低温条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌株及分离培养方法

摘要

本发明公开了一种低温条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌株及分离培养方法，低温条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌株(Perlucidibaca piscinae)硝透CGMCC No.5281，其具有在低温好氧条件下去除污水中亚硝酸盐氮的能力。实验结果表明：尽管受到低温环境的明显抑制，投加本发明的一种低温条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌株(Perlucidibaca piscinae)硝透CGMCC No.5281，在低温下，特别是在8-12℃的条件下，对污水中亚硝酸盐去除有明显的强化作用，接种本发明的菌株与未接种菌的污水进行比较，亚硝酸盐去除率提高了约为10％。

说明书

技术领域

本发明涉及一株去除污水中亚硝酸盐氮的菌及其用途。

背景技术

低温对生物处理能力产生重大影响的原因是由于温度的降低影响了微生物的生长及代谢 并使污水处理系统中微生物群系发生了改变。在温度下降过程中，中温菌的代谢活性逐渐下 降，到一定温度时便失去活性，而适于低温环境的低温微生物的数量由于自身的生理特性及 各种生态因子的抑制作用，在数量上无法达到优势菌群的地位，从而导致污水处理厂冬季出 水水质下降。因此亟需一种能在低温好氧条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌株。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种低温条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌 株(Perlucidibaca piscinae)硝透。

本发明的第二个目的是提供一种低温条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌株 (Perlucidibaca piscinae)硝透在低温好氧条件下去除污水中亚硝酸盐氮的用途。

本发明的第三个目的是提供一种低温条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌株的分离培养方 法。

本发明的技术方案概述如下：

一种低温条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌株(Perlucidibaca piscinae)硝透CGMCC  No.5281，其具有在低温好氧条件下去除污水中亚硝酸盐氮的能力。

一种低温条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌株(Perlucidibaca piscinae)硝透CGMCC  No.5281在低温好氧条件下去除污水中亚硝酸盐氮的用途。低温优选为8-12℃。

低温条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌株的分离培养方法，包括如下步骤： (1)将10～20mL污水处理厂曝气池污泥接种至装有250mL硝酸细菌培养液的锥形瓶中， 所述硝酸细菌培养液中的亚硝酸钠中氮浓度为50mg/L，在8～12℃，摇床转速为120～140rpm 摇床中驯化，待亚硝酸盐氮降解率达到80～90％时，静置，去除上清液，将锥形瓶底部的污 泥接种至装有250mL第二种硝酸细菌培养液中，所述第二种硝酸细菌培养液中的亚硝酸盐氮 浓度为150mg/L，在8～12℃，在转速为120～140rpm的摇床中驯化，待亚硝酸盐氮降解率 达到80～90％时，即得到含有耐低温细菌的硝酸细菌培养液；

(2)取10mL步骤(1)获得的培养液，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和20～30粒灭菌玻 璃珠的250mL锥形瓶中，振荡10～30min，使细菌细胞充分释放到上清液中；静置20～40min， 取1mL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10^-2的菌悬液，按上述方法依次做 系列稀释，一直做到10^-8为止；

(3)选取梯度为10^-5～10^-8的菌悬液，分别取1mL接种于硝酸细菌固体培养基，每个稀释度 做3个平行样，编号；10℃在有氧的条件下保湿培养2～3周；

(4)从步骤(3)中的硝酸细菌固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在硝酸 细菌固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离3-4次，使平板上的菌落在显微镜 中的形态相同，单一，大小相似即为单菌落，命名为硝透，经鉴定为低温条件下去除污水中 亚硝酸盐氮的菌株(Perlucidibaca piscinae)。

所述硝酸细菌培养液由下述组分组成：NaNO₂ 0.25g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O 0.05g、 K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄4H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g、加蒸馏水至1000m L。

所述第二种硝酸细菌培养液由下述组分组成：NaNO₂ 0.74g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O 0.05g、K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄4H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g、加蒸馏水至1000m L。

所述硝酸细菌固体培养基由下述组分组成：NaNO₂ 0.5g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O 0.05g、K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄4H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g、琼脂20g、加蒸馏 水至1000m L。

实验结果表明：尽管受到低温环境的明显抑制，投加本发明的一种低温条件下去除污水 中亚硝酸盐氮的菌株(Perlucidibaca piscinae)硝透CGMCC No.5281，在低温下，特别是在 8-12℃的条件下，对污水中亚硝酸盐去除有明显的强化作用，接种本发明的菌株与未接种菌 的污水进行比较，亚硝酸盐去除率提高了约为10％。

附图说明

图1为低温好氧条件下去除污水中亚硝酸盐氮的一种去除污水中亚硝酸盐氮的菌株 (Perlucidibaca piscinae)硝透CGMCC No.5281的驯化分离培养流程图。

图2为菌株(Perlucidibaca piscinae)硝透对亚硝酸盐氮去除试验。

图3为菌株(Perlucidibaca piscinae)硝透鉴定方法流程。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

低温条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌株(Perlucidibaca piscinae)硝透的分离培养方 法，包括如下步骤：

(1)将15mL天津纪庄子污水处理厂曝气池的污泥接种至装有250mL硝酸细菌培养液的锥 形瓶中，所述硝酸细菌培养液中的亚硝酸钠中氮浓度为50mg/L，在10℃，摇床转速为130rpm 摇床中驯化，待亚硝酸盐氮降解率达到90％时，静置，去除上清液，将锥形瓶底部的污泥接 种至装有250mL第二种硝酸细菌培养液中，所述第二种硝酸细菌培养液中的亚硝酸盐氮浓度 为150mg/L，在10℃，在转速为130rpm的摇床中驯化，待亚硝酸盐氮降解率达到90％时， 即得到含有耐低温细菌的硝酸细菌培养液；

(2)取10mL步骤(1)获得的培养液，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和30粒灭菌玻璃珠 的250mL锥形瓶中，振荡20min，使细菌细胞充分释放到上清液中；静置30min，取1mL 上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10^-2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释， 一直做到10^-8为止；

(3)选取梯度为10^-5～10^-8的菌悬液，分别取1mL接种于硝酸细菌固体培养基，每个稀释度 做3个平行样，编号；10℃在有氧的条件下保湿培养3周；

(4)从步骤(3)中的硝酸细菌固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在硝酸 细菌固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离3次，使平板上的菌落在显微镜中的 形态相同，单一，大小相似即为单菌落，命名为硝透，经鉴定为低温条件下去除污水中亚硝 酸盐氮的菌株(Perlucidibaca piscinae)。

各实施例中所采用的硝酸细菌培养液由下述组分组成：NaNO₂ 0.25g、乙酸钠2g、 MgSO₄7H₂O 0.05g、K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄4H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g、加蒸 馏水至1000m L。

第二种硝酸细菌培养液由下述组分组成：NaNO₂ 0.74g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O 0.05g、 K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄4H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g、加蒸馏水至1000m L。

硝酸细菌固体培养基由下述组分组成：NaNO₂ 0.5g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O 0.05g、 K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄4H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g、琼脂20g、加蒸馏水至1000m L。

本发明的一种去除污水中亚硝酸盐氮的菌株(Perlucidibaca piscinae)硝透，具有以下 微生物学特性：

1.形态学特性

在显微镜下观察，为杆状，长1.6μm，宽0.35μm；在硝酸细菌固体培养基上形成透明菌 落。

2.培养学特性

在10℃下，在硝酸细菌固体培养基中培养时，本发明的(Perlucididaca piscinae)菌株 具有以下特性。

表面干燥，边缘整齐，个体微小扁平，菌体透明。

3.生理特性

好氧条件下去除污水中亚硝酸盐氮的革兰氏阴性细菌，接触酶阴性、甲基红试验阴性、 水解淀粉、液化明胶、不产生吲哚、生长pH值为6～8，生长温度5～30℃。

本发明细菌的16s序列鉴定

16SrDNA是细菌类原核生物在漫长的进化过程中十分保守的序列，在现代微生物的分类 学中扮演着重要的角色，作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子，用16S rDNA 进行微生物群落结构分析更为快捷方便。

用16s序列进行细菌鉴定流程按图3进行。

图3中的牛肉膏蛋白胨培养基组成：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加蒸馏水至 1000mL，pH 7.0～7.2。

LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL。

本发明测得的16s序列如下：

ACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGGGACTTCGGTCCTAGCGGCGAACGGGTGA

GGAATGCTTGGGAATCTGCCCAGTAGTGGGGGATAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGT

CCTACGGGAGAAAGGGGGGGATCTTCGGACCTCTCGCTATTGGATGAGCCCAAGTCGGATTAGCTAGT

TGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGG

AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGC

CTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTAAGCAGGGAGGAA

TGGCTCTTGGTTAATAACCTTGAGCAGTGACGTTACCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCA

GCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCG

GTTACGTAAGTTGGGTGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCACTCAAAACTGCGTGGCTAG

AGTGTGGGAGAGGAAGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATACCG

ATGGCGAAGGCAGCCTTCTGGCCTAACACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGA

TTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGGACTTGATCCTTTAGTGG

CGCAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGA

CGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCC

TTGACATGTCCGGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATCGGAACACAGGTGCTGCATG

GCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGT

TGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGCGGGGACG

ACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTT

GCTAGCCCGCGAGGGTACGCCAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGA

CTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG

TACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTACTGCACCAGAAGTAGGTAGCTTAACCGCAAGGAGGG

CGCTTACCACGGTGTGGTCAATGACTGGG

根据上述微生物学特性，本发明的菌株命名为硝透，分类命名为菌株(Perlucidibaca  piscinae)已于2011年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC No.5281，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院 微生物研究所，并已存活。

实施例2硝透对亚硝酸盐氮的降解效果

在1L的烧杯中，加入500m L硝酸细菌培养液，将初始亚硝酸盐氮浓度调整为50mg/L，加 入本发明的硝透，从硝酸细菌固体平板上接三环本发明的硝透入上述硝酸细菌培养液中，保 持pH为7.5，测定72小时硝透对亚硝酸盐氮的降解情况，结果见图2。

由图2可以看出，经72小时的降解，溶液中亚硝酸盐氮浓度为6.6mg/L，亚硝酸盐氮基本 去除，去除率为86.8％，证明本发明中的硝透对亚硝酸盐氮有良好的去除能力。

实施例3

低温条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌株(Perlucidibaca piscinae)硝透的分离培养方 法，包括如下步骤：

(1)将10mL天津纪庄子污水处理厂曝气池的污泥接种至装有250mL硝酸细菌培养液的锥 形瓶中，所述硝酸细菌培养液中的亚硝酸钠中氮浓度为50mg/L，在8℃，摇床转速为140rpm 摇床中驯化，待亚硝酸盐氮降解率达到80％时，静置，去除上清液，将锥形瓶底部的污泥接 种至装有250mL第二种硝酸细菌培养液中，所述第二种硝酸细菌培养液中的亚硝酸盐氮浓度 为150mg/L，在8℃，在转速为140rpm的摇床中驯化，待亚硝酸盐氮降解率达到80％时，即 得到含有耐低温细菌的硝酸细菌培养液；

(2)取10mL步骤(1)获得的培养液，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和20粒灭菌玻璃珠 的250mL锥形瓶中，振荡30min，使细菌细胞充分释放到上清液中；静置20min，取1mL 上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10^-2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释， 一直做到10^-8为止；

(3)选取梯度为10^-5～10^-8的菌悬液，分别取1mL接种于硝酸细菌固体培养基，每个稀释度 做3个平行样，编号；10℃在有氧的条件下保湿培养2周；

(4)从步骤(3)中的硝酸细菌固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在硝酸 细菌固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离4次，使平板上的菌落在显微镜中的 形态相同，单一，大小相似即为单菌落，命名为硝透，经鉴定为低温条件下去除污水中亚硝 酸盐氮菌株(Perlucidibaca piscinae)。

实施例4

低温条件下去除污水中亚硝酸盐氮的菌株(Perlucidibaca piscinae)硝透的分离培养方 法，包括如下步骤：

(1)将20mL天津纪庄子污水处理厂曝气池的污泥接种至装有250mL硝酸细菌培养液的锥 形瓶中，所述硝酸细菌培养液中的亚硝酸钠中氮浓度为50mg/L，在12℃，摇床转速为120rpm 摇床中驯化，待亚硝酸盐氮降解率达到90％时，静置，去除上清液，将锥形瓶底部的污泥接 种至装有250mL第二种硝酸细菌培养液中，所述第二种硝酸细菌培养液中的亚硝酸盐氮浓度 为150mg/L，在12℃，在转速为120rpm的摇床中驯化，待亚硝酸盐氮降解率达到90％时， 即得到含有耐低温细菌的硝酸细菌培养液；

(2)取10mL步骤(1)获得的培养液，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和30粒灭菌玻璃珠 的250mL锥形瓶中，振荡10min，使细菌细胞充分释放到上清液中；静置40min，取1mL 上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10^-2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释， 一直做到10^-8为止；

(3)选取梯度为10^-5～10^-8的菌悬液，分别取1mL接种于硝酸细菌固体培养基，每个稀释度 做3个平行样，编号；10℃在有氧的条件下保湿培养3周；

(4)从步骤(3)中的硝酸细菌固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在硝酸 细菌固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离3次，使平板上的菌落在显微镜中的 形态相同，单一，大小相似即为单菌落，命名为硝透，经鉴定为低温条件下去除污水中亚硝 酸盐氮菌株(Perlucidibaca piscinae)。

实验证明，实施例3和实施例4分离培养去除污水中亚硝酸盐氮的菌株(Perlucidibaca  piscinae)也有很好的降解亚硝酸盐氮的效果，去除率分别为86.1％和86.4％。