叶绿素荧光诱导曲线测量中光化光强度的确定方法

摘要

本发明提供一种叶绿素荧光诱导曲线测量中光化光强度的确定方法，包括：获取植物叶片，遮挡环境光，设置多个光强梯度，每个光强梯度照光预定时间后测量实际光合效率和相对电子传递速率；绘制相对电子传递速率随光强变化的响应曲线并对其拟合，获取半饱和光强；以半饱和光强为光化光强度，测量叶绿素荧光诱导曲线；计算光适应后的最大荧光值与实时荧光值的差值和暗适应后的最大荧光值与暗适应后的基础荧光值的差值，并计算上述两差值的比值；判断比值是否处于预定范围，若是，则确定当前光强为光化光强度；若比值小于/大于预定范围的下限/上限，则降低/升高光强后重新测量叶绿素荧光诱导曲线并计算比值。本发明可测出典型的叶绿素荧光诱导曲线。

说明书

技术领域

本发明涉及植物生理技术领域，具体来说，本发明涉及一种叶绿素荧光诱导 曲线测量中光化光强度的确定方法。

背景技术

光合作用是植物生理代谢过程中最重要的化学反应，它利用光能裂解水放出 氧气，同时同化二氧化碳合成葡萄糖，是地球上一切生命活动能够进行的基础。光 合作用的测量和研究一直是植物生理学、植物生态学、农学、林学、园艺学、藻类 生理生态学等领域的热点。

光合作用的测量主要包括气体交换、调制叶绿素荧光、差示吸收和光合放氧 等几种技术。其中调制叶绿素荧光技术被称为光合作用研究的活体探针，它不仅能 反映光能吸收、激发能传递和光化学反应等光合作用的原初反应过程，而且与电子 传递、质子梯度的建立及ATP合成和CO₂固定等过程有关。多数光合作用过程变 化都可通过调制叶绿素荧光反映出来，而其测定不需破碎细胞、不伤害生物体，因 此通过研究叶绿素荧光变化来反映光合作用的变化是一种简便、快捷、可靠的方法， 在国际科研界得到了极为广泛的应用(Papageorgiou GC，Govindjee.Chlorophyll a  Fluorescence：a Signature of Photosynthesis.Dordrecht：Springer；2004.)。

叶绿素荧光诱导曲线是调制叶绿素荧光测量的标准方法之一。1931年德国科 学家Kautsky第一次观察到叶绿素荧光诱导现象，并提出荧光诱导过程与CO₂固定 密切相关(Lichtenthaler HK.The Kautsky effect：60years of chlorophyll fluorescence  induction kinetics.Photosynthetica，1992，27：45-55.)。此后的半个世纪中，科学家 对叶绿素荧光诱导曲线进行了广泛而深入的研究，并逐步形成了光合作用荧光诱导 理论，被广泛用于光合作用研究，但采用的仪器只能在室内完全遮蔽环境光的条件 下测量，极大限制了叶绿素荧光技术的使用。

1983年，德国科学家Schreiber设计出了脉冲-振幅-调制叶绿素荧光仪 (Pulse-Amplitude-Modulation Chlorophyll Fluorometer，简称PAM)(Schreiber U， Bilger W，Schliwa U.Continuous recording of photochemical and non-photochemical  chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynthesis Research，1986，10：51-62.)，并由国际著名的光合作用仪器制造商德 国WALZ公司商业化生产。PAM的发明极大推动了叶绿素荧光技术的普及，从传 统的植物生理学领域迅速扩展到植物生态学、农学、林学、藻类生理生态学、湿地 生态学、遗传育种等领域(林世青，许春辉，张其德，徐黎，毛大璋，匡廷云.叶绿 素荧光动力学在植物抗性生理学、生态学和农业现代化中的应用.植物学通报， 1992，9(1)：1-16；陈贻竹，李晓萍，夏丽，郭俊彦.叶绿素荧光技术在植物环境胁迫 研究中的应用.热带亚热带植物学报，1995，3(4)：79-86；郭玉朋，郑霞，王新宇，曹 孜义.叶绿素荧光技术在筛选光合突变体中的应用.草业学报，2009，18(6)： 226-234；张景平，黄小平.叶绿素荧光技术在海草生态学研究中的应用.海洋环境 科学，2009，28(6)：772-778)。在我国，目前各级科研单位正在使用的PAM系列调 制叶绿素荧光仪已经超过500台。

叶绿素荧光诱导曲线是调制叶绿素荧光测量中最经典的方法，在测量时植物 叶片首先要经过一段时间的暗适应使得光合电子传递链上的所有电子门都处于开 放状态，随后打开一个强度很弱的调制测量光(Measuring Light，ML)用于激发产 生暗适应后的基础荧光Fo，然后打开一个持续时间在0.4-1s的饱和脉冲(Saturation  Pulse，SP)迅速关闭所有的电子门获得暗适应后的最大荧光Fm。延迟约40s等荧 光值降低到Fo附近后，打开一个恒定光强的光化光(Actinic Light)进行光合诱导， 并持续照光几分钟。在光化光打开的同时，每隔30s打开一个饱和脉冲测量光适 应后的最大荧光Fm’。然后关闭光化光，打开远红光(Far-red light，FR)促进累积 在电子门处的电子尽快往光系统I传递，测量出光适应后的最小荧光Fo’。

通过上述叶绿素荧光诱导曲线的测量，可以得出如下参数(韩博平，韩志国， 付翔.藻类光合作用机理与模型.2003.科学出版社.P.57-78；Schreiber U. Pulse-Amplitude-Modulation(PAM)fluorometry and saturation pulse method：an  overview.In：Chlorophyll Fluorescence：a Signature of Photosynthesis.Edited by  Papageorgiou GC，Govindjee，Springer；2004：279-319；Kramer DM，Johnson G，Kiirats  O，Edwards GE.New fluorescence parameters for the determination of QA redox state  and excitation energy fluxes.Photosynthesis Research，2004，79：209-218)：

暗适应后的基础荧光Fo；

暗适应后的最大荧光Fm；

实时荧光F；

光适应后的最大荧光Fm’；

光适应后的最小荧光Fo’；

最大光合效率Fv/Fm＝(Fm-Fo)/Fm；

实际光合效率Y(II)＝(Fm’-F)/Fm’；

相对电子传送速率rETR＝PAR*Y(II)*0.84*0.5；

光化学淬灭qP＝(Fm’-F)/Fv’＝1-(F-Fo’)/(Fm’-Fo’)或 qL＝(Fm’-F)/(Fm’-Fo’)·Fo’/F＝qP·Fo’/F；

非光化学淬灭qN＝(Fv-Fv’)/Fv＝1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo)或 NPQ＝(Fm-Fm’)/Fm’＝Fm/Fm’-1；

调节性能量耗散的量子产量Y(NPQ)＝1-Y(II)-1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1))；

非调节性能量耗散的量子产量Y(NO)＝1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1))等。

这些荧光参数都具有典型的生物学意义，有着非常广泛的应用。例如当植物 的Fv/Fm＞0.8，说明植物处于健康的生理状态；反之则受到胁迫。

此外，设置一系列从低到高的光强梯度并分别照光处理10-30s，然后打开饱 和脉冲测量实际光合效率Y(II)和相对电子传递速率rETR，可以得出rETR随光强 变化的响应曲线，这被称之为快速光曲线(White AJ，Critchley C.Rapid light curves： A new fluorescence method to assess the state of the photosynthetic apparatus. Photosynthesis Research，1999，59：63-72；Ralph PJ，Gademann R.Rapid light curves： A powerful tool to assess photosynthetic activity.Aquatic Botany，2005，82： 222-237.)。对快速光曲线可以利用方程P＝Pm·(1-e^-α·PAR/Pm)·e^-β·PAR/Pm(Plat T，Gallegos  CL，Harrison WG.Photoinhibition of photosynthesis in natural assemblages of marine  phytoplankton.Journal of Marine Research，1980，38：687-701.)进行非线性拟合，其 中P代表光合速率，即相对电子传递速率rETR，Pm代表无光抑制时的最大潜在 相对电子传递速率rETRmax，α代表初始斜率，β是光抑制参数，PAR代表光合有 效辐射强度也就是光照强度。然后可以计算出半饱和光强Ik＝Pm/α。

测量叶绿素荧光诱导曲线时，要求测量光必须足够弱，不足以引起光合作用， 一般强度小于1μmol m^-2s^-1；要求饱和脉冲强度必须足够强，能够在瞬间把所有的 光合电子门全部关掉，高等植物一般大于8000μmol m^-2s^-1，藻类一般大于4000 μmol m^-2s^-1；远红光强度一般按仪器的默认设置即可满足要求。只有光化光强度的 选择，是困扰科研人员的一个难题。文献报道中一般只给出一个光化光强度，但具 体怎么确定的这个光化光强度，这个光化光强度是否合适，则没有指出。如果光化 光强度的选择不合适，则会直接影响到Y(II)、rETR、qP、qL、qN、NPQ、Y(NPQ)、 Y(NO)等参数对设计的科学试验是否具有代表性。例如田间(光强比较高)玉米受 到干旱胁迫后Y(II)会显着降低，但如果采用了较低的光化光强度来测量叶绿素 荧光诱导曲线，则得出的Y(II)下降程度远远低于田间的实际水平，会导致试验结 果没有代表性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种叶绿素荧光诱导曲线测量中光化光强 度的确定方法，为正确测量叶绿素荧光诱导曲线提供合适的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种叶绿素荧光诱导曲线测量中光化光强 度的确定方法，包括步骤：

A.获取需要测试的植物叶片，在遮挡住环境光的情况下，设置多个从低到高 的光强梯度，每个所述光强梯度照光预定时间后分别打开一饱和脉冲，测量所述光 强下的实际光合效率和相对电子传递速率；

B.绘制所述相对电子传递速率随光强变化的响应曲线，并对所述响应曲线进 行非线性拟合，获取半饱和光强；

C.以所述半饱和光强或者接近所述半饱和光强的光强作为光化光强度，按常 规方法测量叶绿素荧光诱导曲线；

D.待所述叶绿素荧光诱导曲线测量结束后，计算光适应后的最大荧光值与实 时荧光值之间的差值和暗适应后的最大荧光值与暗适应后的基础荧光值之间的差 值，并计算上述两差值的比值；

E.判断所述比值是否处于一预定范围内，如果是，则确定当前的光强为所述 光化光强度；如果所述比值小于所述预定范围的下限，则降低所述光强后返回步骤 C；如果所述比值大于所述预定范围的上限，则升高所述光强后返回步骤C；如此 循环，直至所述比值处于所述预定范围内。

优选地，所述植物叶片为活体健康叶片或者其叶柄浸泡在水中的离体健康叶 片。

优选地，所述从低到高的光强梯度为8～20个。

优选地，每个所述光强梯度照光的预定时间为10～30秒。

优选地，测量所述叶绿素荧光诱导曲线的要求包括：

至少最后两个光适应后的最大荧光值基本相同，以证明该光强对光合作用的 诱导达到了一个稳定的状态。

优选地，所述比值的预定范围为0.33～0.66。

更优选地，所述比值为0.5。

优选地，降低或者升高所述光强的幅度为每次1个光强梯度。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)利用本发明的方法确定的光化光强度可以保证对照组样品(健康的植物 叶片)能测量出非常典型的叶绿素荧光诱导曲线，保证整个科学试验的合理设计和 获得有代表性的数据；

(2)本发明的方法实施简单、方便快速、可操作性强；

(3)本发明的方法应用范围广泛，适用于所有的高等植物和藻类的叶绿素荧 光诱导曲线测量。

附图说明

本发明的上述的以及其它的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例 的描述而变得更加明显，其中：

图1为本发明一个实施例的用于确定叶绿素荧光诱导曲线测量中光化光强度 的方法流程图；

图2为本发明一个实施例的绿萝的叶绿素荧光诱导曲线；

图3为本发明一个实施例的酢浆草在不同光化光强度下的叶绿素荧光诱导曲 线；

图4为本发明一个实施例的樟树在不同光化光强度下的叶绿素荧光诱导曲线；

图5为本发明一个实施例的喜旱莲子草在不同光化光强度下的叶绿素荧光诱 导曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，在以下的描述中阐述 了更多的细节以便于充分理解本发明，但是本发明显然能够以多种不同于此描 述地其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下根据 实际应用情况作类似推广、演绎，因此不应以此具体实施例的内容限制本发明 的保护范围。

图1为本发明一个实施例的用于确定叶绿素荧光诱导曲线测量中光化光强度 的方法流程图。如图1所示，该叶绿素荧光诱导曲线测量中光化光强度的确定方法 可以包括步骤：

执行步骤S101，获取需要测试的植物叶片，该植物叶片可以为活体健康叶片 或者叶柄浸泡在水中的离体健康叶片。在遮挡住环境光的情况下，设置例如8～20 个从低到高的光强梯度，每个光强梯度照光10～30秒预定时间后分别打开一饱和脉 冲，测量光强下的实际光合效率Y(II)和相对电子传递速率rETR。

执行步骤S102，绘制相对电子传递速率rETR随光强变化的响应曲线，并对 响应曲线进行非线性拟合，获取半饱和光强Ik。

执行步骤S103，以半饱和光强Ik或者接近半饱和光强Ik的光强作为光化光 强度，按常规方法测量叶绿素荧光诱导曲线。其中，测量叶绿素荧光诱导曲线的要 求包括：至少最后两个光适应后的最大荧光值Fm’基本相同，这表明该光强对光合 作用的诱导达到了一个稳定的状态。

执行步骤S104，待叶绿素荧光诱导曲线测量结束后，计算光适应后的最大荧 光值Fm’与实时荧光值F之间的差值ΔF(ΔF＝Fm’-F)和暗适应后的最大荧光值 Fm与暗适应后的基础荧光值Fo之间的差值Fv(Fv＝Fm-Fo)，并计算上述两差值 的比值ΔF/Fv。

执行步骤S105，判断比值ΔF/Fv是否处于一预定范围内，该预定范围可以设 定为0.33～0.66，以0.5为最佳。如果是，则说明该光化光强度合适，执行步骤S106， 确定当前的光强为光化光强度；如果比值ΔF/Fv小于预定范围的下限，则执行步骤 S107，降低光强(光化光强度)后返回执行步骤S103；如果比值ΔF/Fv大于预定 范围的上限，则执行步骤S108，升高光强(光化光强度)后返回步骤S103。其中， 降低或者升高光强的幅度可以为每次1个光强梯度。当然，如果数值差距比较大， 则本领域技术人员也可以根据实际情况每次降低或者升高多个光强梯度。

如此循环，直至比值ΔF/Fv处于预定范围内，从而确定光化光强度。

本发明的基本原理是：Fm’峰相对于Fm峰的高低反映了吸收的光能用于进行 光化学能量转换的比例高低。Fm’峰值越高，说明吸收的光能用于进行光化学能量 转换的比例越高，反之亦然。ΔF/Fv可以更加直观、定量的描述Fm’相对于Fm的 高低。当ΔF/Fv大于0.66时，说明Fm’峰的高度非常接近于Fm，光合器官可以非 常容易的将吸收的绝大部分光能转化为化学能，说明此时的光化光强度不足以调动 所有光合器官发挥最大能力，科学试验中不同处理(如不同程度的干旱胁迫、热胁 迫等)的差异性难以体现出来，换言之，本来应该观察到的荧光参数的显著差异性 可能因为光化光强度设置过低而没有观察出来或没有显著差异性。当ΔF/Fv小于 0.33时，说明Fm’峰的高度非常低，光合器官只能将很小一部分的光能转化为化学 能，表明光合器官可能受到了光抑制伤害，本来应该处于正常状态的对照组样品已 经受到了光抑制，会造成科学试验的设计不合理，数据没有代表性。

实施例1

图2为本发明一个实施例的绿萝的叶绿素荧光诱导曲线。取健康的活体绿萝 (Scindapsus aureun)(Fv/Fm＞0.8)，用双通道PAM-100测量系统DUAL-PAM-100 (Walz，德国)夹住叶片，用黑布遮住整个叶片。在仪器软件DualPAM v1.9中设 置从低到高的10个光强梯度(9、89、127、211、342、522、696、861、1064和 1323μmol m^-2s^-1)，并设置每个光强梯度的照光时间为20s，然后按常规方法测量 快速光曲线。测量结束后用软件自带的方程P＝Pm·(1-e^-α·PAR/Pm)·e^-β·PAR/Pm进行非线性 拟合，得出半饱和光强Ik＝142μmol m^-2s^-1。选择光强列表中与Ik最接近的光强127 μmol m^-2s^-1作为光化光强度，然后按常规方法测量叶绿素荧光诱导曲线，得出如 图2所示的叶绿素荧光诱导曲线。图2中最后的两个Fm’值基本相同，表明测量结 束时对光合作用的诱导已经达到了稳态。根据图2计算出的ΔF/Fv＝0.62，在 0.33-0.66范围之内，因此127μmol m^-2s^-1对绿萝而言是比较理想的光化光强度。

实施例2

图3为本发明一个实施例的酢浆草在不同光化光强度下的叶绿素荧光诱导曲 线。取健康的红花酢浆草(Oxalis corymbosa DC.)叶片(Fv/Fm＞0.8)，用双通道 PAM-100测量系统DUAL-PAM-100(Walz，德国)夹住叶片，叶柄浸泡在水中， 用黑布遮住整个叶片。在仪器软件DualPAM v1.9中设置从低到高的10个光强梯 度(49、89、127、211、342、522、696、861、1064和1323μmol m^-2s^-1)，并设 置每个光强梯度的照光时间为20s，然后按常规方法测量快速光曲线。测量结束后 用软件自带的方程P＝Pm·(1-e^-α·PAR/Pm)·e^-β·PAR/Pm进行非线性拟合，得出半饱和光强 Ik＝263μmol m^-2s^-1。分别选择光强列表中远低于Ik的光强127μmol m^-2s^-1，较接 近Ik的光强211μmol m^-2s^-1，高于Ik的光强342μmol m^-2s^-1和远高于Ik的光强 522μmol m^-2s^-1做为光化光强度进行叶绿素荧光诱导曲线测量，得出的结果分别如 图3A-图3D所示。当光化光强度为127μmol m^-2s^-1时，诱导曲线的ΔF/Fv＝0.79(图 3A)，ΔF/Fv大于0.66，说明光化光强度过低；当光化光强度为211μmol m^-2s^-1时，诱导曲线的ΔF/Fv＝0.46(图3B)，在0.33-0.66范围之内，是比较理想的光化 光强度；当光化光强度为342μmol m^-2s^-1时，诱导曲线的ΔF/Fv＝0.31(图3C)， 接近于0.33，光化光强度略偏高；当光化光强度为522μmol m^-2s^-1时，诱导曲线 的ΔF/Fv＝0.10(图3D)，ΔF/Fv远小于0.33，说明光化光强度过高，已造成光抑 制。通过上述比较，可以明显看出不同的光化光强度会导致叶绿素荧光诱导曲线的 显著不同，只有当满足ΔF/Fv在0.33-0.66之间时的光强(本实施例中为211μmol m^-2s^-1)才适合做为光化光强度。

实施例3

图4为本发明一个实施例的樟树在不同光化光强度下的叶绿素荧光诱导曲线。 取健康的樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl.)叶片(Fv/Fm＞0.8)，用便携式 调制叶绿素荧光仪MINI-PAM(Walz，德国)的叶夹2030-B夹住叶片，叶柄浸泡 在水中，用黑布遮住整个叶片。在MINI-PAM软件WinControl v3.18中设置从低 到高的8个光强梯度(116、207、312、427、620、816、1143和1504μmol m^-2s^-1)， 并设置每个光强梯度的照光时间为20s，然后按常规方法测量快速光曲线。测量结 束后用软件自带的方程P＝Pm·(1-e^-α·PAR/Pm)·e^-β·PAR/Pm进行非线性拟合，得出半饱和光 强Ik＝286μmol m^-2s^-1。用光强列表中最接近于Ik的光强312μmol m^-2s^-1作为光化 光强度测量出叶绿素荧光诱导曲线(图4A)，其中ΔF/Fv＝0.27，小于0.33说明光 强过高。选择低一档的光强207μmol m^-2s^-1作为光化光强度测量出叶绿素荧光诱 导曲线(图4B)，其中ΔF/Fv＝0.44，在0.33-0.66之间，说明207μmol m^-2s^-1是樟 树叶片比较理想的光化光强度。

实施例4

图5为本发明一个实施例的喜旱莲子草在不同光化光强度下的叶绿素荧光诱 导曲线。取健康的喜旱莲子草(Alternanthera philoxeroides(Mart.)Griseb.)叶片 (Fv/Fm＞0.8)，用便携式调制叶绿素荧光仪MINI-PAM(Walz，德国)的叶夹2030-B 夹住叶片，叶柄浸泡在水中，用黑布遮住整个叶片。在MINI-PAM软件WinControl v3.18中设置从低到高的8个光强梯度(160、230、345、481、724、991、1510和 2166μmol m^-2s^-1)，并设置每个光强梯度的照光时间为20s，然后按常规方法测量 快速光曲线。测量结束后用软件自带的方程P＝Pm·(1-e^-α·PAR/Pm)·e^-β·PAR/Pm进行非线性 拟合，得出半饱和光强Ik＝447μmol m^-2s^-1。用光强列表中最接近于Ik的光强481 μmol m^-2s^-1和345μmol m^-2s^-1分别作为光化光强度测量出叶绿素荧光诱导曲线(图 4)。当光化光强度为481μmol m^-2s^-1时，ΔF/Fv＝0.41(图5A)；当光化光强度为 345μmol m^-2s^-1时，ΔF/Fv＝0.54(图5B)。无论采用481μmol m^-2s^-1或345μmol m^-2s^-1作为光化光强度，得出的ΔF/Fv都在0.33-0.66之间，说明他们都是比较理想的 光化光强度，这从侧面说明了喜旱莲子草在较大光强范围内都能进行理想的光合作 用，可能是其生物入侵的机理之一。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)利用本发明的方法确定的光化光强度可以保证对照组样品(健康的植物 叶片)能测量出非常典型的叶绿素荧光诱导曲线，保证整个科学试验的合理设计和 获得有代表性的数据；

(2)本发明的方法实施简单、方便快速、可操作性强；

(3)本发明的方法应用范围广泛，适用于所有的高等植物和藻类的叶绿素荧 光诱导曲线测量。

本发明虽然以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本 领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做出可能的变动和修 改。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上 实施例所作的任何修改、等同变化及修饰，均落入本发明权利要求所界定的保 护范围之内。