建兰开花整合基因-CeFT基因及其应用

摘要

本发明公开了一种建兰开花整合基因CeFT及其应用。CeFT基因的序列如SEQ ID NO.1中的第87位至第617位碱基所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次从建兰中克隆到FT同源基因-CeFT基因，并且通过实验证明该基因能够影响植物生长发育进程，缩短了童期，并促使植物提前开花。因此，本发明提供的建兰CeFT基因为基因工程改良植物的生长进程，对植物的花期进行调控提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种在建兰中表达的开花整合基 因-CeFT基因、含有该基因的重组植物表达载体，以及CeFT基因在缩短植物童期，促进植 物提前开花中的应用

背景技术：

FT(FLOWERING LOCUS T)基因是花期调控途径中的关键基因。它位于花发育途径中的 汇集点，整合来自光周期途径、春化途径和自主途径等不同花发育途径的信号，在植物花发 育中发挥着重要作用。

拟南芥的FT基因属于FT/TFL1基因家族，又称为磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyletha  nolamine-binding protein，PEBP)基因家族，因其蛋白易与磷脂酰乙醇胺结合而得名。根据PE BP基因家族成员在拟南芥和水稻中的系统发生关系以及对开花时间的调控作用，将其分为3 个亚家族：(1)FT亚家族(FT-like)，包括FT基因、TSF基因，起促进开花作用，TSF与FT功能部 分冗余；(2)MFT亚家族(MFT-like)，包括MFT基因，在开花时间调控上与FT功能冗余；(3)TF L1亚家族(TFL1-like)，包括了TFL1、BFT和ATC基因，起开花抑制作用(Chardon and Damerv  al，2005)。在植物PEBP基因家族中，FT和TFL1基因是研究最为清楚的两个成员。FT为开花 促进因子，TFL1为开花抑制因子，它们在决定开花时间的过程中起关键作用。FT蛋白和TFL 1的晶体结构存在一定差异，这种差异导致它们成花过程中起相反功能。Hanzawa等(2005)研 究表明替换一个氨基酸，即FT中的Tyr85和TFL1中的His88，便能使FT与TFL1功能互换。这两 个基因通过抑制茎端分生组织形成花原基，来延长植株的营养生长过程，从而延迟植株的生 殖生长进程。

FT蛋白是成花素的主要组成部分，在不同的开花遗传途径中，上游关键基因调控FT基 因，使FT蛋白从韧皮部移动到茎顶端分生组织(SAM)，与带碱性亮氨酸拉链蛋白(basic  region-leucine zipper，b-ZIP)转录因子FD(FLOWERING LOCUS D)在茎尖通过蛋白质的相互作 用来促进成花转变，并通过转录激活花分生组织特性基因AP1(APETALA1)来启动花发育过程。

在拟南芥中超表达以下植物的FT同源基因，均能显著促进开花：拟南芥(Abe et al.，2005)， 杨树(Hsu et al.，2006)，番茄(Lifschitz et al.，2006)，矮牵牛(Hayama et al.，2007)，葡萄(Carmona  et al.，2007)，南瓜(Lin et al.，2007)以及水稻(Kojima et al.，2002)等。而在番茄(Lifschitz et al.， 2006)，杨树(Bohlenius et al.，2006；Hsu et al.，2006)，小麦(Yan et al.，2006)，矮牵牛(Hayama et al.， 2007)等植物中异源表达FT或FT同源基因同样也能引起早花现象。尤其是在木本植物杨树 中，野生型需要经过8-20年才能开花，而超表达PtFT1的毛果杨在培养皿中培养四周后便可 观察到柔荑花序(Bohlenius et al.，2006)。反之，在拟南芥和水稻中，采用RNAi或miRNA手 段使FT基因的表达下调后，植株的开花时间延迟(Kojima et al.，2002；Komiya et al.，2008)。这 些结果表明FT及其同源基因是植物开花所必需的。

FT不仅在成花转变过程中起重要作用，而且还参与调节生长发育的一些过程。如调控拟 南芥果荚和种子的发育过程，FT mRNA在子叶中表达量比较高，而在顶端分生组织表达量非 常低。另外，在杨树中，FT同源基因PtFT1表达水平还是秋季生长停滞和芽休眠的一个关键 性决定因素，秋季短日照通过调控PtFT1的活性从而诱导不同纬度的林木群体生长停滞和芽 休眠的启动。

建兰(Cymbidium ensifolium)是兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)中的小花型地生种，其花香 馥郁，色泽淡雅，花姿秀美，叶态飘逸，备受欢迎，为我国传统铭花之一，具有很好的市场价值。 建兰的幼年期较长，约3年左右，生产成本高，因此如何花期调控缩短建兰的童期，使其提早 开花有很重要的理论意义和经济意义。此外我国对花卉的传统消费期主要集中在春节和其它 重要节假日，要实现建兰的产业化还要能够应节上市，其商品价值才会更高。建兰的花期通 常在6-10月，一年可多次开花，但在春节、元旦等重要节日中却不能开花，此外，建兰的花期 一般只有1个月，作为年宵花卉还需在花期和延长开花时间上进行调控。

目前，在建兰以及相关的国兰的花期调控方面的研究比较少，潘瑞炽和叶庆生发现低温 可促进墨兰和春兰的花芽分化和发育，高温(30/25℃和25/20℃)有利于建兰花芽分化与发育。 但有关建兰的成花机理与相关基因克隆和功能研究还未见报道。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种在建兰中表达的开花整合基因-CeFT基因及其编码蛋 白和含有该基因的重组植物表达载体。

本发明的第二个目的是提供CeFT基因在缩短植物童期，促进植物提前开花中的应用， 如缩短拟南芥童期，促进其提前开花。

本发明以建兰“金丝马尾”(C.ensifolium‘Jin Si Ma Wei’)的花芽为材料，提取其总RNA， 再将mRNA逆转录成cDNA第一链，以该cDNA第一链模板，根据FT的同源基因设计引物， 利用RT-PCR和RACE的方法扩增拼接获得全长cDNA序列，该cDNA序列长度为773bp， 其序列如SEQ ID NO.1所示，其开放阅读框为自5’端第87位至第617位碱基，共531bp，将 此开放阅读框命名为CeFT基因，其编码的蛋白的氨基酸序列具有176个氨基酸残基，其序 列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为CeFT蛋白。

将建兰的CeFT基因编码的蛋白质序列用ClustalW2分析其同源性，结果显示CeFT蛋白 具有FT类蛋白的两个保守基序即14个保守氨基酸序列(LGRQTVYAPGWRQN)和LYN/IYN 三联体，从第25到163个氨基酸中还含有一个保守的PEBP结构域，它与文心兰OnFT的同 源性为94％；与水稻Hd3a、拟南芥FT的氨基酸序列同源性分别为79％，74％，由此可见， CeFT基因是一个新的开花整合基因FT基因。

本发明人将上述CeFT基因与植物表达载体连接，通过农杆菌介导，将含有CeFT基因的 重组植物表达载体转化到拟南芥中，经筛选培养获得含有CeFT基因的转基因拟南芥。通过 实验发现，该转基因拟南芥与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥花期提前，10个转化株的平 均开花时间为22天，而野生型的平均开花时间为31天。由此表明，外源CeFT基因为具有 功能的结构基因，其在宿主拟南芥中实现了超量表达，它缩短了转基因拟南芥的开花时间。

从上述结果分析可以表明，本发明的CeFT基因是一个新的开花整合基因，该基因能缩 短开花时间，从而影响植株的发育。

因此可以将本发明的CeFT基因应用到缩短植物童期，促进植物开花中。本发明的CeFT 基因与植物表达载体连接，通过农杆菌介导进入植物细胞、组织或器官，通过组织培养成转 基因的植物转化体，从而实现缩短植物童期生长期，促进植物开花。所述的植物表达载体可 为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载 体等，如pBI系列载体、pBin系列载体、Gateway^TW系列载体、pCAMBIA系列载体或其它 衍生植物表达载体等，上述载体均为公开销售的商品。

本发明首次从建兰中克隆到FT同源基因-CeFT基因，并且通过实验证明该基因能够影 响植物生长发育进程，缩短了童期，并促使植物提前开花。因此，本发明提供的建兰CeFT 基因为基因工程改良植物的生长进程，对植物的花期进行调控提供了一种有效的技术手段， 具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

附图说明：

图1是建兰CeFT基因推导的氨基酸序列与文心兰OnFT(EU583502)、水稻 Hd3a(BAB61028.1)、拟南芥AtFT(BAA77838.1)等同源基因的氨基酸序列比较图(具有一致性 和相似性的氨基酸分别用黑色和灰色阴影表示)；

图2是通过RT-PCR检测在没有发育花梗的成年建兰植株的根、茎、叶和腋芽中的CeFT基因 表达量的电泳显示图，其中1为根；2为假鳞茎；3为叶；4为腋芽；

图3是通过RT-PCR检测花梗长度达10cm的成年植株的根、茎、叶、腋芽、花梗和花蕾中 的CeFT基因表达量的电泳显示图，其中1为根；2为假鳞茎；3为叶；4为腋芽；5为花梗； 6为花蕾；

图4是表达载体pBI121-35s-CeFT转化农杆菌的PCR鉴定图，其中M为Marker 2000，1-3 为筛选到的阳性克隆编号、+为连接载体pBI121-35s-CeFT质粒阳性对照；-为空载体质粒 pBI121阴性对照。

图5是转基因(CeFT)拟南芥的PCR鉴定图，其中M为Marker 2000、1-14为CeFT转基因 拟南芥株系编号、+为连接载体pBI121-35s-CeFT质粒阳性对照；-为野生型拟南芥阴性对 照。

具体实施方式：

下面结合具体实施例进一步阐释本发明。应理解，这些实施例仅以用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如 J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件， 或按照所用产品生产厂商的使用说明。

实施例1：

一、建兰CeFT基因的克隆及其同源性分析。

(1)以建兰品种“金丝马尾”(C.ensifolium‘Jin Si Ma Wei’)的花芽为试验材料，植物材料在温 室正常条件下生长(L/D，16h/8h；25-28℃)。

(2)RNA提取：用Trizol reagent(购自Invitrogen公司)进行试验材料的总RNA提取，整 个操作过程严格按照Trizol试剂的RNA提取流程说明。

(3)采用M-MLV反转录酶(购自Promgra公司)逆转录mRNA成cDNA第一链，方法按 照试剂说明书进行。

(4)基因的克隆：以逆转录的建兰花芽cDNA第一链为模板，利用引物FT-1F和FT-1R进 行PCR扩增，回收PCR产物，测序，获得205bp的核心片段。

引物：FT-1F：5′-TAGGACGAGTGATTGGTGA-3′

      FT-1R：5′-TCACTTGGACTTGGAGCAT-3′

采用Golden DNA polymerase(TIANGEN)进行PCR扩增，加样体系参照酶的说明书，其 PCR反应程序为：94℃变性4min，随后进行35个循环反应(94℃ 30s，51℃ 45s，72℃ 1min)， 72℃延伸5min。

利用该205bp的核心片段，根据RACE方法，设计扩增3’端序列的引物FT3A和FT3B， 以及扩增5’端序列的引物FT5A和FT5B，引物为：

FT3A：5′-TAGGACGAGTGATTGGTGA-3′

FT3B：5′-TTCAGCAGTAGTGGAGCAG-3′

FT5A：5′GGCTGCTCCACTACTGCTGAAGGCT 3′

FT5B：5′CAAGTACATCACCAATCACTCGTCC 3′

3’端序列PCR扩增反应程序为：采用Golden DNA polymerase(TIANGEN)进行PCR扩 增，加样体系参照酶的说明书，其PCR反应程序为94℃变性3min，随后30个循环反应(94℃ 30s，53℃ 45s，72℃ 1min)，72℃延伸5min。

5’端序列PCR扩增反应程序为：采用Golden DNA polymerase(TIANGEN)进行PCR扩 增，加样体系参照酶的说明书，其PCR反应程序为95℃变性1min，接着5个循环反应(94℃ 30s，72℃ 2min)，再接着5个循环反应(94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 1.5min)，最后30个循环 反应(94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 1.5min)，72℃延伸10min，4℃终止反应。

回收扩增产物，对5’端和3’端序列的扩增序列进行测序，最后与核心片段拼接获得全长 cDNA序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，该序列长度为773bp，该序列的开放阅读框为SEQ  ID NO.1的自5’端第87位至第617位碱基，共531bp，将该开放阅读框命名为CeFT基因， 该基因编码由176个氨基酸残基组成的多肽，命名为CeFT蛋白，蛋白质的pI/Mw分别为 6.42/19848.3。将建兰CeFT基因编码的氨基酸(CeFT蛋白)序列用ClustalW2分析其同源性， 结果显示CeFT蛋白包含区分FT和TFL1蛋白的关键氨基酸残基Tyr(Y)，以及140位的另一 个决定性氨基酸残基Gln(Q)，另外还具有FT类蛋白的两个保守基序即14个保守氨基酸序列 (LGRQTVYAPGWRQN)和LYN/IYN三联体，还有一个保守的PEBP结构域，它与文心兰OnFT 的同源性最高，为94％；与水稻Hd3a、拟南芥FT的氨基酸序列同源性分别为79％，74％， 具体比对见图1。

二、建兰CeFT基因表达模式分析

在建兰未开花期和开花时期，用Trizol reagent(Invitrogen)分别提取建兰植株的未开花 期的根、假鳞茎、叶和腋芽以及开花期的根、假鳞茎、叶、腋芽、花梗和花蕾的总RNA，测 定OD260后定量取出2μgRNA，然后再使用oligo-dT引物和PrimeScript^TM Reverse  Transcriptase(购自Takara公司)进行逆转录反应(方法参考说明书)，以扩增FT核心片 段的特异引物FT-1F：5′-TAGGACGAGTGATTGGTGA-3′，FT-1R： 5′-TCACTTGGACTTGGAGCAT-3′进行PCR扩增，该引物跨越内含子。采用Golden DNA  polymerase(TIANGEN)进行PCR扩增，加样体系参照酶的说明书，其反应程序为94℃变性 4min，随后进行32个循环反应(94℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 1min)，72℃延伸5min。反应产 物以1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结果如图2和3所示，其中对照为来自建兰的ACTIN 基因，扩增该对照的ACTIN基因的引物为：ACTPF：5′-CCTCTCAATCCCAAGGCAAACA-3′， ACTPR：5′-GACCTCGGGGCACCTAAATCTC-3′，采用Golden DNA polymerase(TIANGEN) 进行PCR扩增，加样体系参照酶的说明书，其反应程序为94℃变性4min，随后进行32个循 环反应(94℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 1min)，72℃延伸5min。从图2和图3中可以看出，CeFT 基因在建兰各器官中均有表达，营养生长阶段，CeFT表达水平较低，生殖生长阶段，表达水 平较高。营养生长期CeFT基因在腋芽的表达量最高(图2)；生殖生长期CeFT基因在花蕾的 表达量最高，在花梗、腋芽中的表达量次之，在根和叶中的表达量最低(图3)。

三、建兰CeFT基因在拟南芥中的表达及转基因植株的表型鉴定。

(1)含目的基因CeFT表达载体的构建

以前面逆转录得到的cDNA为模板，使用Takara公司的LA Taq酶进行扩增，反应体系 按说明书，扩增引物为：

CeFT-F  5’CCGTCTAGAATGAATAGAGAGAGAGACTCTTTG 3’

CeFT-R  5’CTTGAATTCTCAATCCTGCATCCTTCTTCCGCC 3’

反应程序为94℃ 4min；94℃ 30sec，60℃ 45sec，72℃ 2min，35cycles；72℃ 5min。

将扩增得到的CeFT基因回收后，与Takara公司的pMD18-T载体连接，转化进入大肠 杆菌中。

提取含有CeFT基因的T载体质粒，利用酶切位点Xba I和EcoR I将CeFT基因从T载 体上切下，与带有35s启动子和nos终止子的植物表达载体pBI121同样用Xba I和EcoR I酶 切后连接，连接酶用T4 DNALigase(购自Takara公司)，具体操作按说明书方法进行，构建 表达载体pBI121-35s-CeFT。

(2)将重组表达载体pBI121-35s-CeFT采用冻融法转化到根瘤农杆菌GV3101中。

从-70℃中取出农杆菌感受态细胞，冰上解冻，加入5μl重组表达载体 pBI121-35s-CeFT，轻轻混匀，冰浴30min。

将此混合物转移置研钵中，液氮速冻1min，迅速转入37℃金属浴中，将其融化， 约2-3min。

向混合物中加入1ml LB，于28℃摇床200rpm培养2-4h。所述的LB液体培养 基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。

将转化产物涂布于LB+Kan(卡那霉素)50mg/L+Genta 25mg/L的平板上，吹干， 封口，放于28℃培养箱培养48小时。

挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，如图4所示，以质粒pBI121-35s-CeFT为阳性(+) 对照，以空载体质粒pBI121为阴性(-)对照，1、2、3都是筛选到的含有目的 基因(CeFT基因)的根瘤农杆菌GV3101克隆阳性克隆。

(3)利用花序浸染法转化拟南芥

挑取一个阳性克隆，接种于LB+Kan(卡那霉素)50mg/L+Genta 25mg/L的液体 培养基中，28℃ 200rpm振荡培养24-36h，使OD₆₀₀＝0.8左右。

将菌液转入无菌的50ml离心管中，5000rpm，15min离心收集菌种，再用同等体 积的渗透培养基(1/2MS+0.5g/L MES+5％ Sucrose，pH5.7)重悬农杆菌，并加入表 面活性剂Silwet，使其终浓度达到0.02％(200μl/L)。所述的MS培养基是本领域 常用培养基，其配方参考(Murashige T and Skoog F，1962)。

取刚开花的拟南芥植株(花苞)于此溶液中浸泡1min。斜置晾干多余的菌液。

将浸染菌液的拟南芥花序盖膜保湿，黑暗培养8小时左右，再揭膜置于光照下正 常管理成熟收获种子。

(4)转基因植株的分子鉴定。

收集当代转基因植株种子(T₀代)，灭菌(10％NaClO 10min，灭菌水漂洗6次)后播种于 含有Kan抗生素(50mg/L)的1/2MS固体培养基上筛选。将生长10天左右的绿色抗性植株转 栽到盆钵里，基质为泥炭土与蛭石比为3∶1(体积比)。收集T₁代种子。将该种子种植于含 有Kan抗生素(50mg/L)的1/2MS培养基上，统计分离比，选取符合3存活：1死亡分离比的 转基因株系植株移栽至钵里进行栽培，收集T2代种子，将该种子种植于含有Kan抗生素(50 mg/L)的1/2MS培养基上，种子在培养基上全部为绿苗，T2代种子为纯合系。以质粒 pBI121-35s-CeFT为阳性(+)对照，以拟南芥野生型叶片DNA为阴性(-)对照，用35S启 动子序列及插入目的基因序列设计引物，进行PCR检测单插入株系中目的基因的表达。引物 序列如下：35SFT-F：5′-TTGCGATAAAGGAAAGGC-3′，35SFT-R： 5′-ACGAAGACGAAGCGGTGT-3′，鉴定结果如图5所示，选取阳性植株，由此而获得转入 pBI121-35s-CeFT表达载体的转基因拟南芥。

(5)转基因植株进行表型鉴定。

将转基因拟南芥T2代植株和野生型拟南芥同等条件下进行培养，与野生型拟南芥相比， 转基因拟南芥抽薹及开花时莲座叶仅有4片叶，转基因植株都比野生型烟草提前开花，同等 培养条件下，野生型拟南芥需要31天开花，而转入CeFT基因的转基因拟南芥仅需要22天 开花。根据结果表明，外源CeFT基因在宿主拟南芥中实现了超量表达，促进了转基因提前 开花。试验结果表明，建兰CeFT基因为有功能的基因，可以影响植株的发育，具有促进生 殖生长，从而缩短开花时间的作用。

由上述结果分析表明，本发明的CeFT基因是一个新的开花整合基因FT基因，该基因能 促进植物的生殖生长，缩短开花时间，从而影响植株的发育。