一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体及其应用

摘要

本发明公开了一种适用于哺乳动物细胞并能高效表达外源基因的双顺反子表达载体及其应用。该双顺反子表达载体包括5’-3’方向的连接元件（1）开放阅读框1：包含依次排列的巨细胞病毒的早期启动子/增强子及内含子序列、多克隆位点、牛生长激素转录终止子序列；（2）开放阅读框2：包含依次排列的巨细胞病毒的早期启动子/增强子及内含子序列、多克隆位点、牛生长激素转录终止子及猿猴病毒启动子序列；（3）筛选标记基因、猿猴病毒SV40终止子序列。本发明的双顺反子载体具有高效的启动子，有效的转录终止信号，具有筛选与基因扩增标记，具有两个开放阅读框，提高了外源蛋白的表达效率，降低生产成本。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种哺乳动物细胞高效表达载体。

背景技术

按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动 物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的 正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产 物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开 始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为 多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为 重要的作用。但是动物细胞外源蛋白表达效率低，且成本高，因此提高动物细胞外源蛋白 表达效率，降低生产成本是当前急需完成的工作。

高水平的哺乳动物细胞表达载体应具有以下特点：有高效的启动子，以启动目的基因 的转录；有效的转录终止信号，保证转录的正确终止；具有筛选与基因扩增标志，方便筛 选染色体中高拷贝整合目的基因的细胞。在外源基因进行表达过程中，选用什么表达载体 需要从多方面考虑，同一个表达载体，同一个启动子在不同的细胞类型中效果差异较大， 这和该细胞中转录调控因子的存在状况有关，需要不断的摸索。

CHO(中国仓鼠卵巢)细胞是目前表达外源基因最常选用的工程细胞。其中CHO-dhfr^-和CHO-GS是哺乳动物细胞表达的主流细胞株，CHO-dhfr-system是广泛应用的工程细胞株 (国外和国内多个保藏机构有售)，它可以在氨甲喋呤(MTX)压力下使外源基因的拷贝数 扩增，使外源蛋白得到高水平的表达。而且，此细胞株易于转染，可以进行悬浮培养、无 血清培养和高密度发酵。适宜在工业上大量生产重组蛋白。CHO-GS system是Lonza公司开 发的一种高效的外源蛋白表达系统。在哺乳动物细胞内，谷氨酰胺合成酶(Glutamine  synthetase，GS)催化谷氨酸盐(glutamate)和铵盐(ammonium)合成谷氨酰胺(glutamine)， 这一反应是细胞内谷氨酰胺的唯一来源。但是，有些体外培养的细胞(如小鼠骨髓瘤细胞) 天然不能产生足够的GS分子，它们需要在培养基中添加外源性的谷氨酰胺才能维持正常的 生长代谢。因此，GS被认为是理想的转染克隆筛选标记：在无外源性谷氨酰胺的条件下， 只有整合入外来GS基因的细胞才能生长并形成克隆。在MSX的加压下可以使得CHO-GS细 胞高效表达外源基因，通过优化表达载体的方式，可以提高宿主细胞对外源基因的表达， 因此，构建一种适用于哺乳动物细胞，尤其是CHO细胞的高效表达载体在工业生产中意义 重大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于哺乳动物细胞并能高效表达外源蛋白的双顺反子表 达载体及其应用，以降低外源蛋白的生产成本。

本发明一方面公开了一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体，所述载体包括以 下5’-3’方向的连接元件：

(1)开放阅读框1：包含依次排列的巨细胞病毒(CMV)早期启动子/增强子及内 含子序列、多克隆位点、牛生长激素终止子序列；

(2)开放阅读框2：包含依次排列的巨细胞病毒(CMV)早期启动子/增强子及内 含子序列、多克隆位点、牛生长激素转录终止子及猿猴病毒SV40启动子序列；

(3)筛选标记基因、猿猴病毒SV40终止子序列。

较优的，所述开放阅读框1和开放阅读框2的巨细胞病毒(CMV)早期启动子/增强子及 内含子序列为SEQ ID NO：1。

较优的，所述开放阅读框1的牛生长激素转录终止子序列为SEQ ID NO：2。

较优的，所述开放阅读框2的牛生长激素转录终止子及猿猴病毒SV40启动子序列为SEQ ID NO：3。

较优的，所述猿猴病毒SV40终止子序列为SEQ ID NO：4。

较优的，所述开放阅读框1的多克隆位点包括NheI酶切位点和MluI酶切位点；所述开放 阅读框2的多克隆位点包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点。

较优的，所述筛选标记基因选自二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)基 因。

较优的，所述适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体是由质粒Pcmob3H改造获得。

更优的，所述适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体是在质粒Pcmob3H多克隆位点 的SalI酶切位点和NheI酶切位点之间，自5’-3’方向插入有所述开放阅读框1、开放阅读框2以 及筛选标记基因和猿猴病毒SV40终止子序列。

较优的，所述动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

更优的，所述动物细胞选自CHO-K1或CHO-dhfr^-细胞株。

本发明第二方面公开了一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体在哺乳动物细胞 表达蛋白中的应用。

较优的，所述蛋白为抗体，包括一条重链和一条轻链。

更优的，所述抗体为全人TNFα单克隆抗体，包括全人TNFα单克隆抗体的轻链和全人 TNFα单克隆抗体的重链。

最优的，所述全人TNFα单克隆抗体的轻链序列为SEQ ID NO：5；所述全人TNFα单克 隆抗体的重链序列为SEQ ID NO：6。

本发明适用于哺乳动物细胞并能高效表达外源蛋白的双顺反子表达载体，在其两个开 放阅读框中分别设有多克隆酶切位点，可以通过双酶切、连接的方法将外源蛋白的基因序 列插入到所述多克隆位酶切点处：将本发明中的表达载体经限制性内切酶双酶切、电泳， 回收片段大小符合要求的表达载体片段，将大小符合要求的表达载体片段与经过相同的限 制性内切酶处理的外源蛋白的基因进行连接，获得相对应蛋白的高效表达载体。

本发明第三方面公开了一种装载有全人TNFα单克隆抗体基因的双顺反子表达载体，所 述载体为在本发明所述适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体的基础上构建，其中，所 述开放阅读框1的多克隆位点插入有全人TNFα单克隆抗体轻链DNA序列，所述开放阅读框2 的多克隆位点插入有全人TNFα单克隆抗体重链DNA序列。

较优的，所述全人TNFα单克隆抗体的轻链DNA序列为SEQ ID NO：5，全人TNFα单克 隆抗体的重链DNA序列为SEQ ID NO：6。

较优的，所述开放阅读框1的多克隆位点包括NheI酶切位点和MluI酶切位点，所述全人 TNFα单克隆抗体轻链DNA序列插入于NheI酶切位点和MluI酶切位点之间；所述开放阅读框 2的多克隆位点包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，所述全人TNFα单克隆抗体重链DNA序 列插入于EcoRI酶切位点和NotI酶切位点之间。

本发明的有益效果为：(1)具有巨细胞病毒(CMV)的早期启动子与增强子序列，可 高效进行外源基因的转录；(2)含有一段内含子序列，可提高信使RNA(mRNA)的稳定 性，延长其半衰期；(3)含有牛生长激素多聚腺苷酸转录终止信号，保正mRNA转录的及时 终止；(4)含有二氢叶酸还原酶(DHFR)，作为筛选及扩增标志，可筛选得到稳定整合目的 基因的细胞株，并使细胞在MTX选择压力下，提高目的基因的表达。(5)将轻链和重链区 放在同一载体中共同转录和表达，使重链、轻链能保证1∶1的比例表达，组成全分子抗体。 因此，本发明的载体具有高效的启动子，以启动目的基因的转录；有效的转录终止信号， 保证转录的正确终止；具有筛选与基因扩增标志，方便筛选染色体中高拷贝整合目的基因 的细胞。抗体的表达量的测定结果表明，与现有动物细胞双顺反子表达载体相比，本发明 的双顺反子表达载体的抗体表达量获得大幅提升，表达水平提高了约10-20倍，提高了动物 源性抗体的制备效率，降低生产成本。

附图说明

图1：双顺反子表达载体的结构

图2：pHAI-H质粒的构建过程

图3：pHAI-DH质粒的构建过程

图4：pHAI-N-DH质粒的构建过程

具体实施方式

下述实施例详细说明本发明，但并不对其发明范围进行限制。

实施例1pCMV-intron-L-BGH PA片段的扩增

(1)pCMV启动子与内含子的PCR扩增

质粒pCI-neo为真核表达质粒载体，以pCI-neo质粒为模板，以巨细胞病毒(CMV)早期 启动子/增强子及内含子序列(SEQ ID NO：1)为参考，设计含SacI酶切位点或NheI酶切位 点的引物P1/P2进行PCR反应，扩增两端带有酶切位点的巨细胞病毒(CMV)早期启动子/ 增强子及内含子序列，PCR反应条件如表1。

上游引物(P1)：5′-GCGGAGCTCGGGCTATTGGCCATTGCATACGC-3′(下划线为SacI 酶切位点)(SEQ ID NO：7)

下游引物(P2)：

5′-TGAACTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAGCTAGCGC-3′(下划线为 NheI酶切位点)(SEQ ID NO：8)

于100μl薄壁离心管建立以下反应体系：

表1PCR反应条件

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物的大小与预计的相符，将扩增出的DNA片段 用胶回收试剂盒回收。

(2)全人TNFα单克隆抗体的轻链的PCR扩增

取活动性类风湿关节炎病人外周血5毫升，用淋巴细胞分离液分离白细胞，进行培养， 根据ELISA结果鉴定阳性克隆，获得的阳性克隆细胞5000-10000个，用Trizol(GIBCO)分 离总RNA，用M-MLV反转录酶(Promega公司产品)以获取cDNA。以该cDNA为模板，以 抗体的轻链序列(SEQ ID NO：5)为参考，设计含NheI酶切位点或MluI酶切位点的引物P3/P4 进行PCR反应，扩增两端带有酶切位点的巨细胞病毒抗体的轻链，PCR反应条件见表1。

上游引物(P3)：5′GCGCTAGCTTGCCTTTCTCATCCCAGGTGTCCACTCCCAGTTCA -3′(下划线为NheI酶切位点)(SEQ ID NO：9)

下游引物(P4)：5′-CTAGAAGGCACAGTCGCTAACACTCTCCCCTGACGCGTGC-3′ (下划线为MluI酶切位点)(SEQ ID NO：10)

于100μl薄壁离心管建立以下反应体系：

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物的大小与预计碱基对相符，将扩增出的DNA 片段用胶回收试剂盒回收。

(3)BGH PA转录终止序列的PCR扩增

质粒pCI-neo(Promega)为真核表达质粒载体，以之为模板，以BGH PA转录终止序列(SEQ ID NO：2)为参考，设计含MluI酶切位点或XbaI酶切位点的引物P5/P6并进行PCR反应，扩 增两端带有酶切位点的BGH PA转录终止序列，PCR反应条件见表1。

上游引物(P5)：5′GCACGCGTCAGGGGAGAGTGTTAGCGACTGTGCCTTCTAG-3′(下 划线为MluI酶切位点)(SEQ ID NO：11)

下游引物(P6)：5′ATAGAGCCCACCGCATCCCCAGTCTAGAGC-3′(下划线为XbaI酶 切位点)(SEQ ID NO：12)

于100μl薄壁离心管建立以下反应体系：

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物的大小与预计的碱基对相符，将扩增出的 DNA片段用胶回收试剂盒回收。

(4)pCMV-intron-L-BGH PA片段的重叠延伸PCR法拼接

以P1和P6为引物，将制备的pCMV-intron、Light、BGH PA片段混合作为为模板扩增 pCMV-intron-L-BGH PA的全长序列，PCR反应条件见表1。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物的大小与预计大小相符，将扩增出的DNA片 段用胶回收试剂盒回收。

(5)重组质粒pHAI-H的构建

将回收的纯化产物用sacI和XbalI双酶切处理，与同样双酶切处理的的Pcmob3H进行连 接，连接反应体系如下：

反应体系总体积15μl，依次加入各反应物质，混匀，置于16℃水浴16小时。转化感 受态大肠杆菌DH5α，将大肠杆菌接种于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基培养， 筛选出阳性菌落，扩增抽提质粒并测序，序列为SEQ ID NO：24，测序确认正确，得到的正 确质粒命名为pHAI-H。

实施例2pCMV-H-BGHA-SV40片段的扩增

(1)pCMV启动子与内含子的PCR扩增

以pCI-neo质粒为模版，以巨细胞病毒(CMV)早期启动子/增强子及内含子序列(SEQ ID NO：1)为参考，设计含xhoI酶切位点或EcoRI酶切位点的引物P7/P8进行PCR反应，扩增两端 带有酶切位点的巨细胞病毒(CMV)早期启动子/增强子和内含子序列，PCR反应条件如表 1。

上游引物(P7)：5′-GCGCTCGAGGGGCTATTGGCCATTGCATACGC-3′(下划线为xhoI 酶切位点)(SEQ ID NO：13)

下游引物(P8)：5′-CTGGGAGTGGACATGGAGAGAAAGGCAAAGTGGGAATTCCGC- 3′(下划线为EcoRI酶切位点)(SEQ ID NO：14)

于100μl薄壁离心管建立以下反应体系：

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物的大小与预计大小相符，将扩增出的DNA片 段用胶回收试剂盒回收。

(2)全人TNFα单克隆抗体的重链的PCR扩增

取活动性类风湿关节炎病人外周血5毫升，用淋巴细胞分离液分离白细胞，进行培养， 根据ELISA结果鉴定阳性克隆，获得的阳性克隆细胞5000-10000个，用Trizol(GIBCO)分 离总RNA，用M-MLV反转录酶(Promega公司产品)以获取cDNA。以该cDNA为模板，以 抗体重链序列(SEQ ID NO：6)为参考，设计含EcoRI酶切位点或NotI酶切位点的引物P9/P10 进行PCR反应，扩增两端带有酶切位点的巨细胞病毒抗体的重链，PCR反应条件见表1。

上游引物(P9)：5′GCGGAATTCCCACTTTGCCTTTCTCTCCATGTCCACTCCCAG-3′(下 划线为EcoRI酶切位点)(SEQ ID NO：15)

下游引物(P10)：5′CTAGAAGGCACAGTCGTCATTTACCCGGAGACAGGGGCGGCCGCCGC-3′(下划线为NotI酶切位点)(SEQ ID NO：16)

于100μl薄壁离心管建立以下反应体系：

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物与预计大小相符，将扩增出的DNA片段用 胶回收试剂盒回收。

(3)牛生长激素(BGH PA)转录终止子及猿猴病毒SV40启动子的扩增

以BGH转录终止子及猿猴病毒SV40启动序列(SEQ ID NO：3)为参考，设计含NotI酶 切位点或SpeI酶切位点的引物P11/P12，以pCI-neo为模板进行PCR反应，扩增两端带有酶切 位点的牛生长激素(BGH)转录终止子及猿猴病毒SV40启动子的扩增，PCR反应条件见表1。

上游引物(P11)：5′-GCGGCGGCCGCCCCTGTCTCCGGGTAAATGACGACTGTGCCTTCT AG-3′(下划线为NotI酶切位点)(SEQ ID NO：17)

下游引物(P12)：5′GCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCACTAGTGCG-3′(下划线为SpeI 酶切位点)(SEQ ID NO：18)

于100μl薄壁离心管建立以下反应体系：

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物与预计的大小相符，将扩增出的DNA片段 用胶回收试剂盒回收。

(4)pCMV-intron-H-BGH PA-SV40片段的重叠延伸PCR法拼接

以P7和P12为引物，将pCMV-intron、Heavy、BGH PA SV40的胶回收产物混合，作 为模板扩增pCMV-intron-H-BGH PA-SV40的全长基因序列，PCR反应条件见表1。

PCR反应体系如下：

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物与预计的大小相符，将扩增出的DNA片段用胶 回收试剂盒回收。

(5)重组质粒pHAI-DH的构建

将获得的pCMV-intron-H-BGH PA-SV40的PCR产物与pMD-19T载体连接，并将重组质粒以 XhoI/SpeI酶切鉴定，对构建的阳性质粒pMD-pCMV-intron-H-BGH PA-SV40进行DNA测序。 重组质粒pMD-pCMV-intron-H-BGH PA-SV40以XhoI/SpeI双酶切，回收pCMV-intron-H-BGH PA-SV40DNA片段；将实施例1制备的重组质粒pHAI-H也以XhoI/SpeI双酶切处理，将双酶切处 理后的pCMV-intron-H-BGH PA-SV40基因与双酶切处理后的pHAI-H连接后，测序确认，序列 为SEQ ID NO：25，测序结果正确，将得到的正确质粒命名为pHAI-DH。

连接反应体系如下：

实施例3DHFR-SV40PA片段的扩增

(1)DHFR片段的扩增

从常规传代培养的CHO-K1细胞抽提细胞总RNA，逆转录成cDNA作为模板，以DHFR 序列(SEQ ID NO：23)为参考，设计引物P13/P14进行PCR反应，扩增出一端含SfiI酶切 位点的DHFR片段，PCR反应条件见表1。

上游引物(P13)：5′GCGGGCCATCGAGGCCGCCACCATGGTTCGACCATTG-3′(下 划线为SfiI酶切位点)(SEQ ID NO：19)

下游引物(P14)：5′-CATCAATGTATCTTATCAGCATCTTCCTGTTAGTC-3′(SEQ ID NO：20)

建立以下反应体系：

PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物的大小与预计的碱基对大小相符，将扩增出 的片段用DNA胶回收试剂盒回收。

(2)SV40PA片段的扩增

以质粒pCI-neo为模板，以SV40PA序列(SEQ ID NO：4)为参考，设计引物P15/P16，进 行PCR反应，扩增一端含NheI酶切位点的SV40PA片段序列，PCR反应条件见表1。

上游引物(P15)：5′-GACTAACAGGAAGATGCTGATAAGATACATTGATG-3′(SEQ ID NO：21)

下游引物(P16)：5′GTTTATTGCAGCTTATAATGGTGCTAGC-3′(下划线为NheI酶 切位点)(SEQ ID NO：22)

于100μl薄壁离心管建立以下反应体系：

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物与预计的大小相符，将扩增出的DNA片段 用胶回收试剂盒回收。

(3)DHFR-SV40PA片段的重叠延伸PCR法拼接

分别以DHFR和SV40PA的胶回收产物为模板，以P13和P16为引物，拼接DHFR-SV40 PA的全长基因序列，PCR反应条件见表1。

PCR反应体系为：

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物与预计的大小相符，将扩增出的DNA片 段用胶回收试剂盒回收。

(4)双顺反子表达载体的构建

将获得的DHFR-SV40PA的PCR产物与pMD-19T载体连接，鉴定阳性质粒pMD- DHFR-SV40PA进行测序，结果与预期序列完全一致。

重组质粒pMD-DHFR-SV40PA以SfiI/NheI双酶切，回收pMD-DHFR-SV40PA片段； 重组质粒pHAI-DH也以SfiI/NheI双酶切，将pMD-DHFR-SV40PA基因与之连接，测序确 认，序列为SEQ ID NO：26，测序结果正确，得到的正确质粒命名为pHAI-N-DH。

连接反应体系为：

实施例4pHAI-N-DH载体转染CHO细胞表达抗体研究

(1)重组表达质粒pHAI-N-DH转染CHO细胞

用GMEM-S(Gibco-BRL)培养基常规传代培养CHO-K1细胞，GMEM-S培养基使用 前加入经过热灭活和透析处理的10％胎牛血清。细胞80％融合时，以0.25％胰蛋白酶消化 细胞，细胞传代接种于35mm细胞培养皿，次日进行质粒转染。将2μg质粒pHAI-N-DH 与10μl脂质体转染试剂Lipofectamine分别以100μl不含胎牛血清的GMEM-S培养基稀释， 再混合至一管，轻轻混匀，室温放置40分钟。其间用未加胎牛血清的GMEM-S培养液洗 细胞两次，吸除培养液。室温放置40分钟的转染液内加入800μl无血清的GMEM-S培养 液，轻轻混匀，再加入以无血清培养基洗涤的细胞培养皿内，置于37℃、5％二氧化碳、饱 和湿度的细胞培养箱，12小时后加1ml含20％胎牛血清的GMEM-S培养液，继续培养48 小时。

(2)细胞筛选及表达产物检测

转染48小时后，将细胞以0.25％胰蛋白酶消化，接种于5个90mm细胞培养板，加氨甲喋 呤(Methotrexate，MTX)(Sigma)至终浓度25μmol/L，3-4天后细胞开始死亡，两周后存 活的细胞趋于稳定，并形成由单个细胞增殖而形成的集落(克隆)，待克隆大小适中时，挑 选单个克隆，接种于24孔板。方法：将滤纸剪成约2×2mm²的碎片，高压灭菌，烤干，浸泡 于0.25％胰蛋白酶消化液。将形成单细胞克隆的培养板中的培养液弃去，用镊子将以0.25％ 胰蛋白酶消化液浸泡的滤纸片放置与单细胞克隆上，3-5分钟后将滤纸取出，置于24孔板内， 共挑选了60个单细胞克隆，用含50μmol/L MTX的完全GMEM-S培养基培养细胞，培养的细 胞上清，运用间接ELISA法测定TNF-α表达量；首先将检测用TNF抗原用包被缓冲液稀释至适 合的浓度，在96孔板中，每孔加入100μl的包被液，4℃冰箱包被过夜。包被完成后，用洗 涤液连续洗涤5次。准确称取0.5gBSA，溶于100ml PBS中，混匀，即为0.5％BSA。每孔加入 300μl的封闭液，再次放入4℃封闭过夜。取出96孔板，在洗板机上连续洗5次。将系列稀 释的样品依次加入酶标板中，同时做阴性和阳性对照，放于37℃孵育1h。取出96孔板，在 洗板机上连续洗5次。每孔加入二抗100μl，置于37℃孵育1h。取出96孔板，在洗板机上连 续洗5次，每孔加入100μlTMB显色液，37℃10min。待显色后，加入50μl的终止液(2M的 浓硫酸)，在450nm处测定0D值

结果如下：检测到表达的TNF-α抗体的表达的量为：1576.2ng/ml，结果表明，本表达载 体可以高效表达外源蛋白。