一种重组人促肾上腺皮质激素释放因子的制备方法

摘要

本发明涉及一种重组人促肾上腺皮质激素释放因子的生产方法，通过人工合成人促肾上腺皮质激素释放因子成熟肽的基因序列，将其构建入带有硫氧还蛋白标签的大肠杆菌表达载体，目的基因与硫氧还蛋白基因3’端融合，中间部分含联接肽和肠激酶识别位点，并将该表达载体转化适宜的大肠杆菌获得基因工程菌。该工程菌通过优化的高密度发酵和纯化工艺，制备出Trx-CRF融合蛋白，再经肠激酶切割，分离纯化后获得的重人促肾上腺皮质激素释放因子纯度高、活性好、生产成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种利用基因重组技术制备人促肾上腺皮质激素释放因子的生物活性多肽的方法。

背景技术

脑水肿是颅内肿瘤及其治疗过程中的严重并发症，也常发生与其他各类颅脑疾病以及损伤，是导致脑功能障碍的主要原因之一。许多病理过程如缺氧，创伤，梗死，炎症中毒等均可以伴发脑水肿。可引起一系列生理和心理症状，如癫痫，肌肉虚弱，缺乏协调性以及复视等。我国脑肿瘤死亡率在恶性肿瘤中排第7位，且有逐年上升的趋势，其中原发脑肿瘤发病率为1/10000，男性多于女性。而儿童脑瘤发病率近年来不断上升，目前已成为仅次于白血病的儿童第二大肿瘤，发病率占儿童所有肿瘤的22%。而其他恶性肿瘤最终会有20-30%转入颅内，严重危害人民的健康。

现在临床上治疗肿瘤血管源性脑水肿的药物主要有脱水剂，利尿剂和糖皮质激素，在一定程度上能减轻脑水肿，但均有不同程度副作用。前两者多发于肾功能损害及电解质紊乱，如甘露醇有反弹现象，且具有肾毒作用，不宜长期使用。大剂量皮质激素，效果显著，但产生的副作用很大，可导致患者激素水平紊乱，病情加重，糖尿病，骨质疏松，身体抵抗力下降，影响小儿发育等，因此急需寻找替代激素的药物。

人促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin releasing factor，CRF)是一种下丘脑中的激素，其在生物体内调节垂体腺中促肾上腺皮质激素的释放。研究发现CRF是介导脑水肿物质的抑制剂，具有很强的抗水肿作用，能够减轻血管源性脑水肿，可以替代肾上腺皮质激素，既可以取得实质性的疗效，又可以避免长期使用皮质激素的副作用。CRF直接作用于肿瘤微血管结构，修复血脑屏障链接，上调血脑屏障特异蛋白的表达，研究证明可作为脑水肿治疗中类固醇激素的替代品，避免长期大剂量使用激素引起的副反应(Tjuvajev et al.,Cancer res，1996，56：1352)。CRF既可以取得实质性疗效，又可以避免长期使用皮质激素的副作用。

目前，由Neurobiological Tech开发的名为XERECEPT化学合成CRF已经上市，其在治疗和降低水肿，改善神经症状，临床安全等方面效果良好，主要是由化学合成 ，成本较高，且受技术原因影响，大规模生产难度大。因此，迫切需要开发出一种新的制备这种药物的方法。

利用基因工程技术，以微生物为载体，生产外源蛋白具有广阔的应用前景。上海博德基因开发有限公司(中国专利CN01112728.7、CN00136349.2、CN00116452.X、CN00111619.3、CN00111617.7、CN99125755.3)公布了促肾上腺皮质激素释放因子12.87、促肾上腺皮质激素释放因子8.8、促肾上腺皮质激素释放因子10、促肾上腺皮质激素释放因子23和促肾上腺皮质激素释放因子26，以及其重组表达方法。

短的生物活性肽的重组表达工艺是一个难题，一般需要借助融合表达伴侣，用特异的蛋白内切酶切开融合标签。但在实际操作中，融合蛋白分子比要表达的短肽大很多，会形成空间位阻，往往造成蛋白内切酶切割效率低下，或者根本切不开。

发明内容

本发明提供一种重组人促肾上腺皮质激素释放因子的制备方法，该方法制备的重组人促肾上腺皮质激素释放因子具有高表达量和得率，蛋白内切酶切割率高，有生产成本低的优点。

本发明所述人促肾上腺皮质激素释放因子的制备方法，有以下步骤：

1）根据人CRF氨基酸序列设计并合成人促肾上腺皮质激素释放因子基因；

2）步骤1）所得基因通过联接肽、肠激酶识别位点与适宜载体上的硫氧还蛋白(Thioredoxin；Trx)Trx蛋白融合，得到表达载体pET32-CRF；

3）步骤2）所得的表达载体pET32-CRF转化到适宜的大肠杆菌BL21(DE3)获得重组人促肾上腺皮质激素释放因子工程菌PET32-CRF/BL21(DE3)；

4）步骤3）得到的重组人促肾上腺皮质激素释放因子工程菌PET32-CRF/BL21(DE3)经发酵、纯化步骤，制备出Trx-CRF融合蛋白；

5）步骤4）得到的Trx-CRF融合蛋白经肠激酶切割后，分离纯化获得重组人促肾上腺皮质激素释放因子(rhCRF)。

步骤2）所述表达载体的构建方式为：-Trx-联接肽-DDDDK-CRF-，其中-DDDDK-为肠激酶识别位点，D为天冬氨酸，K为赖氨酸。

肠激酶识别位点的N端引入结构为-(GGGGS)n-的柔性连接肽，其中G为甘氨酸，S为丝氨酸，n为0-10。本发明优选n为3。

人促肾上腺皮质激素释放基因的N端序列为SEEPPI-，其中S为丝氨酸，E为谷氨酸，P为脯氨酸，I为异亮氨酸。

步骤5）所述的重组人促肾上腺皮质激素释放因子的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

步骤5）所述的重组人促肾上腺皮质激素释放因子的对应编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

步骤4）所述发酵是将重组人促肾上腺皮质激素释放因子工程菌PET32-CRF/BL21(DE3)接种到发酵罐中进行高密度发酵培养，通过加入IPTG诱导融合蛋白的表达。

步骤4）所述纯化的步骤包括离心收集菌体，破菌、离心收集破菌液上清，将收集上清上Chelating Sepharose Fast Flow螯合层析，洗去杂蛋白，洗脱目的融合蛋白。

步骤5）所述分离纯化是将酶切后的产物上Chelating Sepharose Fast Flow螯合层析，去杂蛋白，洗脱目的蛋白。

上述步骤1）中的人工合成CRF基因是现有技术，可以通过现有技术获得，如人工合成的方法。

步骤2）中所述Trx蛋白基因是商业化载体自带基因序列，其中Trx与CRF之间通过Trx-(GGGGS)n-DDDDK-CRF方式连接。

本发明优选的CRF编码DNA序列为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。

本发明的rhCRF氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示序列。

本发明的制备方法，其特征在于，其中所述发酵是将满足要求的重组人促肾上腺皮质激素释放因子工程菌接种到发酵罐中进行高密度发酵培养，通过加入IPTG诱导融合蛋白的表达，所得rhCRF纯度达到95%以上。

本发明根据已经发表的人促肾上腺皮质激素释放因子成熟肽氨基酸编码序列(该序列可根据遗传密码的通用性、简并性和大肠杆菌对遗传密码使用的偏好性原则进行同义突变)，人工合成基因序列。本发明的主要特点在于，将该基因克隆入适宜表达载体(商业化载体，优选如：pET-32a-c(+))中构建重组表达质粒，然后将重组质粒转化适宜的大肠杆菌，优选如商业化菌株：BL21(DE3)，经筛选得到的具有高表达能力的基因工程菌。该工程菌以Trx为融合伴侣，融合表达形成Trx-CRF融合蛋白，所表达的蛋白经过适宜的步骤分离纯化后，用适宜的具有特异序列识别能力的蛋白酶(如肠激酶)将CRF从融合蛋白上切割下来，经精纯化，得到rhCRF纯品。经过N-末端测序、质谱分子量测定、等电点测定、肽图分析以及生物活性测定等分析，结果表明本发明制备工艺获得的rhCRF与天然的人促肾上腺皮质激素释放因子完全一致。

本发明所述制备方法，融合表达时，在蛋白内切酶识别位点前引入柔性联接肽，解决了蛋白内切酶切割效率低的问题，极大提高回收率，并降低生产成本。该制备方法重组人促肾上腺皮质激素释放因子纯度高、活性好、生产成本低，可大规模工业化生产CRF。

本发明的优点主要表现在：

(1)本发明中Trx-CRF融合蛋白以可溶的形式存在，通过肠激酶切割，大大提高表达量和得率；

(2)在肠激酶识别位点的N端引入柔性连接肽-(GGGGS)n-，解决了切割效率低的问题，极大提高回收率，并降低生产成本；

(3)通过本发明方法制得的rhCRF，经国家生物医药分析中心检测，其理化特性和生物活性与人促肾上腺皮质激素释放因子完全一致，N端序列与天然人促肾上腺皮质激素释放因子一致，避免通常大肠杆菌表达重组蛋白药物N端多出一个Met甚至多个氨基酸残基，从而降低其免疫原性，提高了其成药性。

本发明使用的试剂为市场销售的医用试剂；表达载体、宿主菌均为可以从市场上购买的商业化载体或菌株。

以上方法的具体操作步骤可以见本发明的实施例。

附图说明

图1 为pET32-CRF重组表达质粒构建示意图。

图2为rhCRF纯化后的SDS-PAGE电泳图。泳道1为蛋白Marker；泳道2为Trx-CRF融合蛋白纯化后样品；泳道3、4为Trx-CRF融合蛋白经肠激酶酶切后样品；泳道5为rhCRF纯化后样品。

图3为rhCRF纯化后样品的HPLC分析图谱，目的蛋白峰保留时间为26.064min；纯度97%。

图 4为rhCRF样品N端测序结果。4-1：N端测序检测报告；4-2：N端1-7氨基酸残基图谱；4-3：N端8-15氨基酸残基图谱。

图5为质谱测定图谱。

具体实施方式

实施例1  表达rhCRF工程菌的构建

1. CRF基因设计和合成

根据GenBnak中登录的人CRF氨基酸序列(登录号：CAA23834.1)，选取成熟肽41个氨基酸基因编码序列，并兼顾在大肠杆菌中密码子偏好性和基因序列优化进行同义突变。并在基因5’端依次连接肠激酶识别序列(DDDDK)、联接肽(GGGGSGGGGSGGGGS)对应的核酸编码序列，同时在全部序列的5’端引入KpnI识别序列GATTCC，3’端引入NotI识别序列GCGGCCGC。将设计好的基因序列进行全基因合成(上海生工完成)。

2. pET32-CRF/BL21(DE3)工程菌构建

2.1 表达载体pET32-CRF构建

将合成基因序列，用KpnI/NotI双酶切，同时将PET-32a-c(+)载体用KpnI/NotI双酶切。在1×TAE配制的1.2%琼脂糖凝胶上电泳，目标带分离较好时，用刀片将目标带所在的胶块切下，尽量切去多余的胶，放在干净的1.5 ml eppendorf 管中。用凝胶回收试剂盒回收纯化基因及载体。

将切胶回收的经过KpnI/NotI双酶切的基因及载体，用T4 DNA连接酶16^oC连接过夜。连接产物转化DH5α感受态，筛选转化菌株，并进行测序验证，构建得到表达载体pET32-CRF，具体结构见图1，保存于DH5α菌株中，命名为：PET32-CRF/DH5α。

2.2工程菌pET32-CRF/BL21(DE3)的构建

(1)BL21(DE3)感受态细胞制备

采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，其方法如下：

挑取BL21(DE3)单菌落于25ml LB液体培养基中，37 ^oC，250 r/min过夜培养；第二天取1ml过夜培养液接种于100ml LB中，37^oC，250 r/min培养至OD600为0.375左右，约2.5 小时；将培养液分装到预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上放置5-10 分钟，然后于4 ^oC，2000 r/min离心7 分钟；弃上清，用10ml冰冷的CaCl₂溶液重悬菌体沉淀，4 ^oC，1600 r/min离心5 分钟；弃上清，用10ml冰冷的CaCl₂溶液重悬菌体沉淀，冰上放置过夜，让菌体自然沉降备用。

(2)表达质粒制备

接种pET32-CRF/DH5α菌株到20mlLB液体(含氨苄青霉素100ug/mL)，37^oC，250rpm培养过夜。收集3mL菌体，用质粒纯化试剂盒制备质粒，并送部分质粒测序验证与设计序列一致。

(3) 工程菌转化及筛选

将制备的BL21(DE3)感受态细胞，次日用移液器将大部分上清去掉，剩下约1 ml溶液，轻轻混匀，取100 μl新鲜制备的感受态细胞到1.5 ml离心管中，加入1 μl上述制备的表达质粒，轻混匀，冰上放置30 分钟。然后在42℃水浴中热休克90 秒，立即放于冰上2 分钟，加入800 μl室温液体LB培养基于37℃150r/min培养1.5小时。取50-200μl菌液涂布LB平板(含氨苄青霉素100ug/mL), 37℃培养16-20小时h。挑取单菌落PCR验证，构建得到大肠杆菌表达工程菌PET32-CRF/BL21(DE3)。通过摇瓶筛选高表达量菌株最为最终发酵用工程菌。

实施例2  工程菌pET32-CRF/BL21(DE3)的发酵

将培养过夜的种子液，接种到发酵罐适宜的培养基(如LB、TB或其它适宜培养基)中培养，细菌培养至OD₆₀₀为25左右，加如IPTG诱导3-4小时。离心收集菌体，将菌体悬浮在适宜的缓冲液中(25mm Tris-HCl，150 mmNaCl，PH8.0)，高压匀浆破菌，将破碎液离心，收集上清液，弃沉淀。

实施例3   rhCRF纯化

将此破菌液上清上样于经0.2M NiSO4处理并以20mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)螯合层析介质，以100mM 咪唑(含20mM Tris-HCl，pH8.0)洗脱；收集的目的融合蛋白经脱盐处理，按每1mg融合蛋白加入0.5U肠激酶(50mM Tris-HCl, 2mM CaCl2, 0.1% Tween-20，pH8.0)在4℃条件下酶切融合蛋白约16h。

酶切目的蛋白上样于Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow，目的蛋白和融合标签同时挂柱。但目的蛋白挂柱结合力低，用低浓度咪唑(50mM)洗脱目的蛋白，收集洗脱蛋白峰。SDS-PAGE检测分子量约4700Da，纯度大于95%，HPLC分析纯度大于97%，见图2、图3。

实施例4  rhCRF结构确证

(1)N末端15个氨基酸序列测定

   将上述方法制备得到的rhCRF，进行N末端氨基酸序列测定，测定结果如下：N -Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-C，经国家生物医药分析中心检测与预期结果完全一致，见图4-1至图4-3。

(2)质谱测定

上述方法制备得到的rhCRF测定分子量为4757.7，经国家生物医药分析中心检测与理论预测一致，见图5。

实施例5  rhCRF生物活性测定

CRF(促肾上腺皮质激素释放因子)具有调节体内垂体细胞分泌ACTH(促肾上腺皮质激素)的功能，ACTH的量反应了CRF的活性高低。

(1)组织分离：老鼠垂体细胞切除。

(2)组织消化：组织块细胞分离采用剪切与消化相结合的方法。将切下来的老鼠垂体剪切成较小的碎片，将垂体细胞溶于适当体积的D-Hanks缓冲液中，其中含0.5％(w/v)胶原酶(Type II)和0.5(w/v)BSA，于45℃下放置处理45min。

(3)收集消化液：用滤网(100目过滤网)过滤去除大的及未充分消化的组织碎片，收集到的细胞悬液经Hanks缓冲液充分洗涤三次。

(4)细胞培养：在收集到的细胞悬液中加入DMEM培养液(含10％胎牛血清，20nM HEPES，50μg/ml青霉素，50μg/ml链霉素，6μg/ml枯草杆菌抗生素)，置于95％空气加5％二氧化碳混合气体中培养4－5天。收集到的细胞用不含血清的DMEM培养液洗涤，然后加入测试样品或标准品培养2h，-20℃保存待ACTH含量测定。

(5)ACTH含量的测定：采用大鼠细胞培养上清中ACTH浓度测定的ELISA试剂盒进行定量检测，具体过程参照试剂盒描述方法进行。

结果：以天然CRF对照品(Bachem)作为参照，制备的rhCRF生物活性与对照品相当。

序列表

 

<110>  重庆科润生物医药研发有限公司

 

<120>  一种重组人促肾上腺皮质激素释放因子的制备方法

 

 

<130>

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  123

<212>  DNA

<213>  重组人促肾上腺皮质激素释放因子的DNA序列

 

<400>  1

agcgaagaac cgccgattag cctggatctg acctttcatc tgctgcgcga agtgctggaa      60

atggcgcgcg cggaacagct ggcgcagcag gcgcatagca accgcaaact gatggaaatt     120

att                                                                               123

                                                     

 

<210>  2

<211>  41

<212>  PRT

<213>  重组人促肾上腺皮质激素释放因子的氨基酸序列

 

<400>  2

Ser Glu Glu Pro Pro Ile Ser Leu Asp Leu Thr Phe His Leu Leu Arg

1            5                10              15                 

Glu Val Leu Glu Met Ala Arg Ala Glu Gln Leu Ala Gln Gln Ala His

20               25               30            

Ser Asn Arg Lys Leu Met Glu Ile Ile

35               40