棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因、其编码蛋白及应用

摘要

本发明公开了棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因(GbPI4K)、其编码蛋白以及利用该基因改良棉花品种的方法。由于磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)是催化磷脂酰肌醇生成细胞内重要的双信使分子三磷酸肌醇和二酯酰甘油的一个关键酶，且有证据表明GbPI4K基因在控制细胞壁发育和组织强度中起重要作用，因此本发明获得的GbPI4K基因可用于棉花遗传改良以改善棉纤维品质，具有潜在的经济效益和应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术(工程)领域，具体地说，涉及棉花磷脂酰 肌醇4-激酶基因、其编码蛋白以及利用该基因改良棉花品种的方法。

背景技术

棉花是最重要的天然纤维作物，纤维品质是棉纤维的重要性状指 标，而棉纤维品质由纤维发育所决定的。棉纤维由胚珠外珠被表皮层 分化的单细胞发育而来，其发育依次经过四个相互重叠的阶段：纤维 原始细胞分化突起、纤维细胞伸长(初生壁形成期)、次生壁加厚、 脱水成熟。初生壁和次生壁的发育对棉纤维品质形成至关重要，因此 分离和鉴定控制纤维伸长和次生壁发育的基因是了解纤维细胞发育 的分子调控机制的基础，也是进行纤维品质分子改良的前提。

磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)是真核细胞中主要的磷脂 组分，分布于细胞膜的磷脂双分子层内侧，约占细胞磷脂总量的10％。 PI可以经过磷脂酰肌醇4-激酶(Phosphatidylinositol 4-kinase，PI4K) 的催化生成磷脂酰肌醇-4-磷酸(PIP)，而后经历一系列的反应途径， 生成细胞内重要的双信使分子三磷酸肌醇(Trisphosphateinositol，IP3) 和二酯酰甘油(Diaeylglyeerol，DAG)，从而将胞外信号变为胞内信 号。有研究表明，这一信号途径在包括花粉管和根毛的极性伸长、细 胞的极性膨胀过程和细胞壁合成等多种发育过程中起着重要的信号 传递和调节作用。例如在棉纤维的发育中，与次生壁的发育有关的PI 信号途径的调节则控制细胞骨架的形成，或者通过调节质膜上纤维素 复合体的作用而控制纤维素沉积的方向。可见棉纤维细胞壁的发育可 能受到PI信号途径的调节从而影响纤维品质的形成。磷脂酰肌醇4-激 酶(Phosphatidylinositol 4-kinase，PI4K)作为这一系列代谢路径中的 关键环节，其对于PI信号途径的调控作用可能通过影响细胞壁的发育 而影响纤维品质。

关于磷脂酰肌醇4-激酶参与调节棉纤维发育更为重要的证据，在 于我们探测到棉纤维的次生壁加厚期，在两个纤维品质差异较大的陆 地棉“中棉所8号(CRI 8)”和海岛棉“Pima 90-53”之间，磷脂酰肌 醇4-激酶基因具有转录多态性，其转录组标记TDF与纤维强力QTL表 现共分离，说明GbPI4K基因是控制海岛棉和陆地棉间棉纤维强力差 异的重要候选基因；进一步研究发现，转化反义磷脂酰肌醇4-激酶基 因的拟南芥植株细胞壁发育受到影响，而且茎秆断裂强度显著降低。

综合以上分析认为，磷脂酰肌醇4-激酶基因对于了解棉纤维品质 形成的内在机制有重要意义，在棉纤维品质改良中具有重要的应用前 景。

发明内容

本发明的目的是提供一个与棉纤维发育有关的磷脂酰肌醇4-激 酶基因(GbPI4K)及其编码蛋白。

本发明的另一目的是提供利用GbPI4K基因改良棉花品种的方 法。

为了实现本发明目的，本发明提供棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因的 编码蛋白，其为：1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列构成的蛋白； 或2)SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几 个氨基酸且同等功能的由1)衍生的蛋白。例如，将第178位的Arg取 代为Gln，或是将第267位的Lys缺失，或是在183位增加His，均不会 影响蛋白的功能。

编码前述蛋白的基因，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列 (2817bp)，其编码框(ORF)为自5’端第547位至第2472位，编码具 有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质。

含有上述序列的基因工程载体、转基因细胞系和宿主菌、扩增其 任意片段的引物以及其反义序列也属于本发明的保护范围。

本发明提供的棉花品种的改良方法，是指利用转基因技术，将本 发明的棉纤维发育相关基因GbPI4K或该基因的部分片段导入棉花细 胞或组织，导致该基因的表达特性发生改变(例如在棉株开花16天以 后，检测到棉纤维中该基因的表达量增加)，从而获得棉纤维性状得 到改良的转基因细胞或组织。

本发明首次公开了棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因(GbPI4K)、其编 码蛋白以及利用该基因改良棉花品种的方法。由于磷脂酰肌醇4-激酶 (PI4K)是催化磷脂酰肌醇生成细胞内重要的双信使分子三磷酸肌醇 和二酯酰甘油的一个关键酶，通过转录组QTL定位，发现GbPI4K基 因是控制海岛棉和陆地棉间棉纤维强力差异的重要候选基因。

将反义的GbPI4K基因转入Columbia型拟南芥，转基因的拟南芥 茎秆机械组织细胞壁发育受到显著影响，根的伸长和茎秆强度降低。

本发明获得的GbPI4K基因可用于棉花遗传改良以改善棉纤维品 质，具有潜在的经济效益和应用价值。

附图说明

图1为本发明棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因ORF的扩增结果；

图中M是1kb ladder，1是磷脂酰肌醇4-激酶基因ORF的扩增产物。

图2为本发明棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因5’RACE的扩增产物；

图中M是DL 2000Marker，1是第一轮PCR的产物；2是巢式PCR 的产物。

图3为本发明棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因3’RACE的扩增产物；

图中M是DL 2000Marker，1是第一轮PCR的产物；2是巢式PCR 的产物。

图4为本发明棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因在不同器官的表达水平 的半定量RT-PCR分析结果；

图中1、2和3分别代表根、下胚轴和叶片。

图5为本发明棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因在纤维不同发育阶段表 达水平的RT-PCR分析结果；

图中Pima90-53和CRI 8分别是海岛棉和陆地棉品种。

图6为本发明E.coli BL21(DE3)中诱导前后目的基因重组融合 蛋白表达的SDS-PAGE检测结果；

图中箭头所指为目标蛋白，1：经IPTG诱导处理的BL21(DE3)plys 空菌株；2：经IPTG诱导处理含有pET-32a(+)空载体的BL21(DE3)plys 菌株；3，4：未经IPTG诱导处理含有pET-32a(+)-GbPI4K载体的 BL21(DE3)plys菌株；5，6：经IPTG诱导处理含有pET-32a(+)-GbPI4K 载体的BL21(DE3)plys菌株(表达有目标融合蛋白)；7：蛋白标准分 子量。

图7为本发明转反义基因T₃代拟南芥植株与野生型比较；

图中A为萌发时期幼苗(上为野生型对照，下为转基因植株)，B 为生长20天的幼苗(上为野生型对照，下为转基因植株)，C为抽薹期 植株(左为野生型对照，右为转基因植株)，D为幼苗叶面积比较(左 为野生型对照，右为转基因植株)。

图8显示转基因拟南芥与野生型拟南芥6～8d的根长变化；

图中各培养皿左侧为野生型对照，右侧为转基因植株。

图9为本发明转基因型拟南芥与野生型拟南芥的茎杆机械组织细 胞壁厚度比较；

图中A为野生型拟南芥茎杆，B为转反义GbPI4K拟南芥茎杆。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中无特别说明均为常规方法，涉及到的引物合成以及 序列测定由上海生工生物工程技术公司(Sangon)完成；总RNA提取 试剂盒(RNAplant Reagent)、质粒提取试剂盒、pGM-T克隆载体和 克隆试剂盒、Top10感受态细胞、DH5α感受态细胞、表达菌株 BL21(DE3)pLysS感受态细胞均购自天根生化科技(北京)有限公司 (TIANGEN)；PrimeScript 1st cDNA synthesis反转录试剂盒、 SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)和SYBR Green I试剂 等其他分子生物学试剂购自大连宝生物公司(TAKARA)；使用 NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer(NanoDrop)测定核酸浓度， 使用LightCycler 1.5(Roche)PCR仪进行Real-time PCR分析。

实施例1 GbPI4K基因全长cDNA序列的获得

GbPI4K基因全长cDNA序列的获得通过以下步骤完成

(1)GbPI4K cDNA的编码区(Open Reading Frame，ORF)的克 隆

使用海岛棉(Gossypium barbadense)“Pima 90-53”开花后21天 (days post anthesis，DPA)的纤维mRNA为材料，使用PrimeScript 1st  cDNA synthesis反转录试剂盒获得cDNA，使用下列基因特异引物克隆 GbPI4K基因ORF序列。同时在上、下游引物中分别引入了Sac I和Sal I 酶切位点。基因的上下游引物分别为：

ORF_F：5’GGCGAGCTCATGTCTCGCAAGTTGGA-3’，

ORF_R：5’GGCGTCGACCTATCTGGTAACGATAT-3’；

PCR反应程序为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，50℃退 火30秒，72℃延伸3分钟，共5个循环；94℃变性30秒，55℃退火 30秒，72℃延伸3分钟，共25个循环；72℃延伸10分钟。PCR反 应体系为：cDNA模板50ng，10×PCR Buffer(Mg²⁺)2μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.6μL，10umol/L的上、下游引物各1.0μL，2.5U/μL的Pfu DNA聚合酶0.25μL，dd H₂O补足至20μL。

通过PCR获得目的条带1944bp(如图1所示)。扩增产物通过常规 PCR产物回收、TA克隆与序列测定，确认扩增结果的正确性，同时扩 增产物也用于基因产物原核表达的载体构建。

(2)GbPI4K cDNA的5’和3’UTR(非翻译区)的克隆

使用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends， RACE)扩增GbPI4K cDNA的5’和3’UTR(非翻译区)。

根据步骤(1)所获得的序列设计的RACE特异引物(3’RACE引 物为5’-GAGCAGCTCCCAGGAAATGTGAGCT-3’，5’RACE引物为 5’-CGTTCCGCACGGCACTAAGATCATT-3’)，使用SMARTer RACE  cDNA扩增试剂盒，按照说明书操作，进行3’RACE和5’RACE扩增。 RACE扩增的程序是：94℃变性30秒，70℃退火30秒，72℃延伸3分钟， 共5个循环；94℃变性30秒，68℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共25 个循环；72℃延伸10分钟。

分别回收550bp和860bp的扩增产物。如果有必要，可使用巢式 RACE引物按说明书操作，进行巢式RACE扩增。3’RACE巢式引物为 5’-TTCCAGGAGTTGCTCTACCCGGGAT-3’，5’巢式RACE引物为 5’-AAAAACCCGTCTCCTCCCAACAGGT-3’。扩增程序与第一轮 RACE扩增程序相同。相应的回收产物分别为480bp和700bp。

GbPI4K cDNA的5’RACE扩增结果如图2所示，3’RACE扩增结果 如图3所示。

通过常规PCR产物回收、TA克隆与序列测定，并与步骤(1)所 获得序列进行比较以确认GbPI4K基因全长cDNA序列的正确无误，获 得5’UTR片段长度为546bp，3’UTR片段长度为345bp，基因ORF位 于自5’端第547位至第2472位之间，编码具有SEQ ID NO.2所示氨基 酸序列的蛋白。

实施例2 GbPI4K基因在不同器官的表达水平分析

采用RT-PCR方法，对陆地棉“中棉所8号”和海岛棉“Pima 90-53” 的棉花植株幼根、下胚轴和叶片的GbPI4K基因表达水平进行半定量 分析。所使用的GbPI4K基因特异引物是：

Specific_F：5’-TGAAGCTGGCTGACATGAATG-3’，

Specific_R：5’-CCTCTGTATCTGCTTCTGACCTA-3’；

扩增使用一个内标基因EF1α作参照，其特异引物是：

EF1α_F：5’-GGTGGGATACAACCCTGACA-3’，

EF1α_R：5’-TTGGGCTCATTGATCTGGTC-3’；

PCR反应程序为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒，56℃退火 30秒，72℃延伸30秒，共25个循环；最后72℃延伸5分钟。PCR反应 体系为：cDNA模板50～200ng，10×PCR Buffer(Mg²⁺)2μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.6μL，10umol/L的上、下游引物各1.0μL，2.5U/μL的Ex Taq  DNA聚合酶0.25μL，dd H₂O补足至20μL。

扩增产物经过1％琼脂糖电泳分析，其结果如图4所示。表明 GbPI4K基因在“中棉所8号”和“Pima 90-53”的幼苗根、下胚轴和 叶的组织中，均有类似的表达量，幼苗的根中的表达量略低于下胚轴、 叶中该基因的表达量。

实施例3 GbPI4K基因在纤维不同发育阶段表达水平的Real-time  PCR分析

使用陆地棉“中棉所8号”和海岛棉“Pima 90-53”为试材，提取 开花当天胚珠以及开花后5、10、15、20、25、30、35和40DPA的纤 维RNA，并反转录为单链cDNA。使用与实施例2相同的基因特异引 物和内标基因及其引物。按照SYBR Green I和LightCycler 1.5PCR仪 的说明进行分析。

分析结果如图5所示，表明GbPI4K基因在纤维发育中的表达水平 前高后低，在20DPA以前表达较高，海岛棉中PI4K基因在25DPA表 达量最高，并在35DPA时亦表现明显的活性；而陆地棉在15DPA表 达活性较高，在25DPA时表达活性明显下降。海岛棉持续表达时间比 陆地棉长近10天。海岛棉与陆地棉之间PI4K基因表达差异位于次生壁 加厚期。

实施例4 GbPI4K基因原核表达载体构建及诱导表达

GbPI4K基因原核表达载体构建及诱导表达包括以下环节：

(1)原核表达载体的构建与转化子获得

按照实施例1所述的引物引入限制性酶切位点，扩增GbPI4K基因 完整的编码框，扩增产物克隆至pGM-T载体。提取阳性克隆的质粒， 与原核表达载体pET-32a(+)使用相同的Sac I和Sal I酶处理，经过连 接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选含重组质粒的阳性克隆， 并经过测序验证以后，将成功构建的表达载体pET-32a(+)-GbPI4K通 过热激法转入BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，获得含有重组质粒 的大肠杆菌工程菌株。

(2)重组蛋白的诱导表达与鉴定

将含有以上重组质粒和含有空质粒(对照)的BL21(DE3)pLysS 菌株在28℃、IPTG的终浓度为1.0mmol/L的条件下诱导4.5小时后，在 10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后经考马斯亮蓝R250染色分析。

结果如图6所示，经IPTG诱导的含有重组质粒pET-32a(+)-GbPI4K 的大肠杆菌BL21(DE3)与含空质粒对照相比，在大约92.0KDa出现 一条特异带，未经诱导的对照不能得到该诱导蛋白。生物信息学预测 可表达的目的融合蛋白包括GbPI4K蛋白(约72.36KDa)和pET-32a 标签蛋白(约20.4KDa)。因此该特异蛋白就是是pET-32a(+)-GbPI4K 在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的目的融合蛋白。

实施例5 反义GbPI4K基因转化拟南芥

(1)GbPI4K反义载体的构建

为构建反义表达载体，设计扩增GbPI4K基因开放阅读框的引 物，在引物两端添加酶切位点Xba Ⅰ和Sac Ⅰ，引物序列如下：

P1：5’-TCTGAGCTCTATATGTCTCGCAGGTTGGAC-3’

P2：5’-TCGTCTAGAAAACTGGCACGAAGTACCG-3’

PCR产物电泳回收，与pGEM-T Easy载体连接。连接产物经热激 转化E.coli DH5α。经PCR与酶切检测获得阳性克隆，并提取质粒测 序验证，获得中间载体pGEM-GbPI4K。

提取中间载体质粒与真核表达载体pBI121的质粒DNA，使用相同 的限制性内切酶为XbaⅠ和SacⅠ进行酶切处理，回收目的片段并连 接，连接产物通过热激法转入大肠杆菌E.coli DH5α中。经PCR与酶 切检测获得阳性克隆，并提取质粒测序验证，获得反义的真核表达载 体pBI121-GbPI4K。

将构建好的重组载体pBI121-GbPI4K转化农杆菌GV3101，经菌液 PCR验证，获得含有重组质粒的农杆菌工程菌株。

(2)GbPI4K反义载体转化拟南芥

采用农杆菌浸花法(floral dip)进行Columbia型拟南芥的转化。 成熟的拟南芥种子(转基因T₁代)经干燥和春化后，种植于MS筛选 培养基。使用100mg/L卡那霉素筛选，转基因阳性苗，移栽于蛭石培 养。通过PCR检测初步确定转基因阳性植株。单株收获，MS培养获 得T₃代阳性拟南芥转基因植株，经Northern Blot检测确认和表型分析。

在幼苗生长初期，转反义基因的拟南芥萌发较野生型晚，而且同 一生长时期(生长20天)的幼苗比野生型要小(图7A、B)，另外， 转反义基因的拟南芥抽薹时间较野生型晚约12天左右(图7C)，叶面 积比野生型小(图7D)。

在MS培养机上种植拟南芥，待其长到一定程度后(6天、7天和8 天)测量根长，每组设三次重复，并在统计学0.01水平下存在的极显 著差异(图8)，转基因材料比野生型的根长短。例如第8天，转基因 拟南芥平均根长为5.07mm，而同期野生型平均根长为7.90mm。

分别对野生型拟南芥和转反义基因拟南芥的茎杆强度进行测量， 发现在统计学0.01水平下存在的极显著差异，转基因材料的茎杆强度 明显降低。例如试验中野生型拟南芥的茎杆平均断裂强度为8.05N， 而转反义基因型拟南芥的茎杆平均断裂强度仅为5.72N。

对野生型拟南芥和转反义基因拟南芥同时期茎段横切面进行观 察发现转反义基因拟南芥的茎杆机械组织细胞壁厚度比前两者明显 变小(图9)。

上述分析结果表明抑制该基因的表达影响了拟南芥细胞壁的形 成、根的极性生长、组织强度以及发育进程。而利用GbPI4K基因转 录组标记进行QTL定位的研究结果已经确认其是控制棉纤维强度的 重要基因，具有提高纤维强度的潜力。综合以上分析结果，GbPI4K 基因表达对纤维强度表型的贡献可能是通过促进纤维细胞壁的发育 而起作用。因此可以通过遗传重组(例如转基因或杂交转育)提高棉 纤维品质，具有潜在的经济效益和应用价值。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。