一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法

摘要

本发明提供了一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，属于农业生物技术领域。以单粒稻米研磨棒砸碎后，经苯酚-氯仿-异戊醇和氯仿-异戊醇两步抽提后，用醋酸钾和异丙醇共同沉淀核酸；DNA沉淀经70%乙醇润洗后室温干燥，加入去离子水溶解，得到DNA粗提液；向粗提液中加入RNA核糖核酸酶A，处理后重复氯仿-异戊醇抽提、核酸沉淀、润洗、干燥、溶解等步骤，获得较高质量的DNA溶液。采用本发明方法能有效的从单粒稻米胚乳中提取高质量的水稻基因组DNA，这些DNA不仅能有效用于稻米品种真实性和纯度的分子鉴定，解决其真伪判别的关键性技术难题；同时，还可用于水稻大片段基因的特异扩增，为其功能基因组研究奠定基础。

说明书

一、技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及一种稻米DNA的提取方法，尤其涉及一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法。

二、背景技术

随着我国国民经济的发展以及人民生活质量的提高，稻米市场开始出现由“量”到“质”的转变，优质稻米特别是优良食味稻米倍受广大消费者青睐。以日本优质大米“越光”和“一见钟情”为例，其价格为普通大米的数倍，但市场仍供不应求（巩迎军等，中国农学通报，2008，24 (12)：96-101）。因此，实现优质稻米的产业化不仅能有效提升我国稻米的市场竞争力，同时也是促进农业增效、农民增收的重要途径（曾松亭，杂交水稻，2010，S1：550-552）。

优良水稻品种的培育和优质稻米品种品牌的创制是实现优质稻米产业化的前提和关键（刘与忠，中国粮食经济，2010，12:24-25）。然而，这些还不足以解决优质稻米产业化发展过程中出现的许多问题。近年来，由于受经济利益的驱使，优质稻米品牌的假冒事件层出不穷，利用伪劣的稻米品种进行掺假，不仅给优质稻米的品牌形象造成极大的负面影响，同时也给稻米加工企业以及消费者带来严重的利益损失。以黑龙江著名的优良食味稻米品牌“五常大米”为例，其加工品种主要是“五优稻一号”、“五稻三号”、“富士光”以及“稻花香二号”，而市场上销售假“假米”往往是一些收购的散装大米。由于长期缺乏必要的稻米真实性和纯度检测技术，其品牌质量得不到保证，致使五常优质稻米的产业化发展陷入困境（英犁等，绿色中国，2010，14：50-52；杨立坚，科协论坛，2011，1：152）。因此，如何实现市售稻米品种真实性和纯度的快速鉴定开始成为科研单位、质量监督部门、稻米加工企业以及消费者等多方密切关注的问题。

目前，稻米品种真实性和纯度鉴定的方法虽然较多，如碾米品质法、外观观察法、蒸煮食味法、蛋白质分析法等，但这些方法的适用范围狭窄，可靠性不高，鉴定效果也并不理想。随着分子生物学的发展，基于DNA变异的分子标记开始被广泛应用于不同植物品种的真实性和纯度鉴定，由于该方法直接以DNA的形式出现，其差异体现的是不同品系的基因型差异，因而较其它物理、化学方法更为简单、准确（金伟栋等，上海农业学报，2006，22（1）：104-108）。因此，利用分子标记技术来进行稻米品种真实性和纯度鉴定是目前最佳的技术方案。

高质量基因组DNA的提取是实现稻米品种分子鉴定的基础。目前关于从水稻叶片、茎秆、幼穗、干种子等组织器官中提取基因组DNA的方法国内外报道的很多（Dellaporta SL et al., Plant Mol. Biol. Rep., 1983, 1 (1): 19-21; 田洁等，应用与环境生物学报，2004，10（2）:143-145；赵红霞等，湖北大学学报（自然科学版），2006，28（4）：389-392；韩美丽等，江西农业学报，2009，21（5）：1-3）。然而，这些方法均不适合进行稻米品种真实性、纯度的分子鉴定。这是由于市场上销售的精加工稻米仅含有胚乳组织，而胚乳中存在大量阻碍DNA提取的次生物质如淀粉、蛋白质、多糖、酚类杂质等，因此与水稻其它部位相比，稻米胚乳DNA的提取，特别是单粒稻米胚乳DNA提取，还存在着一定的难度（郑霏琴等，植物生理学通讯，1993，29 （6）： 438-440；沈文彪等，遗传，2003，25（2）：208-210）。因此，建立一种能从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，不仅能有效用于稻米品种真实性和纯度的分子鉴定，解决其真伪判别的关键性技术难题；同时，还可用于水稻大片段基因的特异扩增，为其功能基因组研究奠定基础。 

三、发明内容

技术问题： 本发明涉及一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法。针对稻米胚乳富含淀粉、蛋白质、多糖、酚类杂质等特点，采用特殊的提取步骤（如去除多糖、充分裂解细胞、降解蛋白等），从单粒稻米胚乳中获得浓度、纯度较高的基因组DNA。这些DNA不仅能有效用于稻米品种真实性和纯度的分子鉴定，同时还可用于水稻大片段基因的特异扩增。

技术方案：

本发明的内容是一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）去除稻壳、种皮、果皮、胚的单粒稻米，经牛皮纸包裹后，用研磨棒砸碎装入1.5 mL离心管；

1） 2）加入800 μL洗涤液于摇床上低速（120 rpm）振荡5 min去除多糖，4,000 rpm离心2 min后，丢弃上清液收集沉淀，其中洗涤液成分包括：100mM pH=8.0的Tris-HCl，50mM EDTA，0.35M山梨醇Sorbitol，质量比为1%的聚乙烯吡咯烷酮PVP-40； 

2） 3）在沉淀中加入添加了蛋白酶K和表面活性剂NP-40、Tween-20等试剂的600 μL DNA提取缓冲液，漩涡振荡使沉淀悬浮并上下颠倒混匀，而后置于65°C水浴45min以裂解细胞, 其中DNA提取缓冲液成分包括：质量比2%CTAB，100mM Tris-HCl，25mM EDTA，15M NaCl，质量比1%PVP-40，0.1mg/mL 蛋白酶K，质量比0.5%NP-40，质量比0.5% Tween-20，其中蛋白酶K、表面活性剂NP-40和Tween-20现用现加； 

3） 4）待上述混合物冷至室温后加入600 μL苯酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，于摇床上低速（120 rpm）5-10 min振荡至乳白色，12,000 rpm离心5 min，定量吸取500 μL上清液至另一新离心管，再加入500 μL氯仿：异戊醇体积比为24：1的氯仿-异戊醇混合液，于摇床上低速（120 rpm）振荡至乳白色5-10 min，12,000 rpm离心5 min后，定量吸取400 μL上清液至另一新离心管，加入40 μL pH=5.2的5 M醋酸钾溶液和293 μL的异丙醇混匀，于4°C放置2 h，12,000 rpm离心10 min，丢弃上清液，收集DNA沉淀，加入1 mL体积比为70%乙醇后轻弹管底使沉淀悬浮，于摇床上低速（120 rpm）振荡2 min，7,000 rpm离心3 min，丢弃上清液，室温下干燥沉淀，加入100 μL去离子水溶解沉淀，获得DNA粗提液； 

5）向粗提液中加入核糖核酸酶A至终浓度0.1 mg/mL，37°C温浴30 min去除RNA，再加入氯仿：异戊醇体积比为24：1的氯仿-异戊醇混合液抽提并重复上述的沉淀、润洗、干燥、溶解等步骤后，将沉淀用100 μL去离子水溶解，即获得DNA溶液。

有益效果

本发明提供的一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，与现有水稻基因组DNA提取方法相比，具有以下优点：

1）本发明提供的一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，其提取的主要对象为单粒稻米胚乳。由于稻米胚乳组织具有淀粉、蛋白质、多糖、酚类杂质等较多的特点，采用现有DNA提取方法很难从单粒稻米胚乳中获得质量较好的基因组DNA。而本发明在DNA提取过程中采取特殊的实验步骤，能有效去除多糖、充分裂解细胞、降解蛋白，从而获得浓度、纯度较高的基因组DNA；

2）利用本发明提供的方法从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA，不仅能满足DNA指纹分析的需要，有效解决市售稻米品种真实性和纯度分子鉴定的关键性技术难题，同时还可用于水稻大片段基因的特异扩增，为其功能基因组研究奠定基础。

3）利用本发明一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，能从水稻胚乳组织获得基因组DNA，与以水稻幼苗、茎秆或其它新鲜组织为对象的DNA提取方法相比，取材极为方便，不受植株生长发育阶段的影响，因而大大缩短实验的准备时间。

四、附图说明

图1  利用本发明方法从不同水稻品种（品系）单粒稻米胚乳中提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图

（M：DNA分子量标准，100-5,000 bp；1-6：镇稻88，南粳44，南粳45，宁9108，南粳5055，南粳46）

图2  以不同水稻品种（品系）单粒稻米胚乳中提取的基因组DNA为模板扩增微卫星（SSR）分子标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（A：RM495；B：RM7286）

（M：DNA分子量标准，50 bp ladder；1-6：镇稻88，南粳44，南粳45，宁9108，南粳5055，南粳46）

图3  以不同水稻品种（品系）单粒稻米胚乳中提取的基因组DNA为模板扩增水稻低直链淀粉含量基因Wx-mq的琼脂糖凝胶电泳图

（M：DNA分子量标准，100-2,000 bp；1-6：镇稻88，南粳44，南粳45，宁9108，南粳5055，南粳46）

图4  以不同水稻品种（品系）单粒稻米胚乳中提取的基因组DNA为模板扩增水稻胚乳蛋白合成基因OsVP1的琼脂糖凝胶电泳图

（M：DNA分子量标准，100-5,000 bp；1-6：镇稻88，南粳44，南粳45，宁9108，南粳5055，南粳46）

五、具体实施方式

为充分公开本发明一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，以下结合方法验证和实施实例加以说明。

（一） 试验材料

镇稻88（直链淀粉含量正常的中熟中粳品种，江苏省镇江市农业科学研究所），南粳45（直链淀粉含量正常的迟熟中粳品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所），南粳44（直链淀粉含量正常的早熟晚粳品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所），宁9108（低直链淀粉含量迟熟中粳品系，江苏省农业科学院粮食作物研究所），南粳5055（低直链淀粉含量早熟晚粳品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所），南粳46（低直链淀粉含量中熟晚粳品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所）

以上材料均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为：胡春明等，中粳稻镇稻88育种实践的分析与启示，江西农业学报，2008，20（11）：47-49；仲维功等，粳稻新品种南粳45的选育及栽培技术，江苏农业科学，2009（5）：123-125；王才林等，抗条纹叶枯病水稻新品种南粳44的特征特性与栽培技术，江苏农业科学，2007，2：43-44；姚姝等，分子标记辅助选择聚合水稻暗胚乳突变基因Wx-mq和抗条纹叶枯病基因Stv-bⁱ，中国水稻科学，2010，24（4）：341-347；http://cnpvp.cn/（品种权号：CNA20070694.2）；

抗条纹叶枯病优良食味晚粳稻新品种南粳46的特征特性与栽培技术，江苏农业科学，2008，2：91-92）。

（二） 单粒稻米胚乳基因组DNA的提取

1）取镇稻88，南粳44，南粳45，宁9108，南粳5055，南粳46六个不同水稻品种（品系）的干种子用糙米机去除谷壳，然后用精米机去除种皮和胚，得到与市售稻米一样，仅保留胚乳组织的精米；

2）不同品种（品系）的精米各取一粒经牛皮纸包裹后，用研磨棒砸碎后装于1.5 mL离心管，加入800 μL洗涤液，于摇床上低速（120 rpm）振荡5 min，4,000 rpm离心2 min，丢弃上清液，收集沉淀物备用。其中洗涤液配方：100mM pH=8.0的Tris-HCl，50mM EDTA，0.35M山梨醇Sorbitol，质量比为1%的聚乙烯吡咯烷酮PVP-40；

3）向上述沉淀物中加入600 μL的DNA提取缓冲液，漩涡振荡使沉淀悬浮并上下颠倒混匀，而后置于65°C水浴45 min，每隔10 min缓慢摇动一次，使混合物充分混匀。其中DNA提取缓冲液配方：质量比2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），100 mM Tris-HCl，25 mM EDTA，15 M NaCl，质量比1%PVP-40，0.1 mg/mL Protease K（蛋白酶K），质量比0.5%NP-40，质量比0.5%Tween-20，蛋白酶K、表面活性剂NP-40和Tween-20现用现加；

  4）待上述混合物冷至室温后加入等体积即600 μL的苯酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，于摇床上低速（120 rpm）振荡至乳白色（5-10 min），12,000 rpm离心5 min，定量吸取500 μL上清液至另一新离心管； 

 5）向上述液体中加入等体积即500 μL的氯仿：异戊醇体积比为24：1的氯仿-异戊醇混合液，于摇床上低速（120 rpm）振荡至乳白色（5-10 min），12,000 rpm离心5 min，定量吸取400 μL上清液至另一新离心管；

  6）向上述液体中加入1/10体积即40 μL的pH=5.2的5 M醋酸钾，再加入2/3体积即293 μL的异丙醇混匀，于4°C放置2 h，12,000 rpm离心10 min，丢弃上清液，收集沉淀；

7）向上述沉淀中加入1 mL 体积比70%乙醇，轻弹管底使沉淀悬浮，于摇床上低速（120 rpm）振荡2 min，7,000 rpm离心3 min，丢弃上清液，室温下干燥沉淀，加入100 μL去离子水溶解沉淀，获得DNA粗提液； 

 8）向粗提液加入核糖核酸酶A至终浓度0.1 mg/mL，37°C温浴30 min去除RNA；

 9）重复步骤5-7；

 10）将沉淀用100 μL去离子水溶解，即获得DNA溶液。

（三） 单粒稻米胚乳基因组DNA的质量测定

采用上述一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法制备了镇稻88，南粳44，南粳45，宁9108，南粳5055，南粳46等6个水稻品种（品系）的基因组DNA，并通过日本进口HITACHI U-2810紫外分光光度计对其浓度和质量进行检测。结果表明所提DNA浓度介于10~15 ng/μL，OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.7~1.9之间（计算公式DNA纯度= OD260/OD280 （如果该值＞1.9，表明有RNA污染；如果该值＜1.6，表明有蛋白质、酚类等污染）；DNA样品的浓度（μg / μL）=OD260×稀释倍数×50/1000）；同时，为检测基因组DNA的完整性，取3 μL DNA溶液在质量比1%琼脂糖凝胶电泳120V电泳20min，经溴化乙锭染色后在GENE GENIUS全自动紫外凝胶成像分析系统中可以看出，凝胶的点样孔干净、无蛋白或多糖残留，DNA条带清晰、无拖尾（图1）。因此，利用该方法提取的单粒稻米胚乳基因组DNA浓度（10~15 ng/μL）、纯度（1.7~1.9）和完整性都非常好。

（四） 以单粒稻米胚乳基因组DNA为模板进行SSR分子标记的扩增

以上述6个水稻品种（品系）的单粒稻米胚乳基因组DNA为模板，利用两对SSR标记RM495和RM7286对其进行扩增。PCR扩增体系为：10 μL的PCR反应体系中包括提取的单粒稻米胚乳基因组DNA溶液1 μL，2.5 nmol/L的SSR引物0.5 μL，2.5 mmol/L的dNTP 0.25 μL，10×PCR Buffer（包括MgCl₂）1 μL，Taq DNA聚合酶0.5U（购于北京鼎国生物技术有限公司），ddH₂O 6.75 μL；PCR扩增程序为：94°C预变性5min；随后进入32个循环，每个循环中94°C变性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸30 s，72°C后延伸10 min。取2 μL PCR产物上样，经质量比9%聚丙烯酰胺凝胶180V电泳2 h，银染显色得到PCR的扩增结果，由图2可以看出扩增条带清晰、杂带少、便于读带，说明利用该方法提取的单粒稻米胚乳基因组DNA符合SSR标记PCR扩增的要求。

（五） 以单粒稻米胚乳基因组DNA为模板进行水稻低直链淀粉含量基因Wx-mq的PCR检测

根据水稻低直链淀粉含量基因Wx-mq在Wx位点第497位核苷酸发生G到A的等位变异，设计Wx-mq两对特异PCR引物（正向外引物序列Wx-mq-O-F为5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3', 反向外引物序列Wx-mq-O-R 为5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'，正向内引物序列Wx-mq-I-F为5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'，反向内引物序列Wx-mq-I-R为5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'，引物序列尚为发表），并以上述6个水稻品种（品系）的单粒稻米胚乳基因组DNA为模板，对其进行扩增。PCR扩增体系为：20 μL的PCR反应体系中包括提取的胚乳基因组DNA溶液2 μL，2.5 nmol/L的引物（Wx-mq-O-F，Wx-mq-O-R，Wx-mq-I-F和Wx-mq-I-R）2μL，2.5 mmol/L的dNTP 0.5 μL，10×PCR Buffer（包括MgCl₂）2 μL，Taq DNA聚合酶0.5U（购于北京鼎国生物技术有限公司），ddH₂O 13 μL；PCR扩增程序为：94°C预变性5min；随后进入32个循环，每个循环中94°C变性30 s，65°C退火30 s，72°C延伸30 s，72°C后延伸10 min。取20 μL PCR产物在质量比1.5%琼脂糖凝胶上120V电泳25 min，经溴化乙锭染色后并于GENE GENIUS全自动紫外凝胶成像分析系统下观察。由图3可以看出直链淀粉含量正常的水稻品种（系）镇稻88，南粳44，南粳45能扩增出439 bp和200 bp的特异条带，而低直链淀粉含量的水稻品种（系）宁9108，南粳5055，南粳46则能扩增出439 bp和292 bp的特异条带。上述扩增条带非常清晰，易于区别目的基因的等位性变异，这说明利用该方法提取的单粒稻米胚乳基因组DNA适合进行短片段特异PCR检测。

（六） 以单粒稻米胚乳基因组DNA为模板进行水稻胚乳蛋白合成基因OsVP1的PCR扩增 

根据GenBank序列数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）中报道的水稻胚乳蛋白合成基因OsVP1（AK073805）的序列设计引物（正向引物OsVP1-F：CACTACAGGGGTTCAACGATGA，反向引物OsVP1-R：CGTCTTTTTCGCTGACGATACCT），并以上述6个水稻品种（品系）的单粒稻米胚乳基因组DNA为模板，进行扩增，PCR扩增体系为：30 μL的PCR反应体系中包括提取的DNA溶液2 μL，2.5 nmol/L的引物（OsVP1-F和OsVP1-R）2 μL，2.5 mmol/L的dNTP 2 μL，5×PS Buffer 1 μL，Prime STAR DNA聚合酶1 U（购于TaKaRa公司），ddH₂O 22 μL；PCR扩增程序为：94°C预变性5min；进入32个循环，每个循环中98°C变性10 s，58°C退火10 s，72°C延伸210 s；72°C后延伸10 min。取30 μL PCR产物在质量比1%琼脂糖凝胶上120V电泳30min，经溴化乙锭染色后并于GENE GENIUS全自动紫外凝胶成像分析系统下观察，由图4可以看出6个品种均扩增出长度为3.5 kb的特异条带，且亮度高、非常清晰。因此，说明利用该方法提取的单粒稻米胚乳基因组DNA适合进行长片段特异PCR扩增。

SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  江苏省农业科学院

 

 

<120>  一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法

 

 

<130>  0

 

 

<160>  6    

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

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<221>  Wx-mq-O-F

<222>  (1)..(28)

<223> 

 

 

 

<400>  1

atgttgtgtt cttgtgttct ttgcaggc                                        28

 

 

<210>  2

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  Wx-mq-O-R

<222>  (1)..(28)

<223> 

 

 

 

<400>  2

gtagatcttc tcaccggtct ttccccaa                                        28

 

 

<210>  3

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  Wx-mq-I-F

<222>  (1)..(28)

<223> 

 

 

 

<400>  3

gggtgaggtt tttccattgc tacaatcg                                        28

 

 

<210>  4

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  Wx-mq-I-R

<222>  (1)..(26)

<223> 

 

 

 

<400>  4

gtcgatgaac acacggtcga ctcaat                                          26

 

 

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<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  OsVP1-F

<222>  (1)..(22)

<223> 

 

 

 

<400>  5

cactacaggg gttcaacgat ga                                              22

 

 

<210>  6

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  OsVP1-R

<222>  (1)..(23)

<223> 

 

 

 

<400>  6

cgtctttttc gctgacgata cct                                             23