下呼吸道病原菌的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明设计了肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群的特异性引物，并建立了可同时检测这些细菌的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法，采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。所述试剂盒包括：10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，TaqDNA聚合酶，BSA，肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群阳性对照DNA，肺炎链球菌引物，b型流感嗜血杆菌引物和结核分枝杆菌复合群引物。该试剂盒可同时快速检测下呼吸道标本中肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）、b型流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzaetypeb）与结核分枝杆菌复合群（Mycobacteriumtuberculosiscomplex）。本发明建立的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法快速、简便、特异、灵敏，可用于肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群感染的快速诊断与流行病学调查。

说明书

技术领域

本发明涉及下呼吸道感染性疾病的分子诊断技术领域，具体涉及多重降落PCR 检测方法在下呼吸道标本中肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b）与结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex）检测中的应用。

背景技术

 肺炎链球菌与b型流感嗜血杆菌是引起社区获得性肺炎的主要病原菌。肺炎链球菌与b型流感嗜血杆菌疫苗尚未纳入我国的一类免疫规划中。结核分枝杆菌复合群是一群可引起结核的分枝杆菌，包括结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）、卡介苗（Mycobacterium bovis BCG）、非洲分枝杆菌（Mycobacterium africanum）、田鼠分枝杆菌（Mycobacterium microti）、卡耐提分枝杆菌（Mycobacterium canettii）、海豹分枝杆菌（Mycobacterium pinnipedii）与Mycobacterium mungi。WHO报道2009年全球有170万人死于结核。当前肺炎链球菌与b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌复合群的常规检测方法基于培养法，操作耗时且灵敏度低。近来，PCR技术改善了细菌检测的灵敏度。Kim, W.等（Kim, W., et al., Identification of the cpsA gene as a specific marker for the discrimination of Streptococcus pneumoniae from viridans group streptococci. Journal of Medical Microbiology, 2010. 59(10): p. 1146-1152.）发现cpsA基因可作为检测肺炎链球菌的特异性标志物。Marty, A等（Marty, A., et al., Detection of Haemophilus influenzae type b by real-time PCR. J Clin Microbiol, 2004. 42(8): p. 3813-5.）建立了基于荚膜位点II区（region II of the capsulation locus，cap）特异检测b型流感嗜血杆菌的实时定量PCR。Hellyer, T等（Hellyer, T., et al., Specificity of IS6110-based amplification assays for Mycobacterium tuberculosis complex. J. Clin. Microbiol., 1996. 34(11): p. 2843-2846.）发现基于插入序列IS6110的PCR可特异检测结核分枝杆菌复合群。Korbie, D.J.等（Korbie, D.J. and J.S. Mattick, Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification. Nat. Protocols, 2008. 3(9): p. 1452-1456.）发现降落PCR可提高PCR的特异性与灵敏度。当前尚无可同时检测肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群的多重PCR报道。本发明建立的多重降落PCR可同时直接检测下呼吸道标本中的肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群，费时少，具高度特异性与灵敏性，有利于肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群感染的快速诊断与流行病学调查。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可同时快速检测下呼吸道标本中肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群的多重PCR检测试剂盒及检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术发案实现的：

一种下呼吸道病原菌多重降落PCR检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，MgCl₂，dNTP，Taq DNA聚合酶，BSA，肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群阳性对照DNA，肺炎链球菌引物，b型流感嗜血杆菌引物和结核分枝杆菌复合群引物；

所述肺炎链球菌引物序列为：5’- AGTGGTAACTGCGTTAGTCCTA-3’（SEQ ID NO.1）与5’- GTGGCGTTGTGGTCAAGAG -3’ （SEQ ID NO.2）；

所述b型流感嗜血杆菌引物序列为：5’- ATGTTAGATCGTGCGGATACTC-3’ （SEQ ID NO.3）与5’- GCGAGGAACAGAACCATCAG-3’ （SEQ ID NO.4）；

所述结核分枝杆菌复合群引物序列为：5’- GGTAGCAGACCTCACCTATGT-3’ （SEQ ID NO.5）与5’- CTCTGGCGTTGAGCGTAGTA-3’ （SEQ ID NO.6）。

本发明还公开了应用上述试剂盒的检测方法：

（一）   提取待检样本DNA

（二）   多重降落PCR法扩增检测待检样本DNA中的cpsA、cap基因与IS6110序列，具体步骤如下：

反应体系：                         25 μl

H₂O                               11.55 μl

缓冲液（10×PCR）             2.5 μl

BSA(10 mg/ml)                   0.25 μl

Sp_cpsA-F（10 μmol/L）         1 μl

Sp_cpsA-R（10 μmol/L）         1 μl

Hib_cap-F（10 μmol/L）          1 μl

Hib_cap-R（10 μmol/L）          1 μl

TB_IS6110-F（10 μmol/L）     1 μl

TB_IS6110-R（10 μmol/L）       1 μl

MgCl₂(25 mM)                        2 μl

dNTP(10 mM)                       0.5 μl

Taq DNA聚合酶（5U/μl）        0.2 μl

DNA 模板                             2 μl

引物：

肺炎链球菌引物为：

  Sp_cpsA-F：5’- AGTGGTAACTGCGTTAGTCCTA-3’ （SEQ ID NO.1）

  Sp_cpsA-R：5’- GTGGCGTTGTGGTCAAGAG -3’ （SEQ ID NO.2）

b型流感嗜血杆菌引物为:

  Hib_cap-F：5’- ATGTTAGATCGTGCGGATACTC-3’ （SEQ ID NO.3）

  Hib_cap-R：5’- GCGAGGAACAGAACCATCAG-3’ （SEQ ID NO.4）

结核分枝杆菌复合群引物为：

  TB_IS6110-F：5’- GGTAGCAGACCTCACCTATGT-3’ （SEQ ID NO.5）

  TB_IS6110-R：5’- CTCTGGCGTTGAGCGTAGTA-3’ （SEQ ID NO.6）

（三）   PCR反应循环参数如下：

94℃ 5min；94 ℃ 30s, 65℃ (每循环降低0.5℃) 30 s, 72℃ 1 min，20个循环；94 ℃ 30s, 55 ℃ 30s,72℃ 1 min,20 个循环；72℃ 7 min；

（四）   电泳检测鉴定：

对多重降落PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有653 bp、177 bp、494 bp条带则分别代表检出肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌复合群。

有益效果：本发明所建立的多重降落PCR可克服常规培养的耗时长、灵敏度低等问题，具有快速、简便、特异、灵敏度高等特征。可于当天出检测结果报告，可同时检测肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌复合群，对三者DNA的检测下限分别达6.3pg、0.2 pg与0.02 pg。该多重降落PCR可广泛用于肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌复合群感染的快速诊断与流行病学调查。

附图说明

图1为建立的多重降落PCR的特异性检测结果；M：DL2000 DNA 分子质量标准；泳道1－15模板依次对应为：b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、卡介苗、阴性对照、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、卡它莫拉菌（Moraxella (Branhamella) catarrhalis）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenza）、耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）。

具体实施方式

实施例1：

    痰标本预处理：痰标本应用生理盐水洗涤2次，加入等量的1%胰酶（当天现配现用）于37℃消化90 min。

提取痰标本中的细菌DNA：取已消化的痰标本1.5 ml用Takara minibest细菌基因组提取试剂盒（Takara，大连宝生）提取痰标本中的细菌DNA。提取的DNA直接用于PCR扩增或置于－20℃保存备用。

PCR扩增总体系25 μl，在200 μl PCR小管内依次加入11.55μl双蒸水，2.5μl缓冲液（10×PCR），BSA(10 mg/ml)0.25μl、引物（10 μmol/L）Sp_cpsA-F、Sp_cpsA-R、Hib_cap-F、Hib_cap-R、TB_IS6110-F、TB_IS6110-R各1 μl，2 μl MgCl₂(25 mM)，0.5 μl dNTP(10 mM)，0.2 μl Taq DNA聚合酶（5U/μl）,2 μl 提取的痰标本DNA。同时设肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌阳性模板对照与阴性对照（双蒸水作为模板）。手指轻弹混匀，短暂离心后放入PCR仪。

引物序列如下：

肺炎链球菌引物为：Sp_cpsA-F：5’- AGTGGTAACTGCGTTAGTCCTA-3’，Sp_cpsA-R：5’- GTGGCGTTGTGGTCAAGAG -3’，扩增片断长度653 bp； b型流感嗜血杆菌引物为: Hib_cap-F：5’- ATGTTAGATCGTGCGGATACTC-3’，Hib_cap-R：5’- GCGAGGAACAGAACCATCAG-3’，扩增片断长度177 bp；结核分枝杆菌复合群引物为：TB_IS6110-F：5’- GGTAGCAGACCTCACCTATGT-3’，TB_IS6110-R：5’- CTCTGGCGTTGAGCGTAGTA-3’，扩增片断长度494 bp。

设置PCR反应循环参数：94℃ 5min；94 ℃ 30s, 65℃ (每循环降低0.5℃) 30 s, 72℃ 1 min，20个循环；94 ℃ 30s, 55 ℃ 30s,72℃ 1 min,20 个循环；72℃ 7 min。

扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，上样量为5 μl与6×上样缓冲液混匀后加入胶孔中，于1×TAE溶液中，在100V电压下，电泳30 min，电泳后经1 μg/μl的溴化乙锭浸泡染色10－20 min后，于凝胶成像分析系统中分析检测结果如图1。如阴性对照无条带，阳性对照出现对应大小的条带，检测样本出现653 bp大小的条带，则判定检出肺炎链球菌，出现177 bp 大小的条带判定检出b型流感嗜血杆菌，出现494 bp大小的条带判定检出结核分枝杆菌复合群；如阳性对照无对应条带出现或阴性对照出现非特异性条带，则判为实验失败，需重新检测。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏大学

 

<120>  下呼吸道病原菌的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法

 

<130> 

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

agtggtaact gcgttagtcc ta                                              22

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gtggcgttgt ggtcaagag                                                  19

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

atgttagatc gtgcggatac tc                                              22

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gcgaggaaca gaaccatcag                                                 20

 

 

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ggtagcagac ctcacctatg t                                               21

 

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ctctggcgtt gagcgtagta                                                 20