一种删除转基因水稻精米中的外源基因的表达载体及其应用

摘要

本发明公开了一种用于删除转基因水稻精米中的外源基因的表达载体，包括原始载体以及插入原始载体的重组序列，所述的重组序列由两端的LoxP-FRT元件、中间的外源目的基因表达盒和Cre基因或FLP基因表达盒组成，所述Cre基因或FLP基因表达盒的启动子为胚乳特异性启动子。本发明还公开了一种利用所述的表达载体删除转基因水稻精米中的外源基因的方法，将获得的表达载体转入水稻细胞，培育生成转基因水稻植株。本发明方法获得的转基因水稻即能达到抗虫和(或)抗除草剂等目的，而在胚乳即精米中又没有外源目的基因，解决了其食用安全性问题。

说明书

技术领域

本发明涉及水稻基因工程领域，具体涉及一种删除转基因水稻精米中 的外源基因的表达载体及其应用。

背景技术

自1988年以原生质体为受体首次获得转基因水稻以来，水稻转基因 技术已获得快速发展(Toriyama，K.，et al.Transgenic rice plants after direct  gene transformation into protoplasts.Bio/Technology，1988，6：1072-1074)。目 前，利用不同的转基因方法，科学家业已将抗除草剂基因、抗虫基因、抗 病基因、抗逆基因及不同品质改良基因等外源目的基因导入不同水稻品种 (系)，获得了大量转基因水稻。迄今为止，美国批准了安万特公司的转 bar基因的耐除草剂水稻LL RICE 06、LL RICE 62和LL RICE 601；伊朗 政府批准了抗虫转基因水稻的商业化种植；而在中国，“华恢1号”和“Bt 汕优63”两个转基因水稻品系的生产应用安全证书也于2009年12月得以 颁发。然而，由于转基因技术的开发与利用的时间较短，人类对其生物安 全性认识还十分有限，在科学界和社会大众中，很多人对此心存顾虑，担 心转基因水稻中的外源基因，如一些杀虫、抗菌基因、过敏蛋白可能危及 人类健康，以及担心抗抗生素抗性基因一旦整合到人类病原微生物，将对 人类产生潜在的危险。

水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一，它是超过一半世界人口 的主粮。我们通常所食用的稻米是指加工后的精米，它是水稻种子的胚乳 部分。因此，发明一种删除水稻精米中的外源基因的转基因方法，解决转 基因水稻的食品安全性问题具有重要的理论意义和应用价值。

位点特异性重组(site-specific recombination)是遗传重组的一类 (Lyznik，LA.，et al.Site-specific recombination for genetic engineering in  plants.Plant Cell Reports，2003，21：925-932)。这类重组依赖于小范围同源 序列的联会，重组也只发生在同源的短序列的范围之内，需要位点特异性 的蛋白质分子参与催化，重组的蛋白不是rec系统而是int等。位点特异 性重组系统主要包括两个重要元件：重组酶(recombinase)和该重组酶能 特异识别的位点(recognition site)。其工作原理是：重组酶专一性地识别 并介导两个同向特异性识别位点，形成所谓的Holiday结构，进而攻击并 破坏识别位点，使环状DNA脱离染色体，完成重组(Voziyanov，Y.，et al.A  general model for site-specific recombination by the integrase family  recombinases.Nucleic Acids Res.，1999，27：930-941)。

目前，能在植物中有效利用的位点特异性重组系统主要包括大肠杆 菌噬菌体pl的Cre/loxP系统(Odell，J.，et al.Site-directed recombination in the  genome of transgenic tobacco.Mol Gen Genet.，1990，223：369-378)、接合酵 母的R/rs系统(Sugita，K.，et al.A transformation vector for the production of  marker free transgenic plants containing a single copy transgene at high  frequency.The Plant J.，2000，22：461-469)、酿酒酵母的FLP/FRT系统(Lloyd， AM.，et al.Functional expression of the yeast FLP/FRT site-specific  recombination system in Nicotiana tabacum.Mol Gen Genet.，1994，242： 653-657)和大肠杆菌噬菌体λ的Xis/attp系统，Cre、FLP、R和X是重组酶， LoxP、FRT、rs和attp为相应的特异性位点，这些特异性位点DNA序列各 异，但大体结构相似，一般均由几十个碱基组成，含有一个6-8bp的核心 区域和一对反向重复序列。其中，Cre/LoxP和FLP/FRT系统是在植物中研 究最为广泛而深入的一个位点特异性重组系统，常常被用来删除转基因植 物中的标记基因和转基因植物花粉中的外源基因(易厚富和王金发，异源 位点特异性重组系统在植物在的研究。遗传，1999，21(5)：62-66；Luo， K.，et al.‘GM-gene-deletor’：fused loxP-FRT recognition sequences  dramatically improve the efficiency of FLP or CRE recombinase on transgene  excision from pollen and seed of tobacco plants.Plant Biotech J.，2007，5： 263-274)。

授权公告号为CN1281750C的发明专利公开了一种诱导型位点特异 性重组系统定时删除特定外源基因的方法，删除转基因植物中的外源基 因，在特定时间内通过施入诱导剂，激活重组酶基因转录，从而删除特定 外源基因。其步骤包括：(1)将化学诱导启动子控制下的位点特异性重组 系统和待删除的外源基因引入一种植物表达载体以构建一种重组载体，使 得所述化学诱导启动子控制下的位点特异性重组系统中的重组酶基因和 待删除的外源基因同时位于所述位点特异性重组系统中的重组识别位点 之间；(2)将所述重组载体转化植物；(3)使外源基因表达；(3)在需要 删除外源基因时施入化学诱导启动子相应的诱导剂，删除外源基因，其中 所述化学诱导启动子是乙酰苯胺类除草剂安全剂诱导启动子。该方法构建 的表达载体中采用的是化学诱导型启动子，控制位点特异性重组系统，需 要添加相应除草剂作为诱导剂如2-氯乙酰苯胺，诱导重组酶基因的表达， 启动位点特异性重组系统，达到删除外源基因的目的，所以在删除外源基 因的同时又引入了新的化学物质。然而，对于水稻来说，其抽穗开花、种 子充实灌浆均有一定期限，通常需要10天以上，而且对于不同植株来说， 其生育期也不一致，况且化学物质的有效性还受环境等因素影响，因此很 难利用上述方法实现完全删除种子中的外源基因；当然，如果要完全删除 种子中的外源基因，则势必要施更多的诱导剂，从而一定程度上将污染环 境。因此对于粮食作物尤其是人类赖以生存的主要粮食作物如水稻来说， 该方法还是存在安全风险。

目前为止，尚没有可以有效地且对水稻基本无损害地去除转基因水稻 精米中的外源基因的方法。因此本领域迫切需要开发一种有效获得转基因 水稻的精米中无外源基因的方法。

发明内容

本发明提供了一种删除转基因水稻精米中的外源基因的表达载体及 其应用，构建含胚乳特异性启动子控制下的位点特异性重组系统和待删除 基因的表达载体，转化水稻细胞，删除水稻精米中的外源基因。

一种用于删除转基因水稻精米中的外源基因的表达载体，包括原始载 体以及插入原始载体的重组序列，所述的重组序列由两端的LoxP-FRT元 件、中间的外源目的基因表达盒和Cre基因或FLP基因表达盒组成，所述 Cre基因或FLP基因表达盒的启动子为胚乳特异性启动子。

所述表达载体的原始载体为pSB130或pCAMBIA1300。

本发明还提供了一种删除转基因水稻精米中的外源基因的方法，包 括：

将重组序列插入原始载体，构建表达载体，将表达载体转入水稻细胞， 培育生成水稻植株，所述的重组序列由两端的LoxP-Frt元件、中间的外源 目的基因表达盒和Cre基因或Flp基因表达盒组成，所述Cre基因或Flp 基因表达盒的启动子为胚乳特异性启动子。

所述表达载体通过农杆菌介导或基因枪转入水稻细胞。

所述的胚乳特异性启动子为EnP2或RAG1，所述的EnP2(GenBank  Accession NO：AK107215)碱基序列如SEQ ID NO：1所示，根据发明专 利CN201010146054.0中公开的方法，从林拥军教授(华中农业大学生命 科学院，武汉，湖北)提供的含有EnP2胚乳特异启动子的质粒中扩增； 所述的RAG1(GenBank Accession NO：D11433.1)碱基序列如SEQ ID NO： 2所示，根据Wu等(Wu，CY.，et al.Promoters of rice seed storage protein  genes direct endorsperm-specific gene expression in transgenic rice.Plant Cell  Physiol.，1998，39：885-889)在文献中公开的方法从水稻品种日本晴基因 组中扩增。

所述的LoxP-FRT元件的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，根据Luo 等(Luo K.，et al.‘GM-gene-deletor’：fused loxP-FRT recognition sequences  dramatically improve the efficiency of FLP or CRE recombinase on transgene  excision from pollen and seed of tobacco plants.Plant Biotech.J.，2007，5： 263-274)在文献中公开的LoxP-FRT序列及NOS终止子序列人工合成。

所述的FLP基因为人工合成序列，碱基序列如SEQ ID NO：4所示。

所述的Cre基因(GenBank Accession NO：X03453.1)来源于大肠杆菌， 碱基序列如SEQ ID NO：5所示。

所述的外源目的基因表达盒中包含的外源目的基因为抗虫基因、抗除 草剂基因、药物蛋白基因、抗病基因和工业酶基因中的至少一种，优选为 抗虫基因、抗除草剂基因、抗病基因中的至少一种。抗虫基因优选为 Cry1AbCry1Ab/1Ac，Cry1Ac，Vip3A或Vip3H(徐宁，苏云金芽孢杆菌营养期 杀虫蛋白(Vip3)突变体的杀虫活性及其对胰蛋白酶的敏感性。硕士学位 论文，2007，浙江大学图书馆)；抗除草剂基因优选为Bar基因(De Block  M.，et al.Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using  Agrobacterium tumefaciens and the expression of the bar and neo genes in the  transgenic plants.Plant Physiol.，1989，91：694-701)、EPSPS基因(赵特，一 种抗草甘膦基因的发现和抗草甘膦转基因水稻的培育。博士学位论文， 2008，浙江大学图书馆)、Bxn基因(钟蓉等，转TA29-barnase基因的甘 蓝型油菜的雄性不育的研究。植物学报，1996，38(7)：582-585)、Pat 基因(Kumar A.，et al.Genetic characterization of glufosinate-ammonium  tolerant summer rape lines.Crop Sci.，1998，38：1489-1494)或AHAS基因 (Miki B.，et al.Transformation of Brassica napus canola cultivars with  Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase genes and analysis of  herbicide resistance.Theor Appl Genet.，1990，80：449-458)；所述抗病基因 优选为Pi25、Xa21、Pi2或Pi9(www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm； www.ricedata.cn/gene/gene_xa.htm)。

更优选地，所述的外源目的基因表达盒中包含的外源目的基因为抗虫 基因Cry1Ab/Cry1Ac和(或)抗草甘膦基因。抗虫基因Cry1Ab/Cry1Ac和 (或)抗草甘膦基因已在美国专利US 4940835中公开。

在本发明中，将外源目的基因表达框和重组酶的胚乳特异性表达框紧 密连锁并连接在同一个T-DNA区域的两个同向特异位点间，利用农杆菌 介导法或基因枪法将该T-DNA片段完整整合到水稻基因组中，使目的基 因及重组酶基因能在转基因后代中稳定遗传。

所述的胚乳特异性启动子是种子特异性启动子中的一种，该类特异性 启动子仅在种子的胚乳中发挥作用，在植物的其它器官和组织中则不能表 达。所以借助位点特异重组系统并利用胚乳特异性启动子驱动重组酶仅在 胚乳中特异表达，就可以删除胚乳中的位于两个同向特异位点间的DNA 序列，倘若目的基因的表达框也位于同向特异位点间，则可以获得胚乳(即 水稻精米)中无外源目的基因的转基因水稻。

本发明的有益效果：本发明方法获得的转基因水稻在除水稻胚乳即精 米以外的组织器官中表达外源目的基因，如抗虫基因和(或)抗除草剂基 因等，达到抗虫和(或)抗除草剂的目的，而在胚乳即精米中又没有外源 目的基因，解决了其食用安全性问题，通过将外源目的基因表达框和重组 酶的胚乳特异性表达框紧密连锁并在水稻种子的胚中表达外源目的基因， 解决了目的性状的遗传稳定性问题。

附图说明

图1是T-DNA载体p1300-326-Ubi-YFP-EnP2-FLP的示意图；

图2是T-DNA载体pSB326-Actin1-Bt-RAG1-FLP的示意图；

图3是实施例2中PCR扩增转基因水稻中YFP基因的电泳图谱；

其中(A)为转基因水稻糙米，(B)为转基因水稻精米；泳道1-11 为转基因水稻，P为质粒p1300-326-Ubi-YFP-EnP2-FLP。

具体实施方式

以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术，在 Ausubel编写的由John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in  Molecular Biology和J.Sambrook等编写的由Cold Spring Harbor Laboratory  Press(2001)出版的Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，3^rd ED.等文献 均有详细的说明。以下施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市售购买 产品。

实施例1：水稻T-DNA转化载体p1300-326-Ubi-YFP-EnP2-FLP的构建

1)、重组系统的人工合成与构建

根据Luo等(Lou K.，et al.‘GM-gene-deletor’：fused loxP-FRT  recognition sequences dramatically improve the efficiency of FLP or CRE  recombinase on transgene excision from pollen and seed of tobacco plants. Plant Biotech.J.，2007，5：263-274)在文献中报道的loxP-FRT序列，以及 NOS序列，由大连宝生物(中国，大连)人工合成重组系统 loxP-FRT-FLP-Nos-loxP-FRT(碱基序列如SEQ ID NO：6)，在序列的两端 含有HindIII和EcoRI酶切位点，在FLP序列前含一段多克隆位点序列(多 克隆序列的酶切位点是ClaI-NdeI-PstI-SwaI-SalI-NcoI-BamHI-NruI- KpnI-HpaI-Bsp1407I-AscI-SnaBI-BglII-ApaI-StuI-SpeI-SacII-XhoI-SmaI)，经 HindIII和EcoRI酶切后插入pCAMBIA1300中，形成p1300-326。

2)、胚乳特异启动子EnP2的克隆

胚乳特异性启动子EnP2(GenBank Accession NO：AK107215)，根据发 明专利CN201010146054.0中公开的方法由林拥军教授(华中农业大学生 命科学院，武汉，湖北)提供含有EnP2胚乳特异启动子的质粒，分别合 成两条引物(表1)，从质粒中PCR扩增出胚乳特异启动子EnP2(SEQ ID  NO：1)。

表1.扩增胚乳特异启动子EnP2的引物序列

  上游引物   5’-ACTGTGGCATGGCCCGGGGTAACTAGATGACGTTATTTGA-3’(SEQ ID NO：7)   下游引物   5’-CCGCGGCTCGAGCCCGGGTCTCAATCCTCAATGAGTGGT-3’(SEQ ID NO：8)

PCR反应成分：

反应参数：

98℃，10秒，55℃，15秒，72℃，1分50秒，35个循环。72℃延伸 5分钟。

PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后，以SmaI酶切p1300-326， 用Clontech的In-FusionHD Cloning Kit将EnP2克隆到p1300-326，用 SmaI酶切鉴定，获得的阳性克隆再测序(PE公司，377测序仪；上海生 工生物工程技术服务有限公司)验证，测序正确的质粒命名为 p1300-326-EnP2-FLP。

3)Ubi启动子和YFP(黄色荧光蛋白)-NOS的克隆

根据Christensen和Quail(Christensen AH and Quail PH.Ubiquitin  promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or  screenable marker genes in monocotyledonous plants.Transgen Res.1996， 5：213-218)在文献中的报道，分别合成两条引物(表2)，从玉米(Zea mays) 基因组中，PCR扩增出组成性启动子Ubi。

表2扩增组成型启动子Ubi的引物序列

  上游引物   5’-TTTGGATCCAACTCGCGACAGTGCAGCGTGACCCGG-3’(SEQ ID NO：9)   下游引物   5’-AAAGGTACCCAGTCGCGAGGATCCTCTAGAGTCGACCT-3’(SEQ ID NO：10)

PCR反应成分：

反应参数：

98℃，10秒，55℃，15秒，72℃，2分钟，35个循环。72℃延伸5 分钟。

根据Zhou等(Zhou Y.，et al.Molecular control of nuclear and subnuclear  targeting of the plant CDK inhibitor ICK1 and ICK1-mediated nuclear  transport of CDKA.Plant Mol Bio.，2006，62：261-278)在文献中报道并由 周永明教授(华中农业大学植物科技学院，湖北，武汉)提供的含有 YFP-NOS的质粒pZ73A2，分别合成上游引物和下游引物(表3)，以质粒 pZ73A2为模版扩增出YFP-NOS。

表3扩增YFP基因和NOS终止子的引物序列

  上游引物 5’-CTGGGTACCTTTGTTAACATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’(SEQ ID NO：11)   下游引物 5’-GGGTGTACATTTGTTAACCCGATCTAGTAACATAGATGA-3’(SEQ ID NO：12)

PCR反应成分：

反应参数：

98℃，10秒，55℃，15秒，72℃，1分钟，35个循环。72℃延伸5 分钟。

用Clontech的In-FusionHD Cloning Kit将Ubi和YFP-NOS克隆到 p1300-326-EnP2-FLP(质粒用NruI和HpaI双酶切)，用NruI和HpaI双酶 切鉴定，获得的阳性克隆再测序(PE公司，377测序仪；上海生工生物工 程技术服务有限公司)验证，测序正确的质粒命名为 p1300-326-Ubi-YFP-EnP2-FLP，示意图如图1所示。

实施例2：精米中无外源基因的转基因水稻的获得

转基因水稻的获得方法是采用现有的技术(Pan G.，et al.Map-based  cloning of a novel rice cytochrome P450 genes Cyp81A6 that confers  resistance to two different classes of herbicides.Plant Molecular Biology， 2006，61：933-943)，选取饱满的水稻品种日本晴种子，去壳，诱导产生 愈伤组织作为转化材料。通过电激法将实施例1中构建的T-DNA载体 p1300-326-Ubi-YFP-EnP2-FLP导入农杆菌EHA105。取含T-DNA载体 p1300-326-Ubi-YFP-EnP2-FLP的农杆菌划板，挑单菌落在LB培养基中培 养，为水稻转化准备农杆菌。

将待转化的水稻愈伤组织在无菌滤纸上稍微吸干，将愈伤组织放入 OD₆₀₀为0.5的农杆菌菌液中(含乙酰丁香酮，200μmol/L)，室温下放置 40分钟后弃菌液，再将水稻愈伤组织置于无菌滤纸上吸去多余菌液，把愈 伤组织转移到共培养基上培养50-55小时，将表面没有很多农杆菌的愈伤 组织转入抑菌培养基上培养5-7天，而后再将表面没有农杆菌的愈伤组织 转入筛选培养基上培养6周(每两周继代一次)。把筛选后获得的抗性愈 伤转移到预分化培养基上(先暗培养5-7天，而后16小时光照分化发芽) 4-6周，待抗性幼苗长成后转移到生根培养基上生根，最后将再生植株洗 去培养基于温室或田间培养，直至收获种子。

种子收获后，先将种子脱壳，获得转基因水稻糙米；而后将大部分糙 米进一步研精，从而获得精米。利用Takara公司的Rice DNAExtraction Kit 从100粒糙米和100粒精米中提取总DNA，利用YFP基因的引物(表4) 进行扩增。

表4.扩增转基因水稻中的YFP基因的引物序列

  上游引物  5’-CTGACCCTGAAGTTCATCTG-3’(SEQ ID NO：13)   下游引物  5’-GTGTTCTGCTGGTAGTGGTC-3’(SEQ ID NO：14)

PCR反应成分：

反应参数：

95℃，30秒，55℃，30秒，72℃，30秒，35个循环。72℃延伸5分 钟。

结果见图3，结果显示，所用转基因水稻糙米中均含有YFP基因，而 在转基因水稻精米7和11中则没有YFP基因，表明这两个转基因水稻精 米中的YFP基因已经被完全删除。

实施例3：用于培育无标记基因及水稻精米中无Bt抗虫基因的双T-DNA 载体的构建

1)重组系统的构建

将实施例1中的p1300-326经HindIII和EcoRI酶切后插入超级双 T-DNA载体pSB130(刘巧泉，基因工程技术提高稻米赖氨酸含量。博士 学位论文，2002，扬州大学图书馆)，pSB130质粒系由香港中文大学生物 系辛世文院士提供，形成pSB326。

2)胚乳特异启动子RAG1的克隆

根据Wu等(Wu CY.，et al.Promoters of rice seed storage protein genes  direct endorsperm-specific gene expression in transgenic rice.Plant Cell  Physiol.，1998，39：885-889 and GenBank Accession NO：D11433.1)在文献 的报道，分别合成两条引物(表5)，从水稻品种日本晴基因组中PCR扩 增出胚乳特异启动子RAG1(SEQ ID NO：2)。

表5.扩增胚乳特异启动子RAG1的引物序列

PCR反应成分：

反应参数：

98℃，10秒，55℃，15秒，72℃，30秒，35个循环。72℃延伸5 分钟。

PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后，以SmaI酶切pSB326，用 Clontech的In-FusionHD Cloning Kit将RAG1克隆到pSB326，用SmaI 酶切鉴定，获得的阳性克隆再测序(PE公司，377测序仪；上海生工生物 工程技术服务有限公司)验证，测序正确的质粒命名为 pSB326-RAG1-FLP。

3)Actin1启动子和Bt-Nos的克隆

根据专利号为ZL200510062980的报道，分别合成两条引物(表6)， 从质粒pFHBT1(本实验室保存)基因组中，PCR扩增出组成性启动子 Actin 1；

表6.扩增组成性启动子Actin 1的引物序列

PCR反应成分：

反应参数：

98℃，10秒，55℃，15秒，72℃，1分30秒，35个循环。72℃延 伸5分钟。

再合成两条引物(表7)，从质粒pFHBT1中PCR扩增出Bt-NOS。

表7.扩增Bt基因和Nos终止子的引物序列

  上游引物   5‘-CTGGGTACCTTTGTTAACATGGACAACTGCAGGCCATA-3’(SEQ ID NO：19)   下游引物   5‘-GGGTGTACATTTGTTAACCCGATCTAGTAACATAGATGA-3’(SEQ ID NO：20)

PCR反应成分：

反应参数：

98℃，10秒，55℃，15秒，72℃，2分30秒，35个循环。72℃延 伸5分钟。

用Clontech的In-FusionHD Cloning Kit将Actin1和Bt-NOS克隆到 pSB326-RAG1-FLP(质粒用NruI和HpaI双酶切)，用NruI和HpaI双酶切 鉴定，获得的阳性克隆再测序(PE公司，377测序仪；上海生工生物工程 技术服务有限公司)验证，测序正确的质粒命名为 pSB326-Actin1-Bt-RAG1-FLP，结构示意图如图2所示。

实施例4：无标记基因及精米中无Bt抗虫基因的转基因水稻的产生

转基因水稻的获得方法是采用现有的技术(Pan G.，et al.，Map-based  cloning of a novel rice cytochrome P450 genes Cyp81A6 that confers  resistance to two different classes of herbicides.Plant Molecular Biology， 2006，61：933-943).选取饱满的水稻品种日本晴种子，去壳，诱导产生愈 伤组织作为转化材料。通过电激法将实施例3中获得的T-DNA载体 pSB326-Actin1-Bt-RAG1-FLP导入农杆菌EHA105。取含T-DNA载体 pSB326-Actin1-Bt-RAG1-FLP的农杆菌划板，挑单菌落在LB培养基中培 养，为水稻转化准备农杆菌。

将待转化的水稻愈伤组织在无菌滤纸上稍微吸干，将愈伤组织放入 OD₆₀₀为0.5的农杆菌菌液中(含乙酰丁香酮，200μmol/L)，室温下放置 40分钟后弃菌液，再将水稻愈伤组织置于无菌滤纸上吸去多余菌液，把愈 伤组织转移到共培养基上培养50-55小时，将表面没有很多农杆菌的愈伤 组织转入抑菌培养基上培养5-7天，而后再将表面没有农杆菌的愈伤组织 转入筛选培养基上培养6周(每两周继代一次)。把筛选后获得的抗性愈 伤转移到预分化培养基上(先暗培养5-7天，而后16小时光照分化发芽) 4-6周，待抗性幼苗长成后转移到生根培养基上生根，最后将再生植株洗 去培养基于温室中或田间培养，直至收获种子。用Bt基因和潮霉素磷酸 转移酶基因(以下简称HPH基因)的引物PCR鉴定T0代植株，收获含 有Bt基因和HPH基因的T0代植株上的种子。将T0代植株上的种子种植 成T1代转基因苗，Bt基因和HPH基因引物鉴定转基因苗，选择收获仅 有Bt基因的转基因苗的种子，同时鉴定精米中的Bt基因，获得精米中无 Bt基因的转基因水稻。