离心获得精制抗原，然后利用戊二醛溶液或者甲醛溶液将抗原 脱毒为类毒素，另一种是欧美大部分厂商采用的柱层析法，即主要采用柱层析 的方法将细菌培养液中的各抗原组分分别提取出来，然后利用戊二醛溶液或者 甲醛溶液将抗原脱毒为类毒素，再按一定的比例混合。这两种方法均是采用透 析的方法去除解毒后抗原溶液中的脱毒剂以及脱毒过程中产生的色素分子获 得无细胞百日咳原液。传统的流式透析法存在着不少质控隐患：①透析袋的材 质和性能缺乏严格验证；②操作繁琐，不易进行质控；③透析操作效率低，操 作时间长达5-7天，无菌条件不易控制。

切向流过滤是指液体流动方向与过滤方向呈垂直方向的过滤形式，根据过 滤精度的不同可以分为超滤和微滤，根据使用材料的不同可以分为中空纤维膜 柱式过滤和板式膜包式过滤。和传统的液体死端过滤相比，切向流过滤具有滤 速快、效率高的优点，而且可随需控制浓缩和洗滤倍数，因此切向流过滤技术 的超滤操作是替代透析的理想选择，在很多生物制品的生产中已广泛应用。

尽管切向流过滤相比传统流式透析法有很多优点，但是目前国内外还未有 将此技术应用于去除脱毒后百日咳抗原溶液中的脱毒剂。这是因为无细胞百日 咳疫苗的主要成分百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)都具有很强的疏水 聚合特性，在脱毒处理后会出现显著的絮状凝集，而且在透滤过程中，随着小 分子伴侣逐渐被缓冲液替代，这种絮状凝集还会增加，而超滤选用的材质多有 复杂的流体通道，因此会造成切向流速的下降和蛋白沉淀物的积累堵塞，从而 造成工作效率和收获率的大幅下降，因此不适合产业化的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种对脱毒后的百日咳疫苗抗原溶液进行纯化的方法， 用来替代现有的透析工艺，以克服现有技术的不足。

实现本发明的具体技术方案是：

本发明本提供的这种对脱毒后的百日咳疫苗抗原溶液进行纯化的方法， 包括以下步骤：

步骤一、预调整：在0-18℃，优选为4-12℃条件下进行以下操作：向脱 毒后的百日咳疫苗抗原溶液中添加氯化钠溶液，使脱毒后的百日咳疫苗抗原溶 液的电导率调整至20-100ms/cm，优选为30-70ms/cm；向脱毒后的百日咳疫苗 抗原溶液中添加磷酸盐，使脱毒后的百日咳疫苗抗原溶液的pH调整至 6.5-8.5；所述的氯化钠溶液的pH值为6.5-8.5，浓度为0.15-1摩尔每升，优 选为0.5摩尔每升；所述的磷酸盐为磷酸二氢钠或磷酸氢二钠；

步骤二、超滤浓缩：采用中空纤维超滤系统对经步骤一处理的脱毒后的百 日咳疫苗抗原溶液进行超滤浓缩，使百日咳抗原溶液中的蛋白氮含量为每毫升 200-700微克时，进行步骤三的操作；所述的采用中空纤维超滤系统对经步骤 一处理的脱毒后的百日咳疫苗抗原溶液进行超滤浓缩的具体方法是：将经步骤 一处理的脱毒后的百日咳疫苗抗原溶液注入中空纤维超滤系统的储罐(1)中， 并将中空纤维超滤系统储罐(1)中的百日咳疫苗抗原溶液的温度控制在0-18 ℃，优选4-12℃；所述的中空纤维超滤系统的中空纤维膜柱(5)的截留分子 量在1万-30万，优选为5万-15万；启动隔膜泵(2)，调节带有流速监测装 置的滤出阀(4)和隔膜泵(2)使滤出阀(4)所带流速监测装置显示的切向 流速在15-40LMH范围内，优选为20LMH；至超滤浓缩后的百日咳抗原溶液中的 蛋白氮含量为每毫升200-700微克时，优选为每毫升300-500微克时，进行步 骤三的操作；

步骤三、洗滤：向中空纤维超滤系统的储罐(1)中添加洗滤液进行洗滤， 调节滤出阀(4)和隔膜泵(2)的速度来控制滤出液的流速，使滤出液的流速 与洗滤液的添加速度一致，在洗滤过程中不定时取样检测洗滤后的百日咳抗原 溶液中的脱毒剂的含量和洗滤后的百日咳抗原溶液的颜色，脱毒剂的含量和洗 滤后的百日咳抗原溶液的颜色符合《中国药典(2010年版)》规定的“稀释成成 品后游离甲醛含量应不高于0.2g/L，戊二醛含量应小于0.01g/L、外观为淡棕 色”的条件时，则停止洗滤；所述的洗滤液为pH值为6.5-8.5、浓度为0.15-1 摩尔每升的氯化钠溶液，洗滤结束后，收集中空纤维系统中的溶液得到洗滤后 的百日咳抗原溶液；

步骤四、淋洗回收：用洗滤液对中空纤维超滤系统进行淋洗，将淋洗得到 的淋洗液和经步骤三得到的洗滤后的百日咳抗原溶液合并得到纯化的百日咳 疫苗抗原溶液，所述的洗滤液为pH值为6.5-8.5、浓度为0.15-1摩尔每升的 氯化钠溶液；

上述步骤二、步骤三和步骤四应在0.5-3小时完成，优选1-2小时完成。

上述步骤三、步骤四中所用氯化钠溶液的浓度具体可以是0.5摩尔每升。

上述步骤二中采用中空纤维超滤系统可以是由储罐(1)、泵(2)、进样阀 (3)、滤出阀(4)、中空纤维膜柱(5)和回流阀(6)组成，在储罐(1)的外 部安装有内设冷凝水循环通道的夹套(7)，夹套(7)可以通过夹套中的冷凝水 循环对储罐(1)中的脱毒后的百日咳疫苗抗原溶液进行降温。

上述步骤二中对中空纤维超滤系统储罐(1)中的百日咳疫苗抗原溶液的温 度进行控制的具体方法是：通过设置在中空纤维超滤系统储罐(1)的外部的其 内设置有冷凝水循环通道的夹套(7)中的冷凝水循环对储罐(1)中的脱毒后 的百日咳疫苗抗原溶液进行降温。

本发明方法中抗原溶液的温度须控制在0-18摄氏度之间，优选范围为 4-12摄氏度。低温可以减轻蛋白质的疏水作用，从而减少有效抗原的絮凝。这 可以通过给中空纤维超滤系统配备冷凝系统来实现，如在储罐上安装夹套，然 后利用冷凝水进行冷却。

超滤浓缩过程中溶液的浓度须控制在每毫升含200-700微克蛋白氮，浓度 过高会加强蛋白质的疏水作用，增加有效抗原的絮凝，浓度太低会增加洗滤过 程中洗滤液的使用量并延长工作时间，超滤浓缩这一步优选的终浓度为每毫升 含300-500微克蛋白氮。

超滤浓缩、洗滤和淋洗回收的总时间须控制在0.5小时到3小时之间，优 选1-2小时，这可以通过选择合适面积的中空纤维膜柱来实现，工作时间过长 会使有效抗原的性质发生变化进而影响产品质量，此时可以选择较大面积的中 空纤维膜柱，工作时间过短可以选择面积较小的中空纤维膜柱，这样可以减少 由于膜面积增大带来的抗原溶液残留同时降低使用成本。采用中空纤维超滤法 对脱毒后的无细胞百日咳抗原溶液进行纯化从而除去甲醛、戊二醛、赖氨酸、 天冬氨酸等脱毒剂以及在脱毒过程中产生的色素分子的方法。在实施例1中， 我们对利用此法纯化得到的百日咳疫苗原液进行检测，其戊二醛和赖氨酸的含 量以及原液的外观均达到《中国药典(2010年版)》三部规定的标准。

本发明方法的优点是：(1)物料发生混浊是小分子伴侣逐渐被缓冲液替代 过程中难以完全避免的客观现象。基于百日咳抗原这一特性，我们没有使用带 “筛网”结构的膜包(流体通道的复杂结构降低了切向流速，并可能造成蛋白 沉淀物的积累堵塞)，而是选择了低剪切力，流体通道简单的中空纤维膜柱，同 时还对超滤条件进行优化，使我们获得了很高的工作效率，整个工艺时间由原 来的5-7天缩短到不到3个小时，而且回收率可以达到90％以上，符合大规模生 产的要求。(2)切向流过滤对絮凝蛋白具有一定的“匀化”作用，有助于减少 大块沉淀物生成，比较透析后和超滤后的原液，我们发现后者的絮凝蛋白更细 腻且沉降速度更缓慢。因此超滤法可以提高后期超声波匀化效率，从而间接提 高产品的效价。(3)整个系统能够很方便地进行CIP(原位清洗)和SIP(原 位灭菌)，而且整个工艺过程都是全封闭操作，大大降低了污染的风险，更加符 合《药品生产质量管理规范》(GMP)的规定。

附图说明

图1：纯化前后抗原溶液的外观对比，图中1是脱毒后的抗原溶液；2是超 滤浓缩的滤出液；3是2.5倍浓缩/洗滤后的抗原溶液。

图2：为各纯化步骤的SDS-PAGE分析，利用12％的SDS-PAGE电泳对采 用传统透析方法纯化和超滤后的溶液进行比较，上样量为50微升的抗原溶液 (蛋白氮含量为60微克/升)，结果显示，百日咳原液的性质未发生明显改变， 且超滤外液中未检测到抗原组分。电泳顺序为：1、脱毒后的抗原溶液；2、超 滤纯化后的百日咳原液；3、超滤浓缩的滤出液；4、采用传统透析方法纯化后 的的百日咳原液；5、蛋白质Marker。

图3：为中空纤维系统示意图；图中数字标识为：1-带夹套的储罐；2- 泵；3-进样阀；4-滤出阀；5-中空纤维膜柱；6-回流阀；7-夹套。

具体实施方式：

通过下面实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施 例只用于对本发明进行进一步的说明，但不能理解为对本发明保护范围的限 制。

实施例1

主要物料和设备：

洗滤液(pH6.5-7.5，磷酸钠缓冲液5毫摩尔每升，氯化钠0.5摩尔每升)； 脱毒后的精制无细胞百日咳抗原溶液6000毫升(蛋白质含量为每毫升75微克 蛋白氮，以下简称脱毒后的抗原溶液)；10kDa中空纤维超滤柱：膜柱型号， SLP-1053(PALL公司)；供液泵Quottroflow卫生级隔膜泵，滤出阀为带流量 计(罗斯蒙特8731型卫生级流量计)的隔膜阀；高速冷冻离心机(Eppendorf)， 小型垂直电泳仪(Bio-rad)，电子天平(梅特勒)。

具体过程：

步骤一、预调整：将脱毒后的精制无细胞百日咳抗原溶液中的氯化钠浓度 调整至0.5摩尔每升，电导率为40ms/cm，配置洗滤液pH6.5-7.5，磷酸钠缓冲 液5毫摩尔每升，氯化钠250毫摩尔每升；

步骤二、超滤浓缩：超滤工艺数据参见表1。在超滤浓缩过程中，65分钟 滤出4800ml料液，浓缩了5倍，滤速衰减平稳，平均滤速为46LMH。

步骤三、洗滤：在洗滤过程中，80分钟滤出5300ml料液，滤速衰减基本 平稳，平均滤速为43LMH。

步骤四、淋洗回收：最后用1200ml洗滤液对整个系统进行了淋洗，并将 淋洗液同之前的洗滤液(1200ml)进行了混合，原液的最终浓缩倍数为2.5倍。 脱毒后的抗原溶液，超滤浓缩的滤出液和浓缩/洗滤后的原液的外观图见图1， 可以看到超滤纯化后的原液的颜色为浅棕色，另外对原液进行生化检测，结果 显示戊二醛的含量小于0.01克每升同时并未检测到赖氨酸，达到2005版《中 国药典(2010年版)》三部规定的标准。

对照方法：利用传统的透析方法纯化脱毒后的百日咳抗原溶液：

将脱毒后的抗原溶液分装包扎于透析袋中，置0.85％无菌氯化钠溶液中，于 2～8℃透析至抗原为浅棕色。

表1：SLP膜柱超滤实验数据(物料体积6000ml)

  工艺阶段   平均滤速   滤出/回收体积   浓缩、洗滤因子，备注   浓缩   76.7ml/min(46LMH)   4750ml   浓缩倍数CV＝5   洗滤   65.4ml/min(40LMH)   5300ml   洗滤倍数CV＝4.4   回收   N/A   1200ml   淋洗后和洗滤液混合

5、收获率和纯度分析

将超滤纯化后的百日咳原液按比例还原到纯化前的体积，以脱毒后的抗原 溶液为对照，通过SDS-PAGE电泳和固含量检测试验比较各自的纯化效果。实 验结果见图2和表2。结果显示，中空纤维超滤纯化的回收率为95.4％， SDS-PAGE的结果显示，百日咳原液的性质未发生明显改变。

表2  不同纯化方式的回收率

  样品种类   固含量   回收率   脱毒后的抗原溶液   0.872％   N/A   超滤后的原液(已还原)   0.803％   95.4％

6、效价测定结果

根据2005版《中国药典》规定的方法进行百日咳原液效价试验，结果表 明，中空纤维超滤获得的抗原溶液进行稀释后，每1次人用剂量的免疫效价为 10.988IU/ml，达到2005版《中国药典》三部规定的标准。