桑树花粉介导转基因方法

摘要

本发明公开了一种桑树花粉介导转基因方法，该方法通过桑树花粉的收集与保存、农杆菌与花粉的混合、桑树授粉等步骤实现。与常规育种方法一样，该方法直接借用花粉杂交便可完成植物遗传转化途径，从而简化植物转基因育种程序，并能缩短育种时间。此外，该方法还能为那些组织培养困难的开花植物提供一种可行的遗传转化方法。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及花粉介导的遗传转化方法，具体是桑树花粉介导转基因方法。

背景技术

桑树作为一种重要的经济植物，在蚕业、林业都有极其重要的地位。杂交育种与多倍体育种作为桑树育种的主要方法，培育出了较多的优良品种。但由于桑树生长周期长，遗传杂合性高，许多性状的遗传机理尚不明了，前述的育种方法很难定向培育出蚕桑所需要的新型品种，但桑树基因（分子）育种具有独特的优势，可达此目的。随着分子生物学的发展，通过植物基因工程的方法创造新品种成为可能。农杆菌感染组培外植体作为目前最为有效的手段，在水稻、小麦等主要农作物中得到广泛应用，但是在木本植物中获得的转基因植株较少，其主要原因在于该方法获得的转基因苗大多是嵌合体，要经过第二代才能形成稳定的品种，需要很长的时间，这不仅加长了育种周期，而且加大了育种难度；二是木本植物组培外植体的诱导培养较为困难。另外，农杆菌感染组培外植体进行转基因研究的另一局限，是那些组培困难的植物尚无法采用此途径。到目前为止，尚无有关桑树花粉介导转基因方法的研究报道。

发明内容

针对目前桑树组织培养、遗传转化周期较长的问题，本发明的目的在于提供一种快速高效的桑树花粉介导转基因方法，该方法包括以下步骤：

（1）桑树花粉的收集：

选取雄花花药刚发白的刚进入成熟期的雄花，常规方法收集花粉，置于冰箱4℃保存备用；

（2）花粉与农杆菌混合：

将含有植物表达载体的农杆菌在YEP培养基中培养至OD=1.5-2.4之间，6，000 rpm离心5min收集菌体，采用感染培养基重悬菌体2次，最后稀释OD=2.0；称取花粉与农杆菌混合，比例为0.1g：5ml，颠倒混匀；用抽真空的方式将含有载体的农杆菌与花粉混合，即将花粉与农杆菌混合置于真空泵中，0.09倍标准大气压即9119Pa处理10min，然后常压2-3min，再抽真空5min，即得花粉与农杆菌混合液；

感染培养基：1/2 MS培养基；44nM 6-BA；0.02% Silwet L-77；5%蔗糖；PH=5.7-6.0

（3）授粉：

方式一：先用未经处理的普通花粉授粉于雌花后，立即滴注含有载体的农杆菌菌液；

方式二：用毛笔将步骤（2）所得花粉与农杆菌混合液授粉至桑树雌花柱头上；

（4）套袋处理：

授粉完毕后雌花用硫酸纸套袋处理24h避免感杂，24-48h之内补滴含有载体的农杆菌菌液一次，再套袋24h，待雌花完全受精后，再除去硫酸纸袋，改用细纱网罩住桑椹，直至果实成熟收集种子。

上述方法步骤（2）中，将含有载体的农杆菌与花粉混合的方式也可用常规的涡旋方式。

上述方法中，选取杂交优势较好的雄树上的雄花作杂交父本，如育2号（中国农业科学院蚕业研究所，湖桑39号X广东桑，1971）、西大广选（西南大学生物技术学院，广东杂交桑、沙二X伦109号，2006）等，雌花选取杂交优势较好，开花整齐，结实多的品种，如红果1号（陕西省桑蚕丝绸研究所，实生桑选育，2001）、红果2号（西北农林科技大学蚕桑丝绸研究所，自然芽变，2001）、中桑5801号（中国农业科学院蚕业研究所，湖桑38号X广东桑，1958）等。上述品种均为公知公用桑树品种。

附图说明

图1为转基因种子在含有卡那霉素的双蒸水中生长情况图：其中A图为对照组，采用空白感染培养基混合花粉后授粉所得的种子，B图为转基因种子，图中生长良好的植株为抗性植株。

图2为抗性植株的PCR检测图：其中1-2泳道为阴性对照，第3-12泳道为抗性植株，第13泳道为DNA maker（Trans2000）。

本发明的优点是：

通过花粉介导的转基因方法可以省去组培外植体，它与常规育种方法一样，直接借用花粉杂交便可完成植物遗传转化途径，从而简化植物转基因育种程序，并能缩短育种时间。此外，该方法还能为那些组织培养困难的开花植物提供一种可行的遗传转化方法。花粉介导的转基因方法可应用于其他开花植物的遗传转化、分子改良及获得的转基因品种。

具体实施方式

实施例1：桑树的遗传转化：将标记基因NPT II导入桑树基因组中，具体步骤如下：

（1）桑树花粉的收集：

取花药刚发白的桑树育2号雄花，铺在经消毒后的白纸上，在28℃烘箱中保温一天，轻轻拨开花药，收集到经消毒后的培养皿中，置冰箱4℃保存备用；

（2）花粉与农杆菌混合：

将含有植物表达载体的农杆菌在YEP培养基中培养至OD=1.5-2.4之间，6，000 rpm离心5min收集菌体，采用感染培养基（1/2 MS培养基；44nM 6-BA；0.02% Silwet L-77；5%蔗糖；PH=5.7-6.0）重悬菌体2次，最后稀释成OD=2.0；称取花粉与农杆菌混合，比例为0.1g：5ml，颠倒混匀；将花粉与农杆菌混合液置于真空泵中，0.09倍标准大气压（9119Pa）处理10min，然后常压2-3min，再抽真空5min；

（3）授粉与套袋处理

用消毒后的毛笔将花粉与农杆菌混合液授粉至红果1号雌花柱头上，然后用硫酸纸套袋处理24h避免感杂，24-48h之内补授粉一次，再套袋24h，待雌花完全受精后，再除去硫酸纸袋，改用细纱网罩住桑椹，直至果实成熟收集种子。

转基因苗的分子检测

实施例2：种子的抗性筛选

将收集的种子在双蒸水中浸泡24小时后取出，再置于含有50mg/ml卡那霉素的双蒸水浸湿的棉花上，28℃光照培养，将生长状态良好的小苗移至营养土中培养。

实施例3：抗性植株的PCR检测

采用CTAB法提取抗性植株幼嫩叶片的基因组，根据卡那霉素抗性基因NPT II的基因序列设计引物（引物序列为NPT II-F：5’- TACCGTAAAGCACGAGGAAGC-3’，NPT II-R：5’- TATGACTGGGCACAACAGACA -3’，扩增条件为94℃预变性4 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，运行30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存），对提取的基因组进行扩增，最后从300株转基因苗子中检测到10株抗性植株，其中10株都有PCR阳性，转基因效率为3.33%。