一种富集培养同型产乙酸菌的方法

摘要

本发明公开了一种富集培养同型产乙酸菌的方法，在抑制产甲烷条件下，以甲酸钠为碳源，对厌氧污泥中同型产乙酸细菌进行选择性培养，通过调整甲酸钠浓度，可实现厌氧污泥中同型产乙酸菌的富集。本发明以甲酸钠为碳源，以BES为产甲烷抑制剂，在UASB反应器中，对经过酸化驯化的厌氧污泥进行中温厌氧选择性培养。当甲酸钠投加量为1.3g/L～13g/L，BES投加量为30～50mmol/L，初始pH为7±0.5，经过一段时间的连续培养，同型产乙酸菌数目扩大了两个数量级。此结论对研究同型产乙酸菌的培养有重要作用，并为混菌条件下培养某种共同特质的微生物提供了参考。

说明书

技术领域

本发明涉及一种经济高效的富集培养同型产乙酸菌的方法，特别是一种采用甲酸钠逐步 替代葡萄糖碳源，并投加适量BES以抑制产甲烷生长的方式，在厌氧污泥中，中温定向富集 同型产乙酸菌的方法。

技术背景

同型产乙酸菌是一类能够利用厌氧乙酰CoA途径将CO₂/CO和H₂还原为乙酸的厌 氧微生物，最显著的特点在于将1分子葡萄糖生成3分子乙酸，理论产量达100％。同型产 乙酸菌是一种分布极广、形态差异极大的微生物，既可以自养生活又可以异养生活，在厌氧 污泥中占总微生物量的3～11％；至今为止，已在各种厌氧生境中分离到近20个属，超过100 种不同生理特性的同型乙酸菌，生存条件各不相同。它每年大约生成10¹³kg乙酸，占整个厌 氧产乙酸体系的10％，因此同型产乙酸菌在全球碳循环过程中占据一个非常重要的地位，也 具有应用于工业的巨大潜力。

同型产乙酸菌具有诸多工业化的优势：如代谢产物广(乙酸、丙酮酸、乙醇、乳酸等)， 都是有用的基本有机化工原料；对生存条件 要求不是很高，适于厌氧生长但又能耐受一定的氧分压；在异养生长的同时能利用厌氧乙酰 辅酶A途径还原部分二氧化碳，使二氧化碳减量化、资源化。因此富集和定向培养污泥中的 同型产乙酸菌具有重大的意义。

对于同型产乙酸菌的富集已有很多报道，但是大多是纯菌培养。纯菌培养具有成本高、操作 困难、培养菌种相对单一等特点。在混菌培养同型产乙酸菌领域中，Ryan P(Ryan P，Forbes C， McHugh S.Enrichment of acetogenic bacteria in high rate anaerobic reactors under mesophilic and thermophilic conditions.Water research，2010，44：4261-4269)等利用蔗糖、乙酸、香草 酸钠和甲酸钠对厌氧污泥在中温和高温条件下富集同型产乙酸菌，并比较两种条件下的富集 效果，此实验是在未抑制甲烷菌活性条件下进行的，整个培养过程经过588天完成，对富集效 率和数量方面未作具体说明。因此在抑制产甲烷条件、简化培养手段、缩短培养时方面需要 做进一步研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种在抑制产甲烷条件下，利用甲酸钠的投加，选择性地富集培养 厌氧污泥中同型产乙酸菌的方法。其理论基础是同型产乙酸菌可通过乙酰辅酶A途径对甲酸 钠进行优先利用，在混菌培养过程中，具有竞争优势。

技术方案：首先驯化厌氧污泥，是产酸微生物占主要地位，然后加热污泥，杀灭产甲烷 菌，再将污泥活化，最后在添加BES抑制产甲烷菌活性的条件下，通过葡萄糖为碳源的扩大 培养和甲酸钠为碳源的选择性富集培养逐步完成对同型产乙酸菌的富集。

本发明的有益效果：本发明采用在反应器中投加甲酸钠，使同型 产乙酸菌逐步得到富集。此方法一方面可以使厌氧污泥中的同型产乙酸菌比例增加，为同型 产乙酸菌产生具有各种经济价值的终产物提供有利条件；另一方面，对混菌培养微生物提供 了一种方法；同时，可以利用培养的污泥吸收CO₂减少温室气体排放，使其资源化。

附图说明

图1甲酸钠利用率

A.第一阶段    B.第二阶段    C.第三阶段

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于此。

实施例1：利用甲酸钠进行同型产乙酸菌的选择性培养

将取自无锡卢村污水处理厂脱水污泥进行驯化，使产酸菌作为主要菌群。具体驯化条件 为：在UASB反应器中接种厌氧污泥，以10g/LC₆H₁₂O₆，0.5g/L NH₄Cl、0.3g/L MgCl₂、0.25g/L K₂HPO₄、0.25g/L KH₂PO₄、和含有0.025g/LFeCl₃、0.016g/LNiSO₄、0.025mg/LCaCl₂、 0.0115g/LZnCl₂、0.0105g/LCoCl、0.005g/LCuCl₂和0.015g/LMnCl₂混合作为培养液，进行驯 化。混合作为营养液，用于驯化污泥(HRT＝1h，35℃，pH定期监控)至出水pH＝4±0.2，并 稳定两天。驯化后的污泥置于烘箱经105℃加热2h，杀灭产甲烷菌，然后在有效容积为10L 的UASB反应器中35℃活化48h。在此过程中利用的的培养液与驯化污泥过程中的培养液相 同。取4gVS/L的活化后的污泥接种到有效体积为5L的UASB反应器中，在进水pH＝7， HRT＝1d，中温静置培养条 件下开始选择性培养。首先在第一阶段利用4g/L葡萄糖配置的营养液(其他成分与驯化污泥 所用到的相同)，扩大培养10天。进入第二阶段添加1.3g/L的甲酸钠进入培养液，同时逐渐 减少培养液中葡萄糖添加量直至为0g/L，培养10d。利用定量PCR方法测这两阶段结束后的 污泥，结果表明，通过此方法的培养，污泥中的fhs基因数目比最初的增加约3倍，实现了 同型产乙酸菌数量的增加。表1为驯化过程中，同型产乙酸菌数量及总菌数。表3为驯化的 碳源浓度参数。

表1

定量PCR参数如下：

PCR反应体系选用50μl反应体系：5×PCR缓冲液10μl，5.0mM MgCl2，0.2mM dNTP，2U Ex-Taq HS DNA聚合酶，DNA模板(100ng/l)1μl。本研究所用试剂均购自TaKaRa公司。PCR 仪为PTC-200DNA Engine(BioRad，USA)。

总细菌16S rRNA基因扩增采用正向引物细菌27f(5′-AGAGTTTGATCMTG GCTCAG-3′)。 反向引物为1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。正反向引物均由上海生工合成。PCR 反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性45sec，54℃复性1min，72℃延伸1min，21个 循环，72℃最终延伸5min。

Rhs基因扩增采用正向引物细菌27f(5′-GTWTGGGCWAARGGYGGMGAAGG-3′)。反向引物 为1492r(5′-GTATTGDGTYTTRGCCATACA-3′)。PCR扩增条件：94℃变性4min，94℃变 性45s，63℃退火45s，72℃延伸1min，每个循环退火温度降低1℃持续9个循环。随后 94℃变性45s，55℃延伸45s，72℃延伸1min共30个循环，循环结束后72℃延伸5min。

实施例2：不同浓度的甲酸钠对定向富集同型产乙酸菌的影响

在上个实验的基础上，继续逐步提高投加的甲酸钠浓度。由图1所示，试验分为三个培 养阶段，各个阶段的甲酸钠浓度分别为3.25g/L、6.5g/L和13g/L，且这三个阶段相应的培养 时间分别为20d、15d和15d，培养条件与实例1相同。同时，通过测试甲酸钠的利用率，分 析每个阶段污泥中fhs基因的数目。由图1可知，甲酸钠在三个阶段的利用率分别89.0±1％、 13.0±1％和6.9±1％。因此，结合由表2可知，fhs数量从初始的1.56×10⁸/mL逐渐增加到2.93×10⁹， 6.09×10⁹和6.08×10⁹，总菌量由3.12×10¹¹/mL逐渐增加到3.92×10¹¹/mL、5.31×10¹¹/mL和 5.76×10¹¹/mL，即总菌数变化不大。同时，结合图1和表2可知，在第一阶段甲酸钠浓度为 3.25g/L时，fhs基因数上升一个数量级，增长速率最快，甲酸钠利用率最高，可见在此培养 条件下，当甲酸钠为3.25g/L时，最有利于同型产乙酸菌的富集培养。表2为实验实例2条件 下驯化过程中，同型产乙酸菌数量及总菌数。表3为驯化的碳源浓度参数。

表2

表3

虽然本发明已以较佳实例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动与修饰，因此本发明的保护范围应该 以权力要求书所界定的为准。