法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-12-22
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C40B30/04 授权公告日:20150617 终止日期:20161105 申请日:20101105
专利权的终止
2015-06-17
授权
授权
2013-12-11
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/574 申请日:20101105
实质审查的生效
2012-05-23
公开
公开
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种基于组织芯片的肿瘤特异性靶点和靶向配体的筛选方法。
背景技术
肿瘤已成为严重威胁人类健康的疑难病症之一,正在超越心血管疾病成为人类第一死亡原因。肿瘤的传统治疗手段主要是手术、放疗和化疗。这些治疗手段除了切除和破坏肿瘤组织外,由于其无靶向性,对正常的组织、细胞也产生较大破坏。
靶向治疗是现代肿瘤治疗领域的重要进展,其在肿瘤分子细胞生物学的基础上,将肿瘤组织或细胞所具有的特异性结构分子作为靶点,使用某些能与这些靶分子特异结合的抗体、配体等,达到直接治疗或靶向治疗目的。
靶向治疗涉及到两个方面,即靶点及靶向载体。
靶向治疗的靶点通常是细胞癌变后所表达的不同于正常细胞的生物分子,主要是各类蛋白。肿瘤细胞既含有正常细胞所表达的蛋白,同时还会含有某些正常细胞没有的蛋白或者缺失某些正常细胞表达的蛋白,这些肿瘤细胞特异性表达的蛋白的变化就为肿瘤的靶向治疗提供了基础。
靶向治疗的载体是具有一定特异性的,能将生物活性物质选择性地运送到肿瘤部位,把治疗药物的作用尽量限定在特定的靶细胞、组织或器官内,而不影响正常细胞、组织或器官功能的一类载体。
小分子配体是靶向治疗的理想载体。小分子配体与目前使用的抗体载体相比有着很大优势:可以快速穿透组织及细胞;血液清除速率高;体外合成简单,质控容易。
常用的小分子配体筛选系统有:(1)固相或液相纯化抗原的筛选;(2)建系细胞筛选;(3)荷瘤裸鼠筛选;(4)组织切片筛选。其中固相或液相纯化抗原的筛选系统只能用于筛选和已知抗原相结合的配体,具有局限性。建系细胞筛选系统筛选到的配体只能针对某一特定的细胞亚型,无法克服肿瘤的异质性带来的筛选到的配体通用性不高的缺点。荷瘤裸鼠筛选系统虽然最大的保持了靶蛋白的原始状态,但是筛选到的配体通用性不高。而组织切片筛选系统由于同一肿瘤内的异质性和不同病人间的差异也存在所筛选到的配体通用性不高的缺陷。
因此,现有的筛选技术中急需一种可以筛选到高特异性、高通量、可针对某一类型肿瘤的配体并可同时确定肿瘤标志物的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中药物或靶向治疗通用性不高、筛选系统与肿瘤在体生存环境差距大、筛选通量小、费时费力的缺点,提供一种基于组织芯片的肿瘤特异性靶点和靶向配体的筛选方法。
本发明的基于组织芯片的肿瘤特异性靶点和靶向配体的筛选方法包括如下步骤:
(a).将正常组织芯片进行抗原修复的预处理后,进行内源性酶封闭处理,然后加入配体库,使配体与正常组织上表达的抗原结合;
(b).洗涤正常组织芯片,从而得到大量未与正常组织结合的配体混合物;
(c).将步骤(b)中得到的配体混合物加入到经过抗原修复且封闭了内源性酶的肿瘤组织芯片上,使配体与肿瘤组织上表达的特异性抗原结合;
(d).除去步骤(c)中未与肿瘤组织芯片结合的配体后,用洗脱液洗涤肿瘤组织芯片从而得到大量与肿瘤组织结合的噬菌体混合物;
(e).将步骤(d)中得到的噬菌体混合物进行扩增,然后纯化,再重复步骤(a)-(d)3次以上,且逐轮提高洗脱强度,以增加生物淘选力度,得到不与正常组织结合,但特异性结合肿瘤组织的配体混合物;
(f).将步骤(e)中得到的特异性结合肿瘤组织的配体混合物进行序列分析,选出共有序列高的特异性配体;
(g).将步骤(f)中筛选到的共有序列高的特异性配体返回到淘选时所用的肿瘤组织芯片上进行验证,然后对所得到的配体进行特异性和通量分析;
(h).利用特异性配体来鉴定其所结合的抗原。
所述步骤(a)中的预处理为常规芯片处理,即石蜡组织芯片进行二甲苯脱蜡/冰冻组织芯片进行冰丙酮固定后,分别浸泡在无水乙醇-90%乙醇-80%乙醇-蒸馏水中进行逐级水化。
所述步骤(a)中的进行封闭、消除内源性酶目的在于降低非特异性结合。其中封闭液可采用血清、BSA等常规封闭液。
所述步骤(a)中的抗原修复包括目前使用的任何方法。如真空负压抗原修复法、微波辐射抗原修复法、高压抗原修复法、隔水热抗原修复法、电炉加热抗原修复法、胃蛋白酶消化 法和胰蛋白酶消化法。但是不限于上述抗原修复方法。
所述步骤(a)中的配体库包括目前使用的任何配体库,如噬菌体随机肽库、噬菌体抗体库、mRNA展示肽库、核糖体展示肽库、RNA随机库、PNA等,但不限于以上所述配体库。
所述步骤(b)中的正常组织芯片与步骤(c)中的肿瘤组织芯片的供体种属来源包括人、猴、大鼠、小鼠、猪、兔及豚鼠,不同的组织来源包括肺、肝、胃、食道、舌、十二指肠、小肠、结肠、直肠、甲状腺、甲状旁腺、肾、肾上腺、胰腺、前列腺、大脑、小脑、骨骼肌、心肌、平滑肌、血管、垂体、睾丸、卵巢、表皮、视网膜、骨、软骨、眼、胎盘、脾脏、腮腺、下颌腺、胸腺等,细胞来源包括Hep-2细胞、粒细胞、血小板等,但不限于上述所述细胞或组织来源。上述组织芯片的基质包括石蜡组织、冰冻组织和/或培养细胞。
所述步骤(f)中的验证方法包括免疫组织化学、免疫荧光、原位杂交等,但不限于以上所述检测方法。
所述步骤(h)中所述鉴定抗原的方法包括但不限于免疫沉淀、双向电泳、亲和层析等方法。
所述(a)-(h)步骤中可使用任何适当的洗脱液。洗脱液可含有0%-2%(w/v)的表面活性剂,洗脱可持续适当的时间,如5-30分钟。
所述(a)-(h)步骤中的配体库与组织芯片的结合可以在任何适当的温度下进行,如4℃-70℃。结合时间可控制在2h至过夜。
与现有技术相比,本发明的优点是:
1.筛选到的靶向配体有较高的特异性,可穿越肿瘤细胞,不会引起免疫反应;同时通用性高,可以针对多数病人某一类型的肿瘤。
2.由于组织芯片技术已经成熟,本发明有了很广泛的引用,与纯抗原和建系细胞的筛选系统相比,本筛选系统保持了肿瘤在体生长时原始状态;与荷瘤小鼠筛选系统相比,由于不需要进行动物的饲养,本发明省时,省力,节约成本,且实验结果可比性强。
3.与传统筛选系统相比,本发明可同时进行肿瘤特异性靶点分析和靶向配体的研究。
4.本发明的验证方法简单,只要进行免疫组化、免疫荧光或原位杂交即可对筛选到的配体在肿瘤组织中的特异性和定位进行分析,操作简单。
附图说明
图1是筛选出的噬菌体克隆返回肺鳞状细胞癌组织芯片进行特异性结合验证的结果图
图2是筛选出的噬菌体克隆返回肺正常组织芯片进行特异性结合验证的结果图(其中未见明显的棕黄色染色)
A:染为棕黄色的特异性结合肺鳞状细胞癌组织的配体
具体实施方式
I.材料
Ph.D.-7TMPhage Display Peptide Library Kit购自New England Biolabs(Beijing)Co.Ltd;肺鳞状细胞癌(中分化)组织芯片CS04-03-001、肺正常组织(多个部位)组织芯片NC04-01-001及验证试验中用到的CS04-03-002,均购自陕西超英生物科技有限公司。IPTG为Merck分装,X-gal为BDX分装,PEG-8000为Amersco分装。
噬菌体随机序列的测定由上海生工技术公司完成;免疫组化中使用到的HRP-Anti-M13单克隆抗体购自GE,封闭血清,DAB显色试剂盒,苏木素复染液均购自中杉金桥公司。
其他使用的一些常规试剂和材料可参考《分子克隆:实验室指南》中所列举的,在此不做详细描述。
II.具体实施例
1.噬菌体肽库的扩增、纯化及其滴度测定
A.噬菌体肽库的扩增与纯化
(1)Ph.D.-7TMPhage Display Peptide Library Kit中的ER2738菌在LB-Tet平板上接种划线,倒置平板,37℃培养过夜。
(2)挑取ER2738单克隆菌接种于20ml LB培养基中,37℃振荡培养至对数期。
(3)从Ph.D.-7TMPhage Display Peptide Library Kit中取2ul噬菌体,加入到(2)的培养物中继续培养4.5h。
(4)培养物在4℃条件下,10000rpm离心10min,上清液继续进行同样离心操作。
(5)将上清液的80%转移,在其中加入1/6体积的PEG/NaCl,让噬菌体4℃沉淀过夜。
(6)过夜培养物在4℃条件下,10000rpm离心15min,弃掉上清液,然后重复此操作一次。
(7)沉淀物重悬于1ml TBS中,在4℃条件下,10000rpm离心5min,使残余细胞沉淀。
(8)上清液用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀,并在冰上孵育30min。
(9)在4℃条件下,10000rpm离心10min,弃上清液,重复此操作一次。
(10)沉淀物重悬于200ul TBS,0.02%NaN3中,离心1min,沉淀任何残余的不溶物,上清液 转入新鲜管中,此即扩增后的洗脱物。
B.噬菌体肽库滴度测定
(1)接种ER2738单菌落于5-10ml LB培养基中,摇动培养至对数中期(0D600~0.5)。
(2)细胞生长时,微波炉融化上层琼脂,分成3ml等份于灭菌试管中,保存于45℃水浴中备用。
(3)37℃预温LB/IPTG/Xgal平板,每个噬菌体稀释度取一个平板备用。
(4)将扩增、纯化后的噬菌体进行梯度稀释。
(5)当菌体培养物达对数中期,分成每份200μl等份于微量离心管中,每个噬菌体稀释度一管。
(6)每管加入10μl不同稀释度的噬菌体,快速震荡混匀,室温温育5min。
(7)将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中,每次一管,快速混匀,立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
(8)待平板冷却5min后,倒置,于37℃条件下培养过夜。
(9)检查平板,计算有约102个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位(pfu),即滴度。
2.噬菌体淘选
A.组织芯片预处理
将组织芯片于恒温烘箱中加热,后进行二甲苯脱蜡,分别用无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇及去离子水进行逐级水化;将处理好的组织芯片进行内源化酶的消除,即用3%的H2O2浸泡10min,以降低非特异性染色。组织芯片用柠檬酸缓冲液进行微波热修复后即可进行后续淘选过程。
应理解的是,本具体实施例中才用微波热修复并不限制本发明的使用范围,高压热修复、酶修复法可根据具体实验需要选择。
B.淘选
(1)用免疫组化笔在组织芯片上划定反应区域,加封阻液,4℃过夜。
(2)甩掉组织芯片上的封阻液,用0.05%TBST缓冲液洗6次。每次均旋转以使各个部位均被洗到,甩去TBST缓冲液。
(3)用0.05%TBST缓冲液稀释扩增后的噬菌体至合适滴度,然后取150ul加到组织芯片 NC04-01-001上,室温温和摇动60min。
(4)将组织芯片NC04-01-001上的噬菌体溶液的大部分转移到组织芯片CS04-03-001上,室温温和摇动60min。剩余少量(约1μl)用于测定滴度。
(5)留下组织芯片CS04-03-001上的噬菌体溶液做滴度测定用。然后用0.05%TBST缓冲液洗10次组织芯片CS04-03-001,取第十次的洗液做滴度检测,用于初步判断0.05%TBST洗板效果,即每一轮淘选的特异性,该操作同样适用于组织芯片NC04-01-001。
(6)用150ul非特异性缓冲液0.2M Glycine-HCl(pH2.2),1mg/ml BSA来分离已结合的噬菌体,温和摇动10min,洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用22.5μl 1M Tris-HCl(pH9.1)中和上述洗脱液。此方法适用于同一轮淘选中的组织芯片NC04-01-001和组织芯片CS04-03-001。
(7)按上述常规噬菌体滴度测定方法测定少量(约1μl)洗脱物的滴度。
(8)将剩余洗脱物加入到20ml ER2738培养物中(菌体应当处于对数前期),37℃剧烈摇动培养4.5h。
(9)将培养物转入一离心管中,然后4℃ 10000rpm离心10min。上清液转入另一离心管中,再离心。
(10)将上清的上部80%转入一新鲜管中,加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4℃沉淀过夜。
(11)在4℃条件下10000rpm离心PEG沉淀15min。倒掉上清液,再短暂离心,吸去残留上清液。
(12)沉淀物重悬于1ml TBS中,悬液转入微量离心管中,在4℃条件下离心5min使残余细胞沉淀。
(13)上清液转入另一新鲜微量离心管,用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育30min。在4℃条件下离心10min,弃上清液,再短暂离心,用微量移液器吸去残余上清液。
(14)沉淀物重悬于200μl TBS,0.02%NaN3中。离心1min,沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。
(15)根据上述常规方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物滴度。剩余洗脱物在4℃条件下贮存。
(16)根据计数板上蓝斑数来确定滴度。用这个值来计算相应于初始的噬菌体加入量。
(17)进行第二轮淘选:用第一轮淘选扩增的洗脱物中相当于第一轮初始加入量的噬菌体量重复步骤(1)-(16),在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.1%(w/v)。
(18)在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。
(19)进行第三轮淘选:用第二轮淘选扩增的洗脱物中相当于第一轮初始加入量的噬菌体量 重复步骤(1)-(16),清洗步骤中用0.5%(w/v)的Tween。
(20)在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。第三轮洗脱物不必再扩增,滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用,只要注意平板培养时间不要超过18小时,培养时间过长容易出现缺失。其余洗脱物在4℃条件下贮存。
整个淘选过程采用扣除淘选法,即先用正常组织结合噬菌体溶液,未结合的溶液再用肺鳞癌组织去结合,便能获得肺鳞癌特异性的噬菌体多肽,并采用逐步提高TBST中Tween-20浓度的方法来除去非特异性结合的噬菌体。为了初步判断三轮淘选后所得噬菌体对肺鳞癌是否有特异性结合,我们设置了不同的检测点,检测结果见表1。
表1
如上图所示:A为未与组织芯片NC04-01-001结合的噬菌体;B为未与组织芯片CS04-03-001结合的噬菌体;C为与组织芯片NC04-01-001结合的噬菌体;D为与组织芯片CS04-03-001结合的噬菌体;E为组织芯片NC04-01-001第十次TBST洗脱物;F为组织芯片CS04-03-001第十次TBST洗脱物;
应理解的是,本淘选实验中的淘选次数和淘选压力并不限制本发明的使用范围,可根据具体实验要求进行选择。
3.噬菌斑的纯化与扩增
(1)ER2738过夜培养物按1∶100稀释接种于1ml的LB液体培养基。
(2)用灭菌牙签挑一蓝色噬菌斑到上述1ml培养管中。本步骤中的噬菌斑要从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选,以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。
(3)在37℃条件下摇床培养4.5h。培养物转入微量离心管中,离心30s。上清转入一新鲜离 心管中,再离心。用移液器将80%的上清转入新鲜离心管,此即为扩增噬菌体贮液,在4℃条件下贮存。
4.测序模板的快速纯化
(1)按上述方法进行噬菌斑扩增,取离心后的上清液500μl转入一新鲜离心管。
(2)加200μl PEG/NaCl,颠倒混匀,室温放置10min。
(3)离心10min,弃上清液。然后短暂离心,吸去残余上清液。
(4)沉淀物彻底重悬于100μl碘化物缓冲液中,加入250μl乙醇,室温温育10min。短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。
(5)离心10min,弃上清液。用70%的乙醇洗沉淀,短暂真空干燥。
(6)沉淀重悬于30μl TE中。
5.噬菌体测序
(1)噬菌体随机序列的测定由上海生工技术公司完成。
(2)进行对比后选出共有序列高的噬菌体(序列表为选出的共有序列高的噬菌体的氨基酸序列)。
6.噬菌体单克隆的靶向结合力鉴定
(1)预处理组织芯片,方法实施例2中的组织芯片预处理。
(2)预处理后的组织芯片进行血清封闭,37℃,30min。
(3)3%H2O2消除内源性过氧化物酶,10min,PBS洗。
(4)1∶100稀释的噬菌体单克隆,取适量加到组织芯片CS04-03-002上,4℃过夜。
(5)甩出未结合的噬菌体,PBS洗10min,洗3次。
(6)1∶500稀释的HRP-Anti-M13抗体,100μl,37℃孵育1h,PBS洗10min或5min,洗3次。
(7)DAB显色8~12min,镜下观察,控制染色。
(8)充分水洗,苏木素复染,盐酸乙醇分化。
(9)常规树胶封片。
本发明具体实施方式中使用到的材料和方法,都是作为进一步例证和解释本发明的工具和手段,而并非对本发明的限制。并且,常规的细菌培养等操作是本领域现有技术人员所熟知的。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相 同,此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
机译: 一种基于一种或多种RXRs特异性配体和一种或多种RAR特异性配体的上升混合物的新型组合物,
机译: 孕激素受体同工型特异性配体和组织选择性孕激素受体配体的筛选方法
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