绵羊α-TTP基因,及其克隆方法和编码的蛋白

摘要

本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及一种绵羊的α-TTP基因及其编码的蛋白和其克隆方法。本发明提供一种绵羊的α-TTP蛋白，其为1)由SEQ ID No.2所示氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明还提供编码上述蛋白的基因及该基因的克隆方法。本发明成功地在绵羊体内扩增得到了α-TTP的全长基因，该成果可以为绵羊α-TTP的相关基因研究提供分子基础，并使得研究绵羊α-TTP的蛋白功能成为可能。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种绵羊α-TTP基因，及 其克隆方法和编码的蛋白。

背景技术

作为机体必需的脂溶性维生素，维生素E自其被发现以来就受到 了人们的重视和广泛的研究，其中，关于其抗氧化作用的研究尤为深 入(Traber等，2007)。近年来研究发现，除了抗氧化功能外，维生 素E在调节信号转导途径(Zingg，2007)和基因表达(Zingg等， 2004)方面也起着重要的作用。另外，维生素E还可与一些未知蛋白 互作发挥氧化还原反应感受器的作用(Azzi，2007)，而且维生素E 在细胞膜上也具有一些特定的功能(Zingg，2007；Quinn，2004； Atkinson等，2008)。然而，关于维生素E方面的研究主要集中在其 生理功能方面，关于维生素E作用机制的研究报道较少，特别是维生 素E在机体内的转运机理到目前为止仍不清楚。

Catignani等于1975年率先在小鼠肝脏细胞胞质中发现了一种可 以特异性结合α-生育酚(维生素E在机体内生物活性最高的形式) 的蛋白，由于这种蛋白可以提高α-生育酚在膜间的转运，所以被称 为α-生育酚结合蛋白(α-tocopherol binding protein，α-TBP)或α- 生育酚转移蛋白(α-tocopherol transfer protein，α-TTP)(Sato等， 1991)。α-TTP具有多种重要的生物学功能，其最重要的作用是特异 性地结合α-生育酚，将α-生育酚转运到组织器官进行利用，发挥作 用(Regina Brigelius-Flohé，2009)。研究发现，α-生育酚被小肠吸 收后通过乳糜微粒进行转运，并以乳糜微粒残基的形式进入肝脏细 胞。在肝脏细胞胞质中，α-TTP特异性地结合α-生育酚，使其主要 被极低密度脂蛋白吸收。随后，α-生育酚被转运至各组织进行利用 (Akihiro等，1997)。通过转运和分布α-生育酚，α-TTP可以维持 中枢神经系统和繁殖功能的正常性。研究表明，人类中α-TTP基因 缺失会导致循环中的生育酚水平极低，并引发维生素E缺乏性共济失 调症(Sokol，1988；Traber等，1996)，而小鼠α-TTP基因表达受 阻后表现为血浆和组织中维生素E含量下降，出现同人类类似的神经 症状，而且还出现了不育(Terasawa等，2000；Yokota等，2001；Jishage 等，2001)。尽管这些现象都清楚地表明α-TTP是调节维生素E的主 要物质，但是α-TTP的具体功能目前仍不是特别清楚。

无论从基因水平还是蛋白水平研究α-TTP，其基因序列信息都是 必不可少的基础条件。目前，人类、家鼠、牛等动物α-TTP的基因 序列均已在GenBank上公布，而尚未见任何有关绵羊α-TTP基因序 列的报道，这对进行绵羊α-TTP的相关基因研究造成了极大的困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种绵羊α-TTP基因，及其克隆方法和其 所编码的蛋白。

绵羊α-TTP，其为由SEQ ID No.2所示氨基酸组成的蛋白质； 或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或 几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码上述蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在 不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸， 得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第(173)位的(F) 替换为(L)，或是将第(40)位的(G)缺失，或是在(242位后面) 增加(一个K)。

因此，本发明的绵羊α-TTP蛋白还包括SEQ ID No.2所示氨基 酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，具有绵羊α-TTP蛋 白同等活性的由绵羊α-TTP蛋白衍生得到的蛋白质。本发明基因包 括编码所述蛋白的核苷酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并 性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用 适合特定物种表达的密码子。

本发明提供的绵羊α-TTP基因是从绵羊中通过RT-PCR及RACE 技术克隆得到，其cDNA全长为1,098bp，包含一个完整的开放阅读 框849bp，其基因序列同人、牛、家鼠、褐家鼠、黑猩猩、猕猴和犬 α-TTP基因的同源性分别为85％、98％、84％、84％、85％、 85％和90％，相应氨基酸序列同源性分别为89％、99％、85％、 84％、89％、89％和84％。

本发明的另一个目的是提供克隆绵羊α-TTP基因的方法，包括 如下步骤：

1)通过比对GenBank上已经公布的人、牛、家鼠α-TTP的cDNA 序列，得出同源保守序列；

2)提取绵羊肝脏RNA，利用RT-PCR在绵羊体内扩增该同源保 守片段；

3)根据所得到的片段序列，利用RACE技术扩增得到绵羊α-TTP 的全长基因。

本发明还提供含有上述绵羊α-TTP基因或其片段的载体，以及 含有该载体的宿主细胞；所述载体为所述绵羊α-TTP基因的克隆载 体或各类表达载体。

本发明另一个目的在于提供绵羊α-TTP在绵羊维生素E代谢调 节中的应用。

本发明首次成功地在绵羊体内扩增得到了α-TTP的全长基因， 该成果可以为绵羊α-TTP的相关基因研究提供分子基础，并使得研 究绵羊α-TTP的蛋白功能成为可能。另外，本发明在实验技术上独 具创新，相较于传统的构建cDNA文库筛选基因的方法，利用RACE 技术克隆全长基因具有快速、简便、灵敏度和特异性高的优点，可极 大提高结果的准确性、正确性和研究速度，因而可以大力节约人力、 物力和财力。本发明提供的绵羊α-TTP可应用于绵羊维生素E的代 谢调节及机理阐述。

附图说明

图1为绵羊肝脏总RNA琼脂糖凝胶电泳图，M：DL2,000DNA Marker；1：绵羊肝脏组织总RNA(DNase I处理)。

图2为同源保守序列PCR产物电泳图，M：DL2,000DNA Marker；1：PCR产物；2：空白对照。

图3为3’RACE产物电泳图，M：DL2,000DNA Marker；1： 3’RACE产物；2：空白对照。

图4为5’RACE产物电泳图，M：DL2,000DNA Marker；1： 5’RACE产物；2：空白对照。

图5为RACE结果验证电泳图，M：DL2,000DNAMarker；1： PCR产物；2：空白对照。

图6为绵羊α-TTP与其它物种α-TTP的进化树分析。

图7为饲喂不同水平维生素E后的绵羊α-TTP的相对表达量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1绵羊α-TTP基因全长的克隆

通过比对GenBank上已经公布的人(GenBank登录号： NM_000370)、牛(GenBank登录号：XM_587081)和家鼠(GenBank 登录号：NM_015767)α-TTP的cDNA序列，得出一段长为572bp 的同源保守序列，人、牛和家鼠α-TTP基因序列中相应的保守序列 分别位于其284～855bp、1～445bp和264～835bp处。

利用RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒(购自北京天 根生化科技有限公司，产品目录号：DP431)提取绵羊肝脏RNA，对 其进行DNase I处理后取1ul进行1％琼脂糖凝胶电泳(图1)。结 果显示RNA提取效果良好，无降解现象。

利用RNA进行反转录合成cDNA，然后根据比对后确定的同源 保守序列设计相应引物，进而利用PCR反应进行扩增。其中，上游 引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示。

其中，PCR反应体系为50μl：模板cDNA 2μl；1×cDNA Dilution Buffer II 8μl；上下游引物(10μmol/L)各2μl；2×GC Buffer I 25μl； TaKaRa LA Taq(5U/μl)0.5μl；加水补足至50μl。

反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃复性30s， 72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。对PCR产物进行1％ 琼脂糖凝胶电泳(图2)，然后经切胶回收连接到pMD19-T载体(购 自大连宝生物公司，产品目录号：D102A)，转化大肠杆菌DH5α，挑 取阳性克隆进行测序。对测序结果进行Blast比对后发现其与上述同 源保守序列相似性较高，因此，可以认定已成功在绵羊体内扩增得到 该段同源保守序列。

设计3’RACE引物，其中上游引物序列如SEQ ID No.5所示， 下游引物序列如SEQ ID No.6所示。然后以实施例2制备的cDNA 为模板进行PCR反应，反应体系及条件均按照试剂盒里的步骤进行。

对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(图3)，其PCR产物(约 0.3kb)经切胶回收后测序。

设计5’RACE引物，其上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下 游引物序列如SEQ ID No.8所示。

首先按照试剂盒的步骤对绵羊肝脏总RNA进行CIAP、TAP处 理，然后与5’RACE接头连接后进行反转录合成cDNA。以此反转 录反应液为模板进行PCR反应，反应体系及条件均按照试剂盒里的 步骤进行。对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(图4)，其PCR产 物(约0.3kbp)经切胶回收后测序。

为了验证扩增得到的cDNA 3’端和5’端为目标序列，设计上游 引物，序列如SEQ ID No.9所示，设计下游引物，序列如SEQ ID No. 10所示进行PCR反应，反应体系和条件同实施例2。

经PCR验证，共得到产物约840bp(图5)。根据3’和5’RACE 产物以及同源保守序列的序列信息及片段大小分析，证明得到的5’ 及3’RACE序列是根据上述同源保守序列得到的，RACE实验结果 正确可信。结果表明，共得到287bp的5’端未知序列和257bp的3’ 端未知序列。

实施例2绵羊α-TTP及其编码的蛋白的生物信息学分析

本发明利用RT-PCR和RACE技术成功在绵羊体内扩增出α-TTP 全长基因共1,098bp。经生物信息学分析后发现，该全长基因及其所 编码蛋白具有以下特点：

1、测序结果表明：绵羊α-TTP cDNA全长基因包含翻译起始信 号和多聚腺苷化信号，cDNA基因全长1098bp，包含23bp的5’ -UTR、226bp的3’-UTR以及849bp的CDS区，共编码282个氨基 酸，其序列如SEQ ID No.2所示。

2、基因序列与进化树分析

经GenBank blastp软件比对后的结果显示，绵羊α-TTP基因与 其它哺乳类动物α-TTP基因及相应氨基酸序列同源性均较高，其基 因序列与人、牛、家鼠、褐家鼠、黑猩猩、猕猴和犬α-TTP基因的 同源性分别为85％、98％、84％、84％、85％、85％和90％，其 氨基酸序列的同源性分别为89％、99％、85％、84％、89％、89％ 和84％；但是，其基因及氨基酸序列与家鸡和鲐鱼的同源性相对较低， 基因序列同源性分别只有75％和71％，氨基酸序列同源性则分别仅 为72％和54％。

根据氨基酸序列比对结果，绘出绵羊α-TTP基因与其它物种成 员之间的同源关系进化树(图6)。其中，它与牛、人等哺乳动物的 遗传距离较近，而与家鸡和鲐鱼等非哺乳动物的遗传距离较远。由此 可以推测，α-TTP基因在哺乳动物中高度保守，而这种高度种间保 守性预示其对于维护机体正常的生理功能具有重要的意义，同时也预 示着α-TTP基因在哺乳动物和非哺乳动物中发挥作用的机制可能有 所不同。

3、序列特性及功能结构域分析

(1)根据绵羊α-TTP基因的CDS区推测，该基因编码一个含 有282个氨基酸的蛋白多肽，其分子量约为32.01kD，等电点(pI)为 6.46，属于弱酸性蛋白，稳定指数(instability index)为38.77，表 明该蛋白性质稳定。

(2)利用Prosite数据库对绵羊α-TTP蛋白序列进行蛋白功能 结构域预测。结果表明，该蛋白具有1个Sec14p超基因家族序列的 信号肽序列Sec14p(87-252位氨基酸)，此结构域被称为Sec14p样 脂质结合结构域，一般存在于分泌型蛋白和脂质调节蛋白中，该结构 域同G蛋白β/γ亚基相互关联。

(3)TMHMM-2.0分析表明，绵羊α-TTP蛋白氨基酸序列没有 发现跨膜结构域和跨膜区，说明此蛋白不具备跨膜作用。N-末端的信 号肽序列分析结果也表明，绵羊α-TTP蛋白出现信号肽和信号锚定 的可能性均为0，不具有跨膜功能，这与跨膜区分析和疏水性分析的 结果一致。

4、蛋白质保守结构域的预测

在蛋白保守区数据库(conserved domain database，CDD)对绵羊α -TTP蛋白进行蛋白保守区预测。结果表明，与该基因匹配的蛋白保 守区仅包含1个保守区，即SEC14保守域，其E-value值为6.19e-26。

实施例3绵羊α-TTP基因调节维生素E水平

在内蒙古赤峰市畜牧兽医科学研究所试验羊场选取21只体重相 近的五月龄敖汉细毛羊公羊(购自内蒙古自治区敖汉细毛羊种羊场)， 随机分为七组，其日粮中维生素E添加水平分别为0(对照组)、20、 100、200、1000、2000、2400IU/羊·天^-1，饲养周期为一年，试验结 束时屠宰动物，采集肝脏样品，样品经液氮速冻后放于-80℃保存备 用。利用RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒(购自北京天 根生化科技有限公司，产品目录号：DP431)提取绵羊肝脏RNA。

用常规方法合成cDNA后进行Real-Time PCR扩增，Real-Time PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，产品目录号：FP202-02。

根据扩增得到的绵羊α-TTP全长基因及绵羊β-actin内参基因 (GenBank登录号：NM_001009784)设计实时荧光定量PCR引物。 其中β-actin的上下游引物分别如SEQ ID No.11和12所示，绵羊 α-TTP基因的上游引物序列分别如SEQ ID No.13和14所示。

PCR程序如下表所示：

PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，63℃复性1min， 40个循环；然后95℃1min，63℃1min，95℃30s。

测定各样品的CT值，然后利用2^-ΔΔCt法进行相对定量分析。以 维生素E添加水平为0IU/羊·天^-1组为对照组，相对表达量分析结果 如图7所示。

结果表明，对照组(0IU/羊·天^-1)α-TTP基因表达水平较高， 与对照组比较，不同维生素E添加水平的试验组α-TTP基因表达水 平均低于对照组，其中尤以200IU/羊·天^-1维生素E添加水平试验组 的表达量最低。该结果表明，日粮维生素E水平会影响绵羊α-TTP 表达量，而不同试验组α-TTP表达量变化也显示机体对维生素E利 用水平的不同。同时说明，α-TTP在调节体内维生素E水平中重要 的作用，也表明本发明通过RACE技术扩增得到的基因序列为绵羊 α-TTP全长基因。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以 做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。