一种耐盐沙雷氏菌及其在盐渍化石油污染土壤修复中的应用

摘要

本发明属于微生物应用技术与污染土壤生物修复领域，具体涉及一种沙雷氏菌菌株（Serratiasp.）以及在石油污染盐渍化土壤修复中的应用。本发明公开的一种沙雷氏菌株（Serratiasp.），该菌株于2011年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.5236，该菌株能够在高盐的液态环境中和盐渍化土壤中能够高效降解石油。该菌株是在有盐胁迫条件下，自石油污染的盐渍化土壤中分离得到。该菌株菌落呈圆形，边缘规则，不透明，白色，菌体呈短杆状，较小，革兰氏染色阴性。本发明还公开了其核苷酸序列。该菌株能够在高盐的液态环境中降解石油，在盐渍化土壤中石油降解率达60%以上，在野外盐渍化土壤修复中应用效果显著。

说明书

技术领域

本发明属于微生物应用技术与污染土壤生物修复领域，具体涉及一种沙雷氏菌株（Serratia sp.）以及在石油污染盐渍化土壤修复中的应用。 

背景技术

在石油及其石油产品的生产使用过程中，不可避免的会带来土壤污染问题。土壤被石油污染后，生产力降低，石油中的有害组分还能够进入到水体、大气，甚至农产品中，严重影响环境质量和危害人体健康。各国专家一直在石油污染土壤修复技术领域的进行研发、攻关工作，但由于石油组分复杂，一旦其污染环境后，修复难度较大。生物修复是石油污染土壤治理的一非常有潜力的方法，是国内外普遍关注研究的热点。其主要包括植物修复、微生物修复以及微生物-植物联合修复。微生物修复可以利用原位的土著微生物，但更多的是利用高效降解菌剂以及工程菌，在很大程度上，其修复效率的高低取决于微生物降解效率。因此，开展石油污染土壤的生物修复工作，首先要筛选高效石油降解微生物。 

随着经济的发展，人们对石油产品的需求量不断增加，石油开采也正在由内陆向海上转移，海洋、海岸带地区石油污染有加大趋势。海岸带地区生态环境脆弱，土壤盐渍化严重，表层土壤可溶性盐含量0.5-3%，以氯化物为主，氯化物最高可占可溶性总盐量的80%。盐度从0.5%升高到2%时，会严重扰乱非耐盐微生物的代谢活动，因此，在内陆地区广泛应用的石油污染修复菌剂，在海岸带盐渍化污染土壤修复中可能无法利用。进行海岸带地区石油污染土壤的修复工作，关键是筛选出耐盐石油降解微生物，其能够在高盐环境中降解石油烃。目前，关于耐盐的降解石油微生物还鲜有报道。 

盐生微生物包括嗜盐型和耐盐型，前者指微生物在一定的盐浓度中可正常生长，高盐度是正常生长的必须条件；后者是能耐受一定的盐浓度，但在无盐条件下也可以正常生长。开展盐渍化石油污染土壤的生物修复工作，修复生物必须要适应高盐的土壤环境。因此需要寻找能在高盐环境下能降解石油的微生物。 

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明基于传统的石油降解微生物筛选方法，在筛选过程中加入了NaCl，筛选出了一株耐盐石油降解菌，并进行了菌种鉴定，认定为（Serratia sp.） BF40，该菌株在盐浓度为0～7%的环境中能够降解石油，对石油污染的土壤进行修复。 

本发明的沙雷氏菌株（Serratia sp.）BF40，该菌株于2011年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.5236，该菌株在LB平板上培养1d的菌落直径1～2mm，菌落呈圆形，边缘规则，不透明，白色； 

其细胞形态特征：菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性；

其生理生化特征：生长最适pH为7.2～7.7，NaCl耐受性在0～7%之间；

柠檬酸盐利用、V-P实验、吲哚实验、油脂水解均为阳性，淀粉水解为阴性，能够利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖产酸，不能利用乳糖。

上述的沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株，在盐浓度为0～5%的液态环境中和盐浓度为0.6～1.3%的盐渍化土壤中降解石油。 

上述的沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株，在以粉碎的灭菌玉米秸秆作为载体的条件下，对石油污染的盐浓度为1.3%的盐渍化土壤修复，71天对石油降解率达65%以上。 

沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株能够在盐渍化环境中降解石油的一个重要机制是产生表面活性剂，提高了石油的生物可利用性。 

在分离筛选体系中加入适量NaCl，能够显著提高耐盐石油降解菌的筛选效率，NaCl添加浓度为0.5～1.0%。 

本发明的有益效果在于，本发明提供的保藏编号为CGMCC NO.5236的沙雷氏菌株（Serratia sp.）BF40，在盐浓度为0～5%的液态环境中的盐浓度为0.6～1.3%的盐渍化土壤中能够降解石油；在以粉碎的玉米秸秆作为载体的条件下，对石油污染的盐浓度为盐渍化土壤修复，71天石油降解率达65%以上。 

附图说明

图1为本发明的沙雷氏菌株（Serratia sp.）BF40在不同盐度下生长变化； 

图2为实施例4BF40菌株在不同盐浓度液体培养基中的石油降解率；

图3为实施例6中不同处理土壤中石油降解率，图中同土壤中不同字母表示处理间差异显著 (p<0.05)；

图4为实施例6土壤中残留石油饱和脂肪烃和芳香烃（SAA）组分色谱图，A、加入表面活性剂处理（BIOF）；B、空白处理（CK）；

图5为实施例8沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株石油降解率。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。 

实施例1

沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株的分离筛选

取10g石油污染滨海盐渍化土壤，该土壤中可溶性盐含量为1.2%，将该土壤加入装有100mL无菌水的三角瓶中，高速振荡20min后，取10ml接种到1.0%NaCl无机盐液蜡培养基中，培养基组成：Na₂HPO₄ 1.5 g/L; KH₂PO₄ 3.84 g/L; MgSO₄ 0.7g/L; (NH4)₂SO₄ 4.0 g/L; 酵母粉 0.01g/L; 液体石蜡 2% (v/w)；置37℃摇床往复振荡培养5d，重复富集3次后，将富集培养液充分混匀，取100μL涂布在1.0%NaCl的LB固体平板上，在37℃恒温培养箱中培养36h，观察生长出的菌落。将生长的单菌落接种到LB培养基中，培养至OD₆₃₀为0.8左右，作为种子液以10%（v/v）比例接入100mL，1.0%NaCl无机盐液蜡培养基中，37℃摇床往复振荡培养5d。然后以此发酵液作为种子液，接种至新鲜的1.0%NaCl无机盐液蜡培养基中，反复驯化3次。

选取对液蜡乳化良好的菌种进行原油降解实验。将菌落接种到1.0%NaCl液蜡培养基中培养3d左右，作为种子以10%（v/v）的比例接种到100mL的1.0%NaCl原油培养基中，振荡培养7d，测定原油降解率。石油测定方法采用红外测油仪进行测定，首先发酵液用四氯化碳进行萃取，测定剩余原油的量，降解率（%）=（1-剩余原油的量）/加入原油的量×100，最终得到盐渍化环境中降解石油的菌株（Serratia sp.）BF40。 

实施例2

沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株的16S rDNA基因序列测定

将菌株接种于LB培养基，在37℃恒温培养箱中培养20h，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，进行测序，16S rDNA基因序列长度为1503bp，该序列与NCBI数据库中所给出的Serratia属中不同种的16S rDNA序列具有大于98%的相似性，其16S rDNA基因序列如序列表中所示。

实施例3

沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株的耐盐性

利用无机盐培养基，添加0.1%酵母粉，设五个不同浓度梯度的NaCl处理：0、0.5%、2.5%、5.0%、7.5%，接种后，在37℃恒温培养箱中培养48h，测定菌液吸光值，结果见图1。

由图1可以看出，在0～2.5%的盐度条件下，菌株能够正常生长，盐度增加至5.0%时，生长量约为最大生长量的一半，盐度继续增加，该株菌的生长显著受到抑制，但在盐浓度为7%的环境中仍然能生长。因此，沙雷氏菌属（Serratia sp.）BF40为耐盐菌，在液体培养基中其耐盐程度在0～7 %。 

实施例4

沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株在不同盐度下降解石油效率

将菌株分别接种在不同NaCl添加量，含1.0%（v/w）石油的LB液体培养基中，在37℃振荡培养7d，红外测油仪测定剩余石油的量，计算石油降解率。以不接种处理作为对照（CK），结果见图2。

由图2可以看出在含盐量0～5.0%的盐度条件下，与对照相比较，接种处理石油降解率大大提高，因而，BF40菌株能够显著促进石油降解，在高盐条件下仍具有较高的降解率。 

实施例5

沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株发酵液在不同盐度条件下表面张力与乳化指数

将菌株接种到不同NaCl添加量的牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养72h，测定不同处理的表面张力。取5mL离心后的去细胞发酵液，加入5mL二甲苯摇动混匀30s，然后静止24 h 测定其在不同含盐量下的乳化指数（EI-24）。发酵液表面张力和乳化指数见表1。

表1沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株在不同含盐量条件下的表面张力与乳化指数 

经测定蒸馏水的表面张力为72.3mN/m，未接种培养液的表面张力为56mN/m，由表1可以看出在NaCl含量0.5～3.0%条件下，发酵液表面张力显著降低，在0.5～2.0%含盐量下表现稳定，这说明该菌株在0.5～3.0%含盐量下能够产生表面活性剂，降低所在环境的表面张力，并且在0.5～2.0%含盐量下表现稳定。乳化性能在0.5～1.0%条件下非常显著，但随着含盐量的升高，乳化性能大大降低。沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株能够加快石油降解的一个重要原因，是在盐胁迫条件下能够产生活性物质，降低所在环境的表面张力，提高乳化能力，进而大大增强了石油的生物可利用性。但乳化性能随着盐度增加迅速降低，表面张力的能力表现较为稳定，在小于3.0%含盐量条件下效果显著。

实施例6

沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株在不同盐渍化土壤中石油降解效率

采集土壤（含盐量为0.1%），干燥过筛，通过添加NaCl使土壤含盐量达到0.6%、1.2%，再将溶于二氯甲烷的石油加入土壤中混匀，土壤中石油含量为1.2% (w/w)，待二氯甲烷挥发完全后，称取50g，放置在100mL三角瓶中，加入5mL生长至对数生长期的菌种发酵液，使土壤相对含水量达60%，parafilm膜封口，培养4周，重量法测定土壤中石油的残留量，计算石油降解率 (BF40)。同时，利用牛肉膏蛋白胨培养基，培养72h，经浓缩、净化后得到该菌表面活性剂，加入到石油污染土壤中，土壤中表面活性剂浓度为50 mg/kg，使土壤相对含水量达60%，parafilm膜封口，培养4周，重量法测定土壤中石油的残留量，计算石油降解率 (BIOF)。以只加等体积的无菌培养液处理处理作为对照（CK）。结果见图3。

由图3可知，无论是沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株还是其产生的活性物质，都能够促进不同盐渍化程度土壤中石油的降解，加入表面活性剂的处理石油降解率最高，与BF40菌株相比，在盐渍化土壤中差异达到了显著水平。表面活性剂处理在盐渍化0.6%土壤中石油降解率最高，接种BF40菌株处理随着盐渍化程度增加，石油降解率有所降低，但差异不显著。 

利用硅胶柱对残留在1.2%盐渍化程度土壤中的石油进行组分分析，将石油分为碳氢化合物（SAA，包括饱和脂肪烃和芳香烃）和难降解物质（NDF，沥青质和极性组分）两部分，将SAA组分进行GC-FID分析，发现加入表面活性剂BIOF处理其峰面积只有对照CK处理的10.1%，见图4。 

可见，沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株及其所产生的表面活性剂能够显著加快盐渍化土壤中石油类污染物的降解。 

实施例7

筛选体系中增加盐胁迫对耐盐石油降解菌筛选的影响

沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株是在1.0%NaCl存在条件下筛选出来的，为探明盐胁迫对耐盐菌筛选效率的影响，设计了如下实验：利用无机盐液蜡培养基（培养基组成Na₂HPO₄ 1.5 g/L; KH₂PO₄ 3.84 g/L; MgSO₄ 0.7g/L; (NH₄)₂SO₄ 4.0 g/L; 酵母粉 0.01g/L; 液体石蜡 2.0% (v/w)），依据NaCl添加量的不同共设四个处理：0、0.5%、1.0%、2.0%，以不添加NaCl的传统方法作为对照（CK），按照实例1的程序进行耐盐降解微生物的筛选，富集3次后，取100μL分别涂布在含1.0%NaCl的LB固体平板上，重复3次，在37℃恒温培养箱中培养12h、36h后，比较不同处理间菌落生长的差异。

表2 不同处理富集、筛选后的菌落数（CFU，×10⁵） 

    注：表中同一行中不同字母表示处理间差异显著 (p<0.05)。

由表2可知，利用无机盐培养基进行耐盐降解石油菌株筛选，添加不同量的NaCl，富集得到的菌落数处理间存在显著差异，在12h时，0.5%处理菌落数最多，在36h时，0.5%、1.0%菌落数最多，不添加盐的传统处理方法与2.0%处理，菌落数最低。富集后得到的菌落数越多，显然从中获得的耐盐石油菌的几率越高，因而，筛选的效率也越高。按照实施例1的方法进一步对单菌落进行了处理，筛选好的菌株按照实施例4方法在含盐量1.0%的石油污染土壤中进行降解试验，培养7d，各处理石油降解率大于15%的菌株数见表2。NaCl添加量为0.5%、1.0%处理获得的菌株数最多，为对照处理的1倍多，但添加量过大，筛选得到的菌株数降低。因此，进行耐盐石油降解微生物的筛选，通过加入盐来提高筛选体系的盐度是必要的，其添加量在0.5～1.0%。同时，自富集到降解菌株的获得，全过程存在盐胁迫，这样微生物的耐盐特性不容易丢失，多代培养中菌种的特性不会退化。 

实施例8

沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株盐渍化石油污染土壤修复中的应用

在一原油输送管泄露处，土壤含盐量1.3%，石油含量1.8%，属盐渍化石油污染土壤。沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株接种至牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养36h，按2L/kg加入到粉碎的灭菌玉米秸秆中，室温下发酵4d，然后在无菌通风橱中风干备用。在盐渍化石油污染土壤中，按20 g/m2加入风干的玉米秸秆，15cm翻地混匀，对照为翻地，施入不接种粉碎的灭菌玉米秸秆（按照2L/kg加入无菌牛肉膏蛋白胨培养基，室温下发酵4d，然后在无菌通风橱中风干）。10d采样一次，重量法测定土壤中石油剩余量，计算降解率。自6月1日至8月10日，共计71d，取样7次，结果见图5。

结果表明，经过71d修复，土壤中石油降解率达到了69.82%，是自然降解的4倍多，因此，沙雷氏菌（Serratia sp.）BF40菌株能够用于盐渍化石油污染土壤的修复，利用玉米秸秆作为载体施入土壤是一种有效方法之一。 

以上列举的仅是本发明的一些具体实施例，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的技术人员能够从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变换，也落在本发明的保护范围之内。