用于被修饰蛋白分离鉴定的电泳分析方法

摘要

一种用于被修饰蛋白分离鉴定的电泳分析方法，其特征是通过以下步骤实现：1）配置凝胶及缓冲液：a）凝胶溶液：6-8M尿素，4-8%的丙烯酰胺，其中丙烯酰胺中Acr：Bis=30-40:1，20mMEDTA，90mM的pH8.4的Tris-硼酸以及AP、双蒸水、TEMED；b）上样缓冲液：35-50%的蔗糖、6-8M尿素、20mMEDTA以及90mM的pH8.4的Tris-硼酸；c）电极缓冲液：25mMEDTA、112.5mM的pH8.4的Tris-硼酸;2）电泳电压100-180V，时间4-6h，凝胶板长度50-200mm，常规冷却，60℃以下；3）凝胶经染色，脱色后成像，对照未修饰蛋白，判断出修饰蛋白的条带，或通过QualityOne软件定量出蛋白被修饰的程度。本发明步骤简单，操作方便，电泳分离效果明显，还可以分析出天然蛋白被修饰的程度。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种通过电泳分离修饰蛋白与天然蛋白的方法。

背景技术

蛋白质翻译后修饰是蛋白鉴定工作中的一个重要方面。翻译后修饰包括磷酸化、糖基化、螯合金属、N端封闭、二硫键的形成等等。蛋白质一级结构可以从基因序列演绎，但翻译后修饰的信息几乎无法仅从基因序列得到。而众所周知的是，这些修饰对于蛋白质的功能乃至细胞的功能都十分重要，也往往与疾病的发生有关。因此，对不同修饰的蛋白质进行分离和鉴定，在蛋白质组，特别是功能蛋白质组的研究中意义重大。

现有的蛋白修饰鉴定最有效的方法是质谱法，质谱法可通过特征离子检测的方法很快确定磷酸化肽，通过串联质谱确定磷酸化位点。通过质谱、蛋白酶解和糖苷酶酶解相结合的方法寻找糖肽，可以鉴定糖基化位点。

现有的蛋白修饰分离的方法有色谱技术和电泳技术。能分离修饰蛋白的蛋白电泳方法包括2D-PAGE、IEF-PAGE。2D-PAGE电泳是二维电泳，大都是指第一向为等电聚焦(等电点信息)，第二向为SDS-PAGE电泳(分子量信息)，是根据样品带电荷和分子量的不同而分离的。IEF-PAGE电泳是一维电泳，不同样品根据其等电点不同可以分离开来。IEF-PAGE电泳可以分离等电点不同的修饰蛋白和天然蛋白，但不能得到这种蛋白的修饰程度信息。另外，利用制备的特异性单克隆抗体也可以分离某些修饰蛋白；使用荧光探针、同位素特异性标记蛋白的修饰部分，可以分析蛋白被修饰的程度。但这些方法都有各自的缺点，成本高、耗时长、污染环境等。

在明确一种蛋白的修饰成分以及修饰位点的前提下，欲将蛋白中的天然蛋白分子和被修饰蛋白分子分离，并确定蛋白的被修饰程度，上述几种方法中，只有2D-PAGE电泳能满足要求。但2D-PAGE是二维电泳，对仪器设备要求高，操作复杂。本发明建立了一种一维电泳方法，即Urea-PAGE蛋白电泳法，实现蛋白中的天然蛋白分子和被修饰蛋白分子的分离，并确定蛋白的被修饰程度。 

尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea-PAGE）是一维电泳，它一直普遍应用于分离单链DNA和RNA，电泳中加入6-8 M Urea，可以使DNA和RNA的二级结构变性。根据分子量的不同分离2-500bp的DNA或RNA。其步骤简单，操作方便，且成本低。

发明内容

本发明建立了针对蛋白中天然蛋白与被修饰蛋白分离的Urea-PAGE蛋白电泳法，提供一种将蛋白中的天然蛋白分子和被修饰蛋白分子进行分离，并根据被修饰蛋白分子所占的比例确定蛋白的被修饰程度的电泳新方法。Urea-PAGE蛋白电泳过程包括配胶、制备凝胶板、上样、电泳、染色、脱色及凝胶成像及结果判读等几个步骤。

本发明所要解决的技术问题通过以下步骤来实现。

1）配置凝胶及缓冲液：a）凝胶溶液：6-8 M尿素，4-8%的丙烯酰胺，其中丙烯酰胺中丙烯酰胺（Acr）：N，N-甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）= 30-40:1，20mM乙二胺四乙酸（EDTA），90mM的 pH8.4的三羟甲基氨基甲烷（Tris）-硼酸以及过硫酸铵（AP）、双蒸水、四甲基乙二胺（TEMED）；b）上样缓冲液：35-50%的蔗糖、6-8M尿素、20mM 乙二胺四乙酸（EDTA）以及90mM的pH8.4的三羟甲基氨基甲烷（Tris）-硼酸；c）电极缓冲液：25mM乙二胺四乙酸（EDTA）、112.5mM的pH8.4的三羟甲基氨基甲烷（Tris）-硼酸。

2)电泳：电泳条件为电压100-180 V，电泳时间4-6小时，凝胶板长度为50-200mm。电泳时采用常规方法冷却，将电泳温度控制在60℃以下。

3)蛋白质分离及修饰的判定：电泳后凝胶经染色，脱色后成像，分析蛋白修饰情况。如果蛋白在SDS-PAGE蛋白电泳中只有一条带，而经此蛋白电泳可分离出两条带，即可判定蛋白有部分被修饰。对照未修饰蛋白，可以判断出修饰蛋白的条带，通过Quality One软件还可以定量出蛋白被修饰的程度。

本发明使用常规的一维蛋白电泳系统，在凝胶中加入Urea使蛋白变性，并通过控制蛋白泳动速率、电泳的时间及电压等因素，将蛋白中的天然蛋白分子和被修饰蛋白分子进行分离。电泳过程中需注意凝胶和上样缓冲液中一定要加Urea使蛋白变性，整个电泳都不能加SDS影响蛋白带电荷量，这是Urea-PAGE蛋白电泳的关键。

本发明建立的Urea-PAGE蛋白电泳法，具有如下优点：步骤简单，操作方便，只需制备一种分离胶就可以将目的蛋白分离；所需试剂都是常规试剂，且使用常规SDS-PAGE电泳仪器就可以进行操作；电泳分离效果明显，电泳结束后，天然蛋白分子和修饰蛋白分子因泳动速率不同，处于不同的泳道位置；通过此蛋白电泳，还可以分析出天然蛋白被修饰的程度。

附图说明

图1为本发明7 M Urea-6% PAGE 电泳分析卵转铁蛋白修饰。泳道1：5μg Apo-OVT，泳道2：5μgHolo-OVT。

图2为本发明6.5 M Urea- 5% PAGE 电泳分析卵转铁蛋白修饰。泳道1-5：无铁OVT 与Fe³⁺ 的比例依次为 1:0、2:1、1:1、1:2、1:5，每孔上样量均为5μg。

具体实施方式

本发明通过以下实施例进一步说明，但本发明并不受其限制。

实施例1。 

铁离子螯合卵转铁蛋白（Holo-OVT）以及无铁卵转铁蛋白（Apo-OVT）的分离。

采用Urea-PAGE蛋白电泳分离铁离子修饰卵转铁蛋白（Holo-OVT）以及无铁卵转铁蛋白（Apo-OVT），它们的分子量约为76KDa，卵转铁蛋白经铁离子修饰后，由于铁离子带正电，中和了蛋白中一部分负电荷，所以铁离子修饰卵转铁蛋白（Holo-OVT）带负电荷比无铁卵转铁蛋白（Apo-OVT）少。

具体实施过程包括如下步骤。

1、配置凝胶及缓冲液。

凝胶溶液中含7M Urea，6%的丙烯酰胺（Acr:Bis = 37.5:1），20mM EDTA ，90mM Tris-硼酸(pH8.4)以及AP、ddH2O、TEMED。

蛋白溶液与上样缓冲液等体积混合后，样品中含50%的蔗糖、7M Urea、20mM EDTA 以及90mM Tris-硼酸(pH8.4)。

电极缓冲液中含25mM EDTA 、112.5mM Tris-硼酸(pH8.4)。

2、上样及电泳：采用Bio-Rad凝胶电泳系统，凝胶板长度为74mm。样品与等体积2×的样品缓冲液混合后离心1min，加入上样孔中。电泳条件为电压150 V，电泳时间4小时。电泳时配备循环冷却水，将电泳温度控制在60℃以下。

3、蛋白质的分离及修饰判定。

电泳结束后，将凝胶放在培养皿中，加入染色液，摇床振荡染色30min，然后用脱色液脱色至蛋白质区条带清晰。最后将凝胶置于凝胶成像系统中成像，根据电泳图分析电泳结果。

泳道1-2的电泳图片如附图1所示。由图中可以看出，Apo-OVT和Holo-OVT泳动速率不同，Holo-OVT比Apo-OVT的泳动速率快一些，该泳道出现两个条带，相距约1-2cm。由此可知，无铁OVT条带是天然的OVT，Fe₂-OVT条带是被铁离子修饰的OVT， Apo-OVT没有螯合铁离子，但holo-OVT并不是100%的螯合两个铁离子。由Quality One软件分析可知，Holo-OVT 有90.8%被铁离子修饰；Apo-OVT都是无铁离子的蛋白分子。

实施例2。 

卵转铁蛋白（OVT）修饰程度的定量分析。

含不同浓度的铁离子的卵转铁蛋白作为被分析的蛋白样品，通过Urea-PAGE蛋白电泳将无铁卵转铁蛋白（OVT）和铁离子修饰卵转铁蛋白（Fe₂-OVT）分离。通过Quality One软件分析Fe₂-OVT占全部卵转铁蛋白的比例，即定量分析卵转铁蛋白的修饰程度。

具体实施过程包括如下步骤。

1、配置凝胶及缓冲液。

凝胶溶液中含6.5M Urea，5%的丙烯酰胺（Acr:Bis = 32.5:1），20mM EDTA ，90mM Tris-硼酸(pH8.4)以及AP、ddH₂O、TEMED。

蛋白溶液与上样缓冲液等体积混合后，样品中含40%的蔗糖、6.5M Urea、20mM EDTA 以及90mM Tris-硼酸(pH8.4)。

电极缓冲液中含25mM EDTA 、112.5mM Tris-硼酸(pH8.4)。

2、上样及电泳：采用Bio-Rad凝胶电泳系统，凝胶板长度为74mm。样品与等体积2×的样品缓冲液混合后离心1min，加入上样孔中。电泳条件为电压125 V，电泳时间5小时。电泳时配备循环冷却水，将电泳温度控制在60℃以下。

3、蛋白质的分离及修饰判定。

电泳结束后，将凝胶放在培养皿中，加入染色液，摇床振荡染色30min，然后用脱色液脱色至蛋白质区条带清晰。最后将凝胶置于凝胶成像系统中成像，根据电泳图分析电泳结果。

泳道1-5的电泳图片如附图2所示。蛋白各条带之间分离的很好，可以明显的看出，随着Fe³⁺的浓度增加，无铁OVT含量逐渐减少，Fe₂-OVT含量逐渐增加。即随着Fe³⁺的增加，铁离子修饰的OVT逐渐增多，但是，由泳道5中两条蛋白带可知，即使加入5倍蛋白量的Fe³⁺与OVT作用，OVT并没有100%的被铁离子修饰。由Quality One软件分析可知，从泳道1-5，被铁离子修饰的OVT 分别占全部OVT的0%、29.8%、82.4%、92%和95.2%。