马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法

摘要

本发明涉及一种马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法，本发明的检测方法能够对样品进行快速检测，从样品处理到出结果仅需4小时左右；由于采用了接近生物反应体系的液相芯片系统和特异性的探针，使该方法可与荧光定量PCR相媲美。本发明设计的引物与常见马属动物其他病毒不发生交叉反应，由于采用了液相反应体系，使该方法的特异性高于传统检测方法，大大杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果。本发明的方法提供了优化的操作程序，操作简单，具有良好重复性。

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒检测技术领域，具体涉及一种马动脉炎病毒的液相芯 片检测引物及检测方法。

背景技术

马病毒性动脉炎(Equine Viral Ateritis，EVA)是一种由马病动脉炎病毒 (Equine Ateritis Virus，EAV)引起，在马属动物之间通过呼吸道或生殖器官传 播的传染病。马匹感染EAV后大部分呈亚临床感染，一部分成年马的流感样症 状、怀孕母马发生流产，新生马驹发生间质性肺炎。约有30％-60％种公马感染 EAV后持续带毒，精液中的病毒可传播给雌马，引起EAV的传播。该病在临疹 上表现为发热、白细胞减少，常伴有眼睑水肿和四肢浮肿，其特征性病理变化 为小动脉内膜变性和坏死。

本病主要以美洲和欧洲为中心呈世界性分布，以小规模或中等规模的流行形 式反复发生。澳大利亚虽然没有临床症状发生，但是通过对保存血清的检查表 明，1975年澳大利亚就有EAV抗体阳性马。对1989-1992年收集的马血清检查 结果表明，南非也有抗体阳性马。1996年日本发现EAV抗体阳性的赛马。1996 年我国出口韩国的马匹中也发现了EAV抗体阳性马，但至今没有从马匹中分离 到EAV。

近年来，由于赛马业的发展和国外对食用马的需求，进出口马病的检测量不 断增加。国内外研究者开发了多项马病快速检测诊断方法，如山东检验检疫局 马病实验室研究的ELISA、PCR检测马鼻肺炎和马动脉炎，固相基因芯片技术 检测五种马病等这些方法基本上实现了快速检测的需要。但是有些病还没有成 熟的检测技术及试剂，如锥虫病、焦虫病等还需要用进口检测试剂。进口试剂 和试剂盒特别昂贵，且使用时必须提前2个月左右定货，会严重影响检测进程。 此外，现有的快速检测方法中，ELISA、PCR等技术通量小，费时费力；固相 芯片技术可以实现高通量检测，但成本特别昂贵，无法在马病检测中应用。迫 切需要一种高通量、低成本、快速特异、灵敏可靠检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法，即一 种操作简单、结果准确的马动脉炎病毒液相芯片检测方法，及其所用到的引物， 从而弥补现有技术的不足。

本发明为实现上述目的，采用液相芯片技术。该技术是在核酸水平上的一 种检测技术，具有准确性好、灵敏度高的特点。其原理是将编码微球单个逐一 通过检测通道时受到双色激光(如红色和绿色)同时照射，第一束激光激发微 球的分类荧光，根据荧光编码确定微球的类别，即微球内部的两种荧光物质受 激发后可发射两种不同波长的荧光，不同类别微球内这两种荧光物质比例不同， 则荧光强度比例也不同，从而将不同的特异性反应区分开来；第二束激光激发 报告分子上的荧光素，根据荧光强度确定微球上结合的报告分子的数量从而确 定目标分子的数量(定量)。系统只记录与红色荧光同时出现的绿色荧光信号， 不记录未结合的报告分子荧光信号，因此检测前无需洗脱未结合的报告分子。 此外，利用流式细胞术中90℃角散射光可有效地消除微球聚集对结果造成的影 响。各种荧光信号经分析软件进行数字化处理，可获得检测物的种类和数量。

本发明中所涉及到的引物和探针序列如下：

正向引物dirct primer：5-CAACGGGTACACCGCAGTTGGT-3` SEQ ID NO：1

反向引物reverse pr imer：5-CGGACCCGCATCTGACCAAACA-3`SEQ ID NO：2

探针Probe：5`-CGGCGGCGACAGCCTACA-3`SEQ ID NO：3。

正向引物和反向引物5’端进行生物素标记；探针的5’端进行氨基化修饰。

本发明的引物和探针用于检测马动脉炎病毒，其检测方法包括有：1)检测 样品RNA的提取、2)RT-PCR扩增目的片段、3)寡核苷酸探针与微球共价偶联、 4)探针与RT-PCR扩增片段杂交和5)液相芯片仪分析步骤。

其中步骤2)RT-PCR反应的循环条件为：

第一阶段，反转录50℃：30min；

第二阶段，预变性94℃：3min；

第三阶段，扩增94℃：30s，59℃：30s，72℃：30s，30个循环；

第四阶段，延伸72℃：5min。

本发明的检测方法能够对样品进行快速检测，从样品处理到出结果仅需4小 时左右；由于采用了接近生物反应体系的液相芯片系统和特异性的探针，使该 方法可与荧光定量PCR相媲美。本发明设计的引物与常见马属动物其他病毒不发 生交叉反应，由于采用了液相反应体系，使该方法的特异性高于传统检测方法， 大大杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果。本发明的方法提供了优化的操作 程序，操作简单，具有良好重复性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细描述。

本发明所用到的仪器耗材信息如下：表面羧基化的荧光编码微球、鞘液购 置于BD公司，TMAC temtrameihyl-ammdnium chloride、Tris、SD S(10％sol μtion) 购置于美国Sigma公司，SPAE Streptavidin-R-phycoerythrin购于美国Prozyme 公司，RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒购于大连宝生物公司。主要设备包括： BD FACSArray液相芯片仪、梯度PCR扩增仪、凝胶成像系统、Sigma高速冷冻 离心机等。

通过Internet登陆美国国立生物信息技术中心(NCBI)，查询检索已公布的 马动脉炎病毒基因序列。利用Primer Premier5.0软件设计引物和探针，并最终筛 选出一对具有高特异性的引物和探针，参见表1。

表1设计的引物和预期目的片段大小

注：5’-Biotin表示5’端进行生物素标记；5`-NH2表示5’端进行氨基化修饰。

本发明的检测方法如下：

1、检测样品RNA的提取

采用大连宝生物公司的RNA提取试剂盒提取样品RNA，按照说明书的步 骤进行操作，提取的样品电泳检测提取质量。

2、RT-PCR扩增目的片段

采用RNA提取试剂盒(大连宝生物公司)进行EAV RNA的提取。在0.2mL PCR反应管中，依次加入10×RT-PCR bμffer，2.5μL、、dNTP(各2.5mmol/L)， 2.0μL、10pmol/μL引物对，各1μL、Inhibiter 0.5μL、AMV XL 0.5μL、AMV Taq(5 M/μL)，0.25μL、25mmol/L MgCl₂，5.0μL、RNA模板5.0μL，加入双蒸水7.25 μL使反应体积达到25μL。在PCR仪(Eppendorf Mastercycler Gradient)上进 行RT-PCR扩增。优化并确定RT-PCR工作程序：50℃30min；94℃2min；然 后94℃30sec、59℃30sec、72℃30sec，30个循环；最后72℃延伸5min，4 ℃保温。

扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶图像分析系统(Alphamager ^TM2200)上观察、分析扩增产物。

3、寡核苷酸探针与微球共价偶联

1)将微球漩涡混合20s充分分散；取3×10⁶个微球(75μl)，于1.5ml离 心管中10000g离心1min，去上清；

2)加入50μl 0.1mol/L甲基咪唑溶液(ph4.5)，漩涡混合，超声波处理 (30s-imin)；

3)加入氨基化探针1.0nmol，漩涡混合；

4)加入2.5μL碳二亚胺溶液(10mg的碳二亚胺粉末加入1.0mL的灭菌纯 水，现用现配)充分混匀，室温避光孵育30min。

5)重复4)一次。

6)加入1.0ml 0.02％Tween-20，混匀，10000g离心1min，弃上清；

7)加入1.0ml 0.1％SDS，混匀，10000g离心1min，弃上清；

8)0.1mol/L甲基咪唑溶液(ph4.5)100μL重悬微球，2-8℃避光保存待用。

4、探针与RT-PCR扩增片段杂交

杂交体系包换1.5μL探针偶联微球，33μL 1.5×TMAC杂交液，14.5μL TE，2.5μL RT-PCR产物。混合均匀后于98℃变性10min，在选定温度下孵育 15min，18000g离心2min去上清；加入50μL用1×TMAC杂交液稀释的PE 标记的链亲合素(1∶500)，选定温度下孵育10min，18000g离心2min去上清； 加入50μL 1×TMAC杂交液，漩涡混合使微球重悬，上BD FACSArray液相 芯片仪对杂交后的微球进行分析。

杂交温度的优化，杂交反应时间在15min条件下，根据探针的Tm值，选 48℃、50℃、52℃、54℃、56℃等5个温度梯度为研究对象，考察不同杂交温 度下液相芯片的检测效果。

5、液相芯片仪分析步骤

利用BD FACSArray液相芯片仪对杂交微球进行分析，参与计数的荧光编码 微球均≥100个，表明用于计数的荧光编码微球数量有效，所产生的MFI值可 信，各个荧光编码微球的空白对照MFI均＜500，表明结果有效，试验可以进行 结果判定。

液相芯片定性比值结果(LQRR)等于样品校正后的MFI值(MFIS)与空白对 照MFI平均值(MFIB)的比值，即LQRR＝MFIS/MFIB。如果LQRR≥3，判定 为阳性样本；如果2≤LQRR＜3，则判定为可疑；如果LQRR＜2，则判定为阴性。

实施例1本发明的马动脉炎病毒液相芯片引物探针和检测方法的特异性分析

1、材料为马动脉炎病毒(EAV)、马鼻肺炎病毒(EHV)、马流感病毒H3N8 亚型、马流感病毒H7N7亚型和马焦虫；其中马动脉炎病毒作为阳性检测样品。

2、马动脉炎病毒液相芯片检测方法的特异性试验

利用本研究建立的液相芯片检测马动脉炎病毒的方法，提取马动脉炎病毒、 马鼻肺炎病毒、马流感病毒H3N8亚型、马流感病毒H7N7亚型和马焦虫等的 RNA或DNA，并进行扩增。将RT-PCR产物或PCR产物，用液相芯片检测体 系进行检测。判断整个液相芯片检测体系对非目标物有无检测信号。

3、结果

分别以马动脉炎病毒(EAV)、马鼻肺炎病毒(EHV)、马流感病毒H3N8亚 型(H3N8)、马流感病毒H7N7亚型(H7N7)和马焦虫等的RT-PCR产物或PCR产 物模板，进行液相芯片检测。结果(见表2)表明，对阳性样品马动脉炎病毒 EAV的检测结果为阳性，而对非目标物扩增产物的检测值均为阴性，表明本发 明的引物和探针在检测的时候不会产生假阳性或假阴性。

表2液相芯片检测体系特异性验证

实施例2、本发明的马动脉炎病毒液相芯片检测方法的灵敏性试验

1、材料选用马动脉炎病毒EAV。

2、马动脉炎病毒液相芯片检测方法的灵敏性试验

将EAV RT-PCR产物进行10倍系列稀释，得到10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、 10³、10²、10等不同拷贝数的稀释液，用已经建立的液相芯片检测体系进行检测， 用于考察整个检测体系的灵敏度。

3、结果

将EAV RT-PCR产物进行10倍系列稀释，得到10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、 10³、10²、10等不同拷贝数的稀释液，用已经建立的液相芯片检测体系进行检测， 灵敏度检测结果如表3，检测EAV RT-PCR产物的灵敏度为10⁵个拷贝，已完全 能够满足实际检测上的需求。

表3液相芯片检测体系灵敏度验证

为了更好的验证本发明的引物、探针的实际应用效果，本发明用马动脉炎病 毒感染过的样品和用ELISA方法检测确定没有被马动脉炎病毒感染过的样品同 时进行检测。检测结果表明，被感染的样品检测结果为阳性，而没有被马动脉 炎病毒感染过的样品为阴性，从而证明本发明的方法能够有效的检测出待检样 品是否存在马动脉炎病毒。