一种豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法

摘要

一种豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，属于植物提取生物活性产品技术领域。本发明涉及采用直接将豌豆研磨成粉，水浸提，高速离心，上清液热处理，再高速离心，上清液经DEAE-52离子交换层析得纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉。本发明所制备的天冬氨酸蛋白酶抑制剂对天冬氨酸蛋白酶家族中胃蛋白酶、凝乳酶有较高的抑制活性，直接从豌豆中提取不仅成本低，且应用安全，在食品添加剂、医药和农业等领域有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

一种豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，具体说是采用豌豆研磨成粉，用水浸提，高速离心，热处理，上清液通过DEAE-52离子交换层析，获得较纯的天冬氨酸蛋白酶抑制剂制品，属于植物提取生物活性产品技术领域。

背景技术

生物活性物质是指有些食物含有多种具有生物活性的化合物，能与机体作用后引起各种生物效应。它们种类繁多，有糖类、脂类、蛋白质多肽类、甾醇类、生物碱、甙类等等。它们主要存在于植物性食物中，有的对人有利，有的有害。在预防和治疗疾病，食品等领域，生物活性物质仍是一个值得研究的课题，如何开发利用生物活性物质对人体有利的一面，避免或消除其有害的一面值得我们进一步去探讨。目前国内外已从豌豆中分离出多种活性物质。

蛋白酶抑制剂是一类具有结合并使蛋白质失活从而对生物体内的某些酶起抑制作用的活性物质。天然蛋白酶抑制剂是一种能够抑制蛋白水解酶活性的小分子蛋白或多肽，它的来源十分广泛，在很多的动植物的组织器官及某些微生物中都有存在。按照其抑制的目标蛋白酶的活性中心的不同，大致可以分为以下几种：丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin）：如胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor IT）；半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cys-C）：如木瓜蛋白酶抑制剂；天冬氨酸蛋白酶抑制剂：如HIV蛋白酶抑制剂，胃蛋白酶抑制剂、蛋白酶A抑制剂和血管紧张肽原酶抑制剂；金属蛋白酶抑制剂：如羧肽酶抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂（ACE）等。蛋白酶抑制剂在食品、医药和农业等领域有非常广泛的应用前景。例如蛋白酶抑制剂具有抑制昆虫肠道中蛋白酶的活性，可作为生物农药或利用基因工程提高植物的抗虫性。

天冬氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白水解酶，它的活性中心由两个天冬氨酸残基组成。天冬氨酸蛋白酶具有消化食物蛋白、降解抗原、病毒蛋白及酶的成熟、调整血压等方面的活性功能，这些蛋白酶是导致艾滋病、恶性肿瘤、高血压等世界上几种难治疾病的发病因素之一。深入了解天冬氨酸蛋白酶抑制剂，对治疗这些顽固性疾病将有一定的帮助。

目前国内外报道的天冬氨酸蛋白酶抑制剂大多数都是通过化学法合成的，往往因其药理毒性和安全性得不到保证限制了其应用，天冬氨酸蛋白酶抑制剂广泛存在于动植物的组织器官及某些微生物中，因此从天然产物中开发此类蛋白酶抑制剂日益受到人们的关注。

豌豆属豆科植物，学名为Pisum sativum L.。我国是世界上最大的豌豆种植国，年产豌豆500万吨，占世界总产量的40.7%。豌豆所含营养极为丰富，它不仅能提供大部分的碳水化合物(淀粉含量约为50%)，而且是供人们食用和动物饲用的重要蛋白质资源之一，豌豆含有20%～24% 的蛋白质，氨基酸的比例比较平衡。目前，市场上一大部分豌豆被用来制作粉丝。粉丝主要是利用豌豆中的淀粉，豌豆中的蛋白质就随着污水被排放掉了，不仅污染环境，同时也造成了蛋白资源的浪费。因此，开展豌豆资源的深度加工和全面综合利用方面的研究意义重大。

发明内容

本发明目的是提供一种豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，采用豌豆研磨成粉，用水浸提，高速离心，热处理，高速离心获得粗天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经DEAE-52离子交换层析，获得较纯的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，对胃蛋白酶的最佳抑制反应时间为1小时；热稳定性较好，100℃保温1小时后抑制活性几乎没有任何损失；pH稳定范围为2.0～7.0。对其进行底物特异性分析，知该抑制剂对同为天冬氨酸族蛋白酶的胃蛋白酶和凝乳酶有较高的抑制活性，对几种属于其它族的蛋白酶（木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶等）几乎没有抑制活性。

本发明的技术方案：一种豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，采用豌豆研磨成粉，用水浸提，高速离心，上清液进行热处理，再高速离心，上清液通过DEAE-52离子交换层析得纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经过真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉；其工艺为：

A豌豆上清液的制备：

（1）豌豆：市售；

（2）水浸提：豌豆研磨成粉后，与水按g/mL计1: 4（w/v）在4℃下进行浸提2 h，期间每隔半小时搅拌一次。浸提后以8000 r/min、4℃下离心30 min，取上清液；

（3）热处理：将上清液进行60℃下水浴20 min，8000 r/min、4℃下离心30 min，取上清；上清中蛋白质与糖的浓度比约为0.98~1.12，对胃蛋白酶抑制单位约为0.97 ~1.03 IU/mL，回收率 86.5%~ 89.4%；

B分离天冬氨酸蛋白酶抑制剂：

（4）离子交换层析：DEAE-52离子交换色谱柱规格为30 cm×2.2 cm，平衡缓冲液为10 mmol/L的磷酸钠缓冲液(pH6.8)。洗脱模式：以平衡缓冲液洗脱2 倍柱体积后，再以平衡缓冲液依次加含不同浓度 0.2，0.4，0.6，0.8 mol/L NaCl的磷酸缓冲液进行阶段洗脱，流速为1.5 mL/min，进样量20 mL，280 nm波长紫外检测，结果如图1显示：0.2 mol/L NaCl的磷酸缓冲液梯度下收集的峰液对天冬氨酸蛋白酶具有较强的抑制活性，其它梯度下收集的峰则无抑制活性，收集对胃蛋白酶具有较高抑制活性的峰1；

峰1收集液中蛋白质与糖的浓度比约为2.16~2.45，对胃蛋白酶（2800U）的半抑制浓度IC₅₀值约为1.56~1.87 mg/mL，对胃蛋白酶抑制单位约为8.93 ~9.42 IU/mL，回收率 70.4~ 73.8 %。

（5）干燥成粉：采用真空冷冻干燥的方法将DEAE-52 离子交换层析以含0.2 mol/L NaCl的磷酸缓冲液梯度洗脱下收集的峰1进行冷冻干燥，即为天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉。

抑制剂底物特异性分析：用上述（5）中得到的抑制剂冷冻粉配成5 mg/mL的溶液，测定其对不同蛋白酶的抑制活性，结果如图2。

由图2知，从豌豆中所产的天冬氨酸蛋白酶族中的胃蛋白酶和凝乳酶均有较强的抑制活性，抑制单位分别为 9.13 IU/mL和8.57 IU/mL，对属于半胱氨酸族蛋白酶的木瓜蛋白酶，丝氨酸族的胰蛋白酶及属于金属蛋白酶族的中性蛋白酶等几乎都没有抑制活性。

酶活测定方法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶活力测定采用常规蛋白酶活力测定法；凝乳酶活力测定采用 Arima 法。

酶活定义：40℃时，每分钟分解血红蛋白产1 μmol酪氨酸所需酶量即为一个酶活单位，单位用U表示。

抑制单位定义：依上述方法测定酶活，按抑制率=（抑制前酶活-抑制后酶活）/抑制前酶活×100%计算抑制率，规定在上述条件下，对胃蛋白酶抑制率达10%的抑制剂活性为一个抑制单位，单位用IU表示。

IC₅₀值定义：在最适条件下，对一定量蛋白酶抑制率达50%时的抑制剂添加量。

本发明的有益的效果：本发明原料豌豆可以用豌豆加工废料代替，这样可以消除豌豆加工厂对周边环境的污染，防止资源浪费，变废为宝。本发明所制备的抑制剂专一性抑制天冬氨酸蛋白酶的活性，直接从豌豆中提取具有取材容易，成本低，杂质相对较少，应用广泛，不影响食品的安全性等众多优点。采用热处理提取天冬氨酸蛋白酶抑制剂不仅简便、易操作、成本低，而且易于工业化生产，在医药、食品添加剂及病虫害防治等领域有很好的应用前景。

附图说明

图1 豌豆浸提液的DEAE-52离子交换色谱图。

图2豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制剂对不同蛋白酶抑制效果比较。

图3一种豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备工艺流程图。

具体实例方式

实施例1  

将50 g豌豆洗净立即烘后，研磨成粉，按1: 4（w/v）的比例加入超纯水200 mL，放入冰箱，在4℃下进行浸提2 h，期间每隔半小时搅拌一次。浸提完后，将浸提液以8000 r/min、4℃下离心30 min，得上清液175 mL，将上清液在60℃下进行水浴20 min，冷却至室温，8000 r/min、4℃下离心30 min，得上清液160 mL，测得蛋白质与糖的浓度比约为0.98，对胃蛋白酶抑制单位约为0.97 IU/mL，回收率 87.6%；将上清液进行离子交换层析，每次取20 mL粗抑制剂进行DEAE-52离子交换层析，为30 cm×2.2 cm，平衡缓冲液为10 mmol/L的磷酸钠缓冲液(pH 6.8)。洗脱模式：以平衡缓冲液洗脱2 倍柱体积后，再以平衡缓冲液依次加0.2，0.4，0.6，0.8 mol/L不同浓度的NaCl的磷酸缓冲液进行阶段洗脱，流速为1.5 mL/min，280 nm波长紫外检测。收集0.2 mol/L NaCl的磷酸缓冲液梯度下的峰1，测得蛋白质与糖的浓度比约为2.35，对胃蛋白酶（2800U）的半抑制浓度IC₅₀值约为1.56 mg/mL，对胃蛋白酶抑制单位约为9.42 IU/mL，回收率 72.8 %。

实施例2

将50 g豌豆洗净立即烘后，研磨成粉，按1: 4（w/v）的比例加入超纯水200 mL，放入冰箱，在4℃下进行浸提2 h，期间每隔半小时搅拌一次。浸提完后，将浸提液以8000 r/min、4℃下离心30 min，得上清液175 mL，将上清液在60℃下进行水浴20 min，冷却至室温，8000 r/min、4℃下离心30 min，得上清液160 mL，测得蛋白质与糖的浓度比约为1.05，对胃蛋白酶抑制单位约为0.99 IU/mL，回收率 88.4%；将上清液进行离子交换层析，每次取20 mL粗抑制剂进行DEAE-52离子交换层析，为30 cm×2.2 cm，平衡缓冲液为10 mmol/L的磷酸钠缓冲液(pH 6.8)。洗脱模式：以平衡缓冲液洗脱2 倍柱体积后，再以平衡缓冲液依次加0.2，0.4，0.6，0.8 mol/L不同浓度的NaCl的磷酸缓冲液进行阶段洗脱，流速为1.5 mL/min， 280 nm波长紫外检测。收集0.2 mol/L NaCl的磷酸缓冲液梯度下的峰1，测得蛋白质与糖的浓度比约为2.36，对胃蛋白酶（2800U）的半抑制浓度IC₅₀值约为1.74 mg/mL，对胃蛋白酶抑制单位约为9.16 IU/mL，回收率 72.9 %。

实施例3

将50g豌豆洗净立即烘后，研磨成粉，按1: 4（w/v）的比例加入超纯水200 mL，放入冰箱，在4℃下进行浸提2 h，期间每隔半小时搅拌一次。浸提完后，将浸提液以8000 r/min、4℃下离心30 min，得上清液175 mL，将上清液在60℃下进行水浴20 min，冷却至室温，8000 r/min、4℃下离心30 min，得上清液160 mL，测得蛋白质与糖的浓度比约为1.06，对胃蛋白酶抑制单位约为0.98IU/mL，回收率 87.4%；将上清液进行离子交换层析，每次取20 mL粗抑制剂进行DEAE-52离子交换层析，为30 cm×2.2 cm，平衡缓冲液为10 mmol/L的磷酸钠缓冲液(pH 6.8)。洗脱模式：以平衡缓冲液洗脱2 倍柱体积后，再以平衡缓冲液依次加0.2，0.4，0.6，0.8 mol/L不同浓度的NaCl的磷酸缓冲液进行阶段洗脱，流速为1.5 mL/min，280 nm波长紫外检测。收集0.2 mol/L NaCl的磷酸缓冲液梯度下的峰1，测得蛋白质与糖的浓度比约为2.45，对胃蛋白酶（2800U）的半抑制浓度IC₅₀值约为 1.87 mg/mL，对胃蛋白酶抑制单位约为8.93 IU/mL，回收率 73.8 %。