根特异启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体及构建方法

摘要

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种根特异启动子驱动水通道蛋白基因ZMPIP2a表达载体及构建方法。所述的根特异启动子驱动水通道蛋白基因ZMPIP2a表达载体的出发载体为PGreen0229质粒载体，并包含有水稻根特异性启动子基因EXP18-D和水通道蛋白基因ZMPIP2a。因为本发明的表达载体采用水稻根特异性启动子基因EXP18-D做为启动子，驱动水通道蛋白基因ZMPIP2a的表达，所以该表达载体具有特定地改变植物的根部形态、获得相应的抗旱植株潜力：转入该启动子的植株，在同等干旱条件下，存活率比相比对照组的野生型植株高60-70％。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种根特异启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体及构建方法。

 

背景技术

启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子三大类。目前，组织特异性启动子的调控机制己进入深入研究阶段，该类启动子除具有基本结构外，通常还有一些调控特异表达的序列，这些序列为转录因子提供了结合位点，通过与蛋白质的相互作用来调节基因表达。在组织特异性启动子的驱动下，基因的表达通常只发生在特定的组织或器官，并往往表现出发育调节的特性。

根是植物吸收水分和营养物质的重要器官，根特异表达系统可用于研究植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等。拟南芥的磷酸转移酶基因PHT1启动子与GUS融合，在农杆菌介导下转化拟南芥和拟南芥，组织化学分析显示蛋白只在拟南芥和拟南芥的根毛及根表皮表达，说明该启动子是根特异的。Borisjuk等用根特异启动子mas2、GFP和烟草钙网蛋白基因(calreticulin)构建融合表达载体，转基因烟草水培研究结果表明，根细胞不仅能高效产生某些目的蛋白质，而且可将目的蛋白质分泌到液体培养基中。

水通道蛋白是一种水的分子通道，植物细胞吸水必须要通过水通道蛋白的功能实现。爪蟾卵母细胞中的研究显示，水通道蛋白ZmPIP2a能够使爪蟾母卵细胞细胞膜透水性提高至原来的8倍，大大增加了细胞吸水能力。

玉米水通道蛋白家族有14个质膜水通道蛋白(plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)，其中包含PIP1与PIP2。其中玉米水通道蛋白ZmPIP2-5（即ZmPIP2a）的运输活性已经得到检验：其表现出高度水分运输活性。人工模拟的水分亏缺条件下，ZmPIP2a基因表达量有增加的趋势。其表达量的高低有可能与根系吸水能力的强弱以及作物抗旱性的强弱有关。

植物的根系在植物抗旱中起着重要的作用，根系吸水力的提升和根系形态的建成，无疑对提高植物的吸水力，增强其抗旱性具有重要的意义。多数的植物功能基因如激素合成、代谢相关基因，植物生长、发育调控基因在植物的地上部分和地下部分均有表达，通过简单的转基因或者基因沉默的方式只能从整体上调节基因在植物体的表达，不能特异性的实现对植物根系功能和发育的调控。

为了解决上述问题，需要利用植物根系特异性表达的启动子驱动水通道蛋白功能基因的表达，以达到既能提高植物吸水性、增加植物根系长度和数量，又不影响植物地上部生长、不损害植物营养生长的目的，由此通过转基因的手段能够获得相应的抗旱植株。目前的研究中需要构建一种根特异启动子驱动水通道蛋白基因表达载体。

 

发明内容

本发明提供一种根特异启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体，所述的根特异启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体的出发载体为PGreen0229质粒载体，并包含有水稻根特异性启动子基因EXP18-D和水通道蛋白基因ZMPIP2a。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种根特异启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体，所述的根特异启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体的出发载体为PGreen0229质粒载体，所述的根特异启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体的启动子是水稻根特异性启动子基因EXP18-D，所述的水稻根特异性启动子基因EXP18-D的下游包含有水通道蛋白基因ZMPIP2a。

所述的水稻根特异性启动子基因EXP18-D的序列为序列表中的SEQ ID No：4；所述的水通道蛋白基因ZMPIP2a的序列为序列表中的SEQ ID No：5。

所述的根特异启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体的构建方法包括以下步骤：

Ⅰ、UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体构建：

A、将基因35Sbar连接到PGreen0229质粒载体，得到35Sbar- PGreen0229质粒载体；

B、将基因Nos连接到所述的35Sbar -PGreen0229质粒载体，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体；

C、将基因UBQI连接到所述的Nos-35Sbar -PGreen0229质粒载体，得到UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体；

Ⅱ、EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体构建；

A、将所述的UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体进行酶切反应，切除基因UBQI，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体B：

B、 克隆水稻根特异性启动子基因EXP18-D，并连接到PMD18-T simple质粒载体，得到EXP18-D-T质粒载体；

C、用所述的EXP18-D-T质粒载体和Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体B构建EXP18-D-PGM-0229质粒载体；

D、克隆水通道蛋白基因ZMPIP2a，并连接到PMD18-T simple质粒载体，得到ZMPIP2a-T质粒载体；

E、用所述的ZMPIP2a-T质粒载体和EXP18-D-PGM-0229质粒载体构建EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体，即为所述的启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体。

所述的基因35Sbar的序列包含在序列表中的SEQ ID No：1中；所述的基因Nos的序列包含在序列表中的SEQ ID No：2中。

图1为所述的启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体的简图。

本发明的有益效果为：

因为本发明的表达载体采用水稻根特异性启动子基因EXP18-D做为启动子，驱动水通道蛋白基因ZMPIP2a的表达，所以该表达载体具有特定地改变植物的根部形态、获得相应的抗旱植株潜力：转入该启动子的植株，在同等干旱条件下，存活率比相比对照组的野生型植株高60-70％。

附图说明:

图1：本发明所述的图1为所述的启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体的简图；

图2：实施例1中，UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体菌液PCR反应扩增产物电泳图；

图3：实施例1中，UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体酶切产物电泳图；

图4：实施例1中，UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体的图谱；

图5：实施例1中，UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体酶切产物电泳图；

图6：实施例1中，大片段G连接产物电泳图；

图7：实施例1中，水稻启动子基因EXP18-D的PCR反应扩增产物电泳图

图8：实施例1中，EXP18-D-T质粒载体菌液PCR反应扩增产物电泳图；

图9：实施例1中，EXP18-D-T质粒载体酶切产物电泳图；

图10：实施例1中，Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体B酶切产物电泳图；

图11：实施例1中，EXP18-D-PGM-0229质粒载体菌液PCR反应扩增产物电泳图；

图12：实施例1中，EXP18-D-PGM-0229质粒载体酶切产物电泳图；

图13：实施例1中，水通道蛋白基因ZMPIP2a的 PCR反应扩增产物电泳图；

图14：实施例1中，ZMPIP2a-T质粒载体菌液PCR反应扩增产物电泳图；

图15：实施例1中，ZMPIP2a-T质粒载体酶切产物电泳图；

图16：实施例1中，EXP18-D-PGM-0229质粒载体酶切产物电泳图；

图17：实施例1中，EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体菌液PCR反应扩增产物电泳图；

图18：实施例1中，EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体酶切产物电泳图；

图19：实施例1中，培养10天时的各种拟南芥植株根长的对比图；

图20：实施例1中，培养20天时的各种拟南芥植株根长的对比图；

图21：实施例1中，干旱处理后各种拟南芥植株生长状态的对比图。

具体实施方式：

实施例1：

一种根特异启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体，出发载体为PGreen0229质粒载体，所述的根特异启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体的启动子是水稻根特异性启动子基因EXP18-D，所述的水稻根特异性启动子基因EXP18-D的下游包含有水通道蛋白基因ZMPIP2a。

所述的根特异启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体的构建方法包括以下步骤：

Ⅰ、UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体构建：

A、将基因35Sbar连接到PGreen0229质粒载体，得到35Sbar- PGreen0229质粒载体；

a. 将puc57-35Sbar质粒用SacI内切酶进行酶切反应，得到带有SacI酶切位点的基因35Sbar；

所述的带有SacI酶切位点的基因35Sbar的序列为序列表中SEQ ID No：1；所述的基因35Sbar由生工生物有限公司合成并连接在puc57质粒上，以puc57-35Sbar质粒的形式购买得到；

所述的酶切反应中，酶切体系为：

10×buffer： 2μl；SacI：2μl，质粒：10μl，ddH₂O；6μl；于37℃反应3小时；

b. 将PGreen0229质粒载体用SacI内切酶进行酶切反应，得到大小约为4451bp的片段B；

所述的酶切反应中，酶切体系为：

10×buffer：2μl；SacI：2μl，质粒：10μl，ddH₂O；6μl；于37℃反应3小时；

c. 对上述带有SacI酶切位点的基因35Sbar、大小约为4451bp的片段B进行回收处理，再进行连接反应，得到35Sbar -PGreen0229质粒载体；

上述连接反应中，连接体系为：10×buffer：1μl，片段A：7μl，片段B：1μl，

T4DNA连接酶：1μl；16℃连接过夜；

B、将基因Nos连接到所述的35Sbar -PGreen0229质粒载体，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体；

a. 将puc57-Nos质粒用HindⅢ、cspI内切酶进行酶切反应，得到带有HindII、cspI酶切位点的基因Nos；

所述的带有HindⅢ、cspI酶切位点基因Nos的序列为序列表中SEQ ID No：2；所述的基因Nos由生工生物有限公司合成并连接在puc57质粒上，以puc57-Nos质粒的形式购买得到；

所述的酶切反应中，酶切体系为：

10×buffer： 2μl； HindⅢ：1μl，cspI：1μl，质粒：10μl，ddH₂O；6μl；于37℃反应3小时；

b. 将所述的35Sbar -PGreen0229质粒载体用HindⅢ、cspI内切酶进行酶切反应，得到大小约为5804bp的大片段C和70bp左右的小片段D；

所述的酶切反应中，酶切体系为：

10×buffer： 2μl； HindⅢ：1μl，cspI：1μl，质粒：10μl，ddH₂O；6μl；于37℃反应3小时；

c.对大小约为5804bp的大片段C进行回收处理，再与所述的带有HindII、cspI酶切位点的基因Nos进行连接反应，得到所述的Nos-35Sbar -PGreen0229质粒载体；

上述连接反应中，连接体系为：10×buffer：1μl，所述的带有HindII、cspI酶切位点的基因Nos：7μl，大片段C：1μl，T4DNA连接酶：1μl；16℃连接过夜；

C、将基因UBQI连接到所述的Nos-35Sbar -PGreen0229质粒载体，得到UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体；

a. 将puc57-UBQI质粒用HindIII内切酶进行酶切反应，得到带有HindIII酶切位点的基因UBQI，即大小约为2000bp的片段E；

所述的酶切反应中，酶切体系为：

10×buffer： 2μl； HindⅢ：2μl，质粒：10μl，ddH₂O；6μl；于37℃反应3小时；

所述的带有HindIII酶切位点的基因UBQI的序列为序列表中SEQ ID No：3；所述的基因UBQI由生工生物有限公司合成并连接在puc57质粒上，以UBQI- puc57质粒的形式购买得到；

b. 将所述的35Sbar -PGreen0229质粒载体用HindIII内切酶进行酶切反应，得到大小约为5695bp的大片段F；

所述的酶切反应中，酶切体系为：

10×buffer： 2μl； HindⅢ：2μl，质粒：10μl，ddH₂O；6μl；于37℃反应3小时；

c.对大小约为5695bp的大片段F进行回收处理，再与所述的带有HindIII酶切位点的基因UBQI进行连接反应，得到所述的UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体；

d.将所述UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体通过热激法转化至所述的大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，再进行振荡培养处理、再进行涂板处理，得到PGM-0229-1转化平板；再将所述的UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229转化平板中的单菌落进行菌液PCR反应检测并制备得到含有UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体的甘油菌，置于-20℃冻存。

具体的操作为： 

取100ul的E.coli感受态细胞置于冰上自然融化；将6μl 的UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体分别加入感受态细胞中，轻轻混匀后，冰浴静置30分钟。于42℃水浴，90s热激，再置于冰上放置1～2分钟；得到转化后的感受态细胞；无菌环境下，向转化后的感受态细胞中，加入800μl LB液体培养基，37℃ 150rpm振荡培养1h，得到振荡培养物；

取200ul上述振荡培养物涂布于含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB琼脂平板上；涂布均匀，置于室温直至液体被完全吸收，得到转化平板；从上述转化平板上挑取若干生长状况良好的单菌落进行菌落PCR验证， 同时将挑取的单菌落于4ml含有Amp（100mg/L）的LB培养基中进行培养，经验证正确的为阳性克隆菌落培养物，吸取1ml过夜培养物，加入0.5ml 50%甘油于1.5ml离心管中，作为含有UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体的甘油菌，置于-20℃冻存。

d.将含有UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体的甘油菌进行复苏处理、振荡培养处理，质粒提取处理，得到UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体；

具体的操作为：

挑取所述的含有UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体的甘油菌，在含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB琼脂平板上划线，于37℃过夜培养；再挑取生长状况良好的单菌落，在含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB液体培养基中，于37℃摇床培养过夜，得到含有UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体的菌液；再将含有UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体的菌液进行质粒提取处理，得到UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体；所述的质粒提取处理采用质粒DNA小量纯化试剂盒，型号为DV801A，购自用宝生物工程（大连）有限公司；通过菌液PCR反应和酶切反应验证所述的UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体构建正确：      先进行菌液PCR反应，设计引物为： 

upper：CCCTGTTGTTTGGTGTTACT，lower：TGGGTGGGGGTCCATCT；

欲扩增得到始于基因UBQI起始处的下游1957bp，终于基因35Sbar起始处的下游370bp，长度为750左右的目的片段；

 图2为上述菌液PCR反应检测产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图1中，泳道M中为Takara DL5000 Marker bp，泳道1、2中为扩增产物，亮度最高的条带为750左右的片段；      

将菌液PCR呈阳性的菌液进行质粒提取处理，再采用EcoRI限制性内切酶对该质粒进行酶切反应检测；

图3为酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图3中，泳道M中为 Takara DL5000 Marker，泳道1-2中为酶切产物，条带由上至下分别为6765bp的片段和942bp的片段；

Ⅱ、EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体构建

A、将所述的UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体进行酶切反应，切除基因UBQI，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体B：

a.将所述的UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体进行酶切反应，切掉基因UBQI，得到大小为8170bp左右的大片段G和2000bp左右的小片段H；所述的酶切反应中，使用限制性内切酶HindⅢ；

所述的酶切反应中，酶切体系为：10×buffer： 2μl； HindⅢ：2μl，质粒：10μl，ddH₂O；6μl；于37℃反应3小时；

图5为以上酶切反应产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；   图5中，泳道M中为 DNA MarkⅡ，泳道1和泳道2中为酶切产物，条带由上至下分别为大小约为8170bp左右的大片段G和2000bp左右的小片段H；  

b. 对上述大小约为8170bp左右的大片段G进行回收处理，再进行连接反应，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体B；

所述的回收处理中，所用试剂盒为 宝生物工程（大连）有限公司 的 DNA凝胶回收试剂盒，型号为 DV805A；

上述连接反应中，连接体系为：10×buffer：1μl，大片段G：8μl，

T4DNA连接酶：1μl；16℃连接过夜；

图6为连接产物1％琼脂糖凝胶电泳图；图6中，泳道M中为Wide Range DNA Marker，泳道1和泳道2中为连接产物：大小为8170bp左右的大片段G；

B、 克隆水稻根特异性启动子基因EXP18-D，并连接并连接到PMD18-T simple质粒载体，得到EXP18-D-T质粒载体：

a. 从水稻植株中提取水稻基因组DNA，再进行PCR反应，并引入酶切位点HindⅢ、SpeⅠ，得到带有酶切位点HindⅢ、SpeⅠ的水稻根特异性启动子基因EXP18-D；所述的水稻植株的品种为日本晴，粳亚种Oryza sativa ssp.japonica；

所述的水稻根特异性启动子基因EXP18-D的序列（未引入HindⅢ、SpeⅠ酶切位点）为序列表中的SEQ ID No：4；

具体的操作为：

取生长15天的水稻植株为材料，用CTAB法提取水稻基因组DNA，进行PCR反应，得到带有酶切位点HindⅢ、SpeⅠ的水稻启动子基因EXP18-D；

所述的PCR反应的引物为序列为：Upper：  5-AAGCTTCAAGGCATGTCAAAGTC-3，

Lower：  5-ACTAGTGTTCCCCATTTCCTCTTAG-3 ；上述PCR反应的体系为：5×buffer ：5μl，dNTP：2μl，引物：2μl，水稻基因组DNA：1μl，PrimeSTAR：0.25μl，ddH₂O：14.75μl，上述PCR反应的程序为：94℃预变性5 min；98℃变性10 s，50℃退火15 s，72℃ 延伸2 min，共30个循环；72℃ 延伸10min；4℃保存；

图7为上述PCR反应产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图7中，泳道M中为DNA MarkerⅢ，泳道1和泳道2中为扩增产物：大小约为1957bp的片段；

b. 将所述的带有酶切位点HindⅢ、SpeⅠ的水稻启动子基因EXP18-D与PMD18-T simple 质粒载体进行连接反应，得到EXP18-D-T质粒载体；

c.将所述的EXP18-D-T质粒载体通过热激法转化至所述的大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，再进行振荡培养处理、再进行涂板处理，得到EXP18-D-T转化平板；再将所述的EXP18-D-T转化平板中的单菌落进行菌液PCR反应检测，并制备得到含有EXP18-D-T质粒载体的甘油菌，置于-20℃冻存。

具体的操作为： 

取100μl的E.coli DH5α感受态细胞置于冰上自然融化；将6μl 的EXP18-D-T质粒载体分别加入感受态细胞中，轻轻混匀后，冰浴静置30分钟。于42℃水浴，90s热激，再置于冰上放置1～2分钟；得到转化后的感受态细胞；无菌环境下，向转化后的感受态细胞中，加入800μl LB液体培养基，37℃ 150rpm振荡培养1h，得到振荡培养物；取200μl上述振荡培养物涂布于含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB琼脂平板上；涂布均匀，置于室温直至液体被完全吸收，得到转化平板；从上述转化平板上挑取若干生长状况良好的单菌落进行菌落PCR验证， 同时将挑取的单菌落于4ml含有Amp（100mg/L）的LB培养基中进行培养，经验证正确的为阳性克隆菌落培养物，吸取1ml过夜培养物，加入0.5ml 50%甘油于1.5ml离心管中，作为含有EXP18-D-T质粒载体的甘油菌，置于-20℃冻存。

图8为上述菌液PCR反应检测产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图8中，M泳道为MarkerⅢ，泳道1和泳道2中亮度最高的条带为大小为1957bp的片段；

d.将所述的含有EXP18-D-T质粒载体的甘油菌进行复苏处理、振荡培养处理，质粒提取处理，得到EXP18-D-T质粒载体；

具体的操作为：

挑取所述的含有EXP18-D-T质粒载体的甘油菌，在含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB琼脂平板上划线，于37℃过夜培养；再挑取生长状况良好的单菌落，在含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB液体培养基中，于37℃摇床培养过夜，得到含有EXP18-D-T质粒载体的菌液；再将含有EXP18-D-T质粒载体的菌液进行质粒提取处理，得到EXP18-D-T质粒载体；所述的质粒提取处理采用质粒DNA小量纯化试剂盒，型号为DV801A，购自用宝生物工程（大连）有限公司；

C、用所述的EXP18-D-T质粒载体和Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体B构建EXP18-D-PGM-0229质粒载体：

 a.将所述的EXP18-D-T质粒载体进行酶切反应，得到大小约为2500bp的大片段I和约为1957bp的小片段J；所述的酶切反应中，使用限制性内切酶HindⅢ、SpeⅠ；

所述的酶切反应中，酶切体系为： 10×buffer： 2μl； HindⅢ：1μl，SpeⅠ：1μl，质粒：10μl，ddH₂O；6μl；于37℃反应3小时；  

图9为以上酶切反应产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；   图9中，泳道M中为 DNA MarkerⅢ，泳道1中为酶切产物，条带由上至下分别为大小约为2500bp的大片段I和大小约为1957bp的小片段J；

b.将所述的Nos- 35Sbar -PGreen0229质粒载体B载体进行酶切反应，得到大小约为8040bp的大片段K；所述的酶切反应中，使用限制性内切酶HindⅢ、SpeⅠ；

所述的酶切反应中，酶切体系为：10×buffer： 2μl； HindⅢ：1μl，SpeⅠ：1μl，质粒：10μl，ddH₂O；6μl；于37℃反应3小时； 

图10为以上酶切反应产物的1％琼脂糖凝胶电泳图； 图10中，泳道M中为Wide Range DNA Marker， 泳道1中为酶切产物，条带为大小约为8040bp的大片段K；       

c. 将所述的大小约为8040bp的大片段K与约为1957bp的小片段J进行回收处理，再进行连接反应，得到EXP18-D-PGM-0229质粒载体；

所述的连接反应中，连接体系为：10×buffer：1μl，大片段K：1μl，小片段J：7μl ，T4DNA连接酶：1μl；16℃连接过夜；

d.将所述的EXP18-D-PGM-0229质粒载体通过热激法转化至所述的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，再进行振荡培养处理、再进行涂板处理，得到EXP18-D-PGM-0229质粒载体转化平板；再将所述的EXP18-D-PGM-0229质粒载体转化平板中的单菌落进行菌液PCR反应检测，并制备得到含有EXP18-D-PGM-0229质粒载体的甘油菌，置于-20℃冻存。具体的操作参见步骤B-c。

通过菌液PCR反应和酶切反应验证所述的EXP18-D-PGM-0229质粒载体构建正确：

图11为上述菌液PCR反应检测产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图11中，泳道M中为 DNA MarkerⅢ，泳道1、2中为扩增产物，亮度最高的条带为大小约为1957的片段；    

上述菌液PCR呈阳性的菌液进行质粒提取处理，再采用HindⅢ、SpeⅠ限制性内切酶对该质粒进行酶切反应检测；

图12为酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图12中，泳道M中为 DNA MarkerⅢ，泳道1、2、3中为扩增产物，最下面的条带为大小约为1957的小片段J；     

e.将含有EXP18-D-PGM-0229质粒载体的甘油菌进行复苏处理、振荡培养处理，质粒提取处理，得到EXP18-D-PGM-0229质粒载体；具体的操作为具体的操作参见步骤B-d。

D、克隆水通道蛋白基因ZMPIP2a，并连接到PMD18-T simple质粒载体，得到ZMPIP2a-T质粒载体： 

a. 从玉米植株中提取玉米基因组DNA，再进行PCR反应，并引入酶切位点SpeⅠ，NotⅠ，得到带有酶切位点SpeⅠ，NotⅠ的水通道蛋白基因ZMPIP2a； 所述的玉米植株的品种为中农99；所述的水通道蛋白基因ZMPIP2a序列（未引入SpeⅠ，NotⅠ酶切位点）的序列为序列表中的SEQ ID No：5；

具体的操作为：

取生长15天的玉米植株为材料，用CTAB法提取玉米基因组DNA，进行PCR反应，得到带有酶切位点SpeⅠ，NotⅠ的水通道蛋白基因ZMPIP2a；

所述的PCR反应的引物为序列为：

Upper：  5—ACTAGT GCACAGCAAGTCTCACCAG—3，

Lower：  5—GCGGCCGC GGCAACCAACGACGACAGG—3 ；  

上述PCR反应的体系为：5×buffer ：5μl，dNTP：2μl，引物：2μl，玉米基因组DNA：1μl，PrimeSTAR：0.25μl，ddH₂O：14.75μl，

上述PCR反应的程序为：94℃预变性5 min；98℃变性10 s，50℃退火15 s，72℃ 延伸1min，共30个循环；72℃ 延伸10min；4℃保存；

图13为上述PCR反应产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图13中，泳道M中为DNA MarkerⅡ，泳道1中为扩增产物，大小约为999bp的片段；

b. 将上述带有酶切位点SpeⅠ，NotⅠ的水通道蛋白基因ZMPIP2a与PMD18-T simple 质粒载体进行连接反应，得到ZMPIP2a-T质粒载体；

c.将所述的ZMPIP2a-T质粒载体通过热激法转化至所述的大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，再进行振荡培养处理、再进行涂板处理，得到EXP18-D-T转化平板；再将所述的ZMPIP2a-T转化平板中的单菌落进行菌液PCR反应检测并制备得到含有ZMPIP2a-T质粒载体的甘油菌，置于-20℃冻存。

具体的操作为：

取100ul的E.coli BL21(DE3)感受态细胞置于冰上自然融化；将6ul 的ZMPIP2a-T质粒载体分别加入感受态细胞中，轻轻混匀后，冰浴静置30分钟。于42℃水浴，90s热激，再置于冰上放置1～2分钟；得到转化后的感受态细胞；无菌环境下，向转化后的感受态细胞中，加入800ul LB液体培养基，37℃ 100rpm振荡培养1h，得到振荡培养物；

取200ul上述振荡培养物涂布于含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB琼脂平板上；涂布均匀，置于室温直至液体被完全吸收，得到转化平板；从上述转化平板上挑取若干生长状况良好的单菌落进行菌落PCR验证， 同时将挑取的单菌落于4ml含有Amp（100mg/L）的LB培养基中进行培养，经验证正确的为阳性克隆菌落培养物，吸取1ml过夜培养物，加入0.5ml 50%甘油于1.5ml离心管中，作为含有ZMPIP2a-T质粒载体的甘油菌，置于-20℃冻存。

图14 为上述菌液PCR反应检测产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图14中，M泳道为MarkerⅡ，泳道1-3中亮度最高的条带为大小约为999bp的片段；

d.将含有ZMPIP2a-T质粒载体的甘油菌进行复苏处理、振荡培养处理，质粒提取处理，得到EXP18-D-T质粒载体；

具体的操作为：

挑取所述的含有ZMPIP2a-T质粒载体的甘油菌，在含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB琼脂平板上划线，于37℃过夜培养；再挑取生长状况良好的单菌落，在含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB液体培养基中，于37℃摇床培养过夜，得到含有ZMPIP2a-T质粒载体的菌液；再将含有ZMPIP2a-T质粒载体的菌液进行质粒提取处理，得到ZMPIP2a-T质粒载体；所述的质粒提取处理采用质粒DNA小量纯化试剂盒，型号为DV801A，购自用宝生物工程（大连）有限公司；

E、用所述的ZMPIP2a-T质粒载体和EXP18-D-PGM-0229质粒载体构建EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体，即为所述的根特异启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体：

 a.将所述的ZMPIP2a-T质粒载体进行酶切反应，得到大小约为2500bp的大片段L和约为999bp的小片段M；所述的酶切反应中，使用限制性内切酶SpeⅠ，NotⅠ；

所述的酶切反应中，酶切体系为： 10×buffer： 2μl； NotⅠ：1μl，SpeⅠ：1μl，质粒：10μl，ddH₂O；6μl；于37℃反应3小时；

图15为以上酶切反应产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图15中，泳道M中为 DNA MarkerⅢ，泳道1-2中为酶切产物，条带由上至下分别为大小约为2500bp的大片段L和约为999bp的小片段M；

b.将所述的EXP18-D-PGM-0229质粒载体进行酶切反应，得到大小约为10000bp的大片段N；所述的酶切反应中，使用限制性内切酶SpeⅠ、NotⅠ；

所述的酶切反应中，酶切体系为：10×buffer： 2μl； NotⅠ：1μl，SpeⅠ：1μl，质粒：10μl，ddH₂O；6μl；于37℃反应3小时；  

图16为以上酶切反应产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图16中，泳道M中为 Wide Range DNA Marker，泳道1-2中为酶切产物，条带为大小约为10000bp的大片段N； 

c. 将所述的大小约为999bp的小片段M与大小约为10000bp的大片段N进行回收处理，再进行连接反应，得到EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体；

所述的连接反应中，连接体系为：10×buffer：1μl，大片段N：1μl：小片段M：7μl，T4DNA连接酶：1μl；16℃连接过夜；

d.将所述的EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体通过热激法转化至所述的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，再进行振荡培养处理、再进行涂板处理，得到质粒载体EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229转化平板；再将所述的EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体转化平板中的单菌落进行菌液PCR反应检测，并制备得到含有EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体的甘油菌，置于-20℃冻存。具体的操作参见步骤B-c。

通过菌液PCR反应和酶切反应验证所述的EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体构建正确：

图17为上述菌液PCR反应检测产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图17中，泳道M中为 DNA MarkerⅡ，泳道1、2中为扩增产物，条带为大小为999bp左右的片段；     

上述菌液PCR呈阳性的菌液进行质粒提取处理，再采用NotⅠ、SpeⅠ限制性内切酶对该质粒进行酶切反应检测；

图18为酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图18中，泳道M中为 Wide Range DNA Marker，泳道1-4中为酶切产物，条带由上至下分别为大小约10000bp左右的大片段N和约为999bp的小片段M；                                                                                               

e.将含有EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体的甘油菌进行复苏处理、振荡培养处理，质粒提取处理，得到EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体，即为所述的根特异启动子驱动水通道蛋白基因 ZMPIP2a表达载体；

具体的操作为具体的操作参见步骤B-d。

图1：实施例1中，EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体的简图；

Ⅲ、将所述的EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体转入拟南芥，得到有抗旱性的拟南芥植株。

A、通过农杆菌介导的花粉管通道法将所述的EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229质粒载体转染拟南芥；

试验材料：拟南芥(Arabidopsis thaliana)为Columbia-0野生型，菌株与质粒：大肠杆菌(Esche-richia coli)DH5a菌株、农杆菌(Agrobacterium turnefaciens)EHA105（GV3101）菌株；

主要试剂：70%消毒酒精、漂白消毒剂(50% 家用漂白剂、50％无菌水、0.05% Tween-20)、Silwet L-77、蔗糖(试剂级)、葡萄糖(试剂级)、食用蔗糖、甘露醇等；

培养基：

LB培养基1L：10 g胰蛋白胨(Tryptone)；5 g酵母提取物(Yeast Extract)；5 g NaC1；

渗透培养基：5% 蔗糖，0.3%-0.5% Silwet L-77，PH 5.7；

筛选培养基：1／2MS；8 g／L琼脂；50 μg Kan；pH 5.8。

（a）．拟南芥的培养与处理：

将春化3～4 d的拟南芥种子播种于用PNS(Plant Nutrition Solution)培养液浸湿的人工土中(腐殖土：蛭石=1：1)，并用保鲜膜罩上，置于人工培养室中光照培养，1个月后揭膜(培养室条件：相对湿度70% ，恒温(23±2)℃ ，光照强度4 000 lx，光照周期为黑暗8 h、光照16 h)；待植物培养至初生花序约5～15 cm、次生花序刚刚形成花芽状时，去除初生花序，有益于次生花序的生长发育，便于渗透转化；渗透转化处理应在去除初生花序3～5 d内完成；并且在渗透转化的前1 d植物需充分浇水，以便植物气孔在转化时充分张开；

（b）. 菌液的培养：将制备好的已转化了6种EXP18D启动子缺失体GUS表达载体的农杆菌菌液10mL，在转化前1 d晚上，转入大瓶过夜培养；第2天取出使用时农杆菌液OD600为约2.0；于室温离心处理（5000rpm，15 min），弃上清液，将农杆菌沉淀悬浮于约3倍体积的渗透培养液中，使OD600在0.8左右；

（c）. 农杆菌侵染拟南芥花序：将植物的地上部分浸入农杆菌悬浮液中侵染15秒；或用胶头滴管吸取农杆菌悬浮液一滴一滴对每朵花进行侵染；再用保鲜膜将侵染过的植物(T0代植物)罩起来以保持湿度，置人培养室中暗培养10 h，然后置于正常培养条件，2～3 d后可去掉保鲜膜；转化后1周左右方可浇水，并定期继续侵染几次，继续培养至植物成熟，收种子(T1代)放在干燥环境中1周左右，即可筛选到转化子；

（d）. 拟南芥T1代种子的筛选：将T1代种子先用70%的酒精浸泡消毒，再用漂白消毒剂溶液处理；消毒后的种子均匀地涂布在筛选培养基表面，于4℃放置2～3 d后，移至人工培养室中培养；然后将确定的转化子转入土壤中培养至成熟，收获种子（T2代种子）；

（e）.将上述T2代种子按照（d）中的方法进行筛选、培养，收获T3代种子；

（f）.将上述T3代种子经过两次筛选得到T3代纯合种子，消毒后在MS培养基培养，得到T3代拟南芥转化体植株；

b. 将所述的T3代拟南芥转化体植株与野生型，及已证明具有抗旱作用的突变体edt1进行比较；

（a）．将以上各种种子消毒后，在MS培养基培养10天时，观察拟南芥植株根长；

图19为培养10天时的拟南芥植株根长的对比图；图19中，通过比较可见，EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229转基因植株的根长明显大于野生型植株。

 

（b）．将以上各种种子消毒后，在蛭石与营养土为2：1的介质中种植30天时，观察拟南芥植株根长；

图20为培养30天时的拟南芥植株根长的对比图；图20中，通过比较可见，EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229转基因植株的根长明显大于野生型植株。

（c）.以上各种种子在蛭石与营养土为2：1的介质中种植30天时进行干旱处理，方式为停止浇水；上述干旱处理进行15天时，观察各种拟南芥植株表型。

图21为进行干旱处理后的拟南芥植株生长状态的对比图，分为上下两部分，反映了同一盆野生型拟南芥植株和同一盆EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229转基因植株干旱处理之前和干旱处理第15天后的生长状况；图21中，通过比较可见，上述干旱处理15天后，EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229转基因植株均成活，野生型拟南芥植株均死亡。

本实施例中，使用各种限制性内切酶、T4DNA 连接酶均购自Takara 公司；各种 Marker购自Takara公司；各种PCR反应试剂盒购自Takara公司；DNA纯化试剂盒、PMD18-T质粒载体试剂盒、PGreen0229质粒载体试剂盒均购自Promega公司；DNA凝胶回收试剂盒型号为 DV805A，购自宝生物工程（大连）有限公司；CTAB等其他常规生化试剂和试剂盒购自北京经科宏达生物技术公司和北京欣经科生物技术公司。

本实施例中，各种PCR引物合成和DNA测序工作均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

本实施例中，各种PCR反应使用PTC-100 Peltier Thermal Cycler基因扩增仪，购自MJ Research Inc公司；所述的琼脂糖凝胶电泳使用UVP Gel Documentation凝胶分析系统，购自基因公司；所述的琼脂糖凝胶电泳使用DYCP-31DN电泳仪，购自北京六一仪器公司。

本实施例中，采用的DNA提取、PCR、酶切、连接、转化等基因工程基本操作方法记载于各个试剂盒的说明书中；上述基本操作方法也可以参考《分子克隆实验指南第三版》中（（美〕J.萨姆布鲁克 等著，科学出版社，2002年出版），和《植物基因工程原理与技术》中（王关林, 方宏筠 著，科学出版社，1998）。