高纯度凝血酶原复合物制品干热病毒灭活过程中的保护剂

摘要

本发明涉及医药生物技术领域，是一种高纯度凝血酶原复合物制品(四种凝血因子II、VII、IX、X比活均≥3.5IU/mg蛋白)在100℃，30min干热病毒灭活过程，可有效防止制品中主要作用凝血因子IX及其他凝血因子II、VII、X失活的保护剂。本发明的保护剂是指海藻糖或/和组氨酸，还含有常用的甘氨酸、柠檬酸钠和NaCl中的两种或三种。试验表明，高纯度凝血酶原复合物只要含有0.1％-8％海藻糖或/和0.1％-8％组氨酸，就可以在100℃，30min干热病毒灭活过程中有效地保护凝血因子IX及凝血因子II、VII、X的活性。因此本发明可用作高纯度凝血酶原复合物干热病毒灭活过程中的保护剂。

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，是几种和几组高纯度凝血酶原复合物制品(四种凝血因 子II、VII、IX、X比活均≥3.5IU/mg)在100℃、30min干热病毒灭活过程，可有效防止制品 中主要作用凝血因子IX及凝血因子II、VII、X失活的保护剂。具体而言，高纯度凝血酶原复 合物中加入0.1％-8％海藻糖或/和0.1％-8％组氨酸，干热病毒灭活过程中可有效保护凝血因子 IX及凝血因子II、VII、X的活性。

背景技术

人凝血酶原复合物(Prothrombin Complex Concentrate，PCC)，又称凝血因子IX复合 物，是由健康人混合血浆制备成的冻干血浆蛋白制品，除含有凝血因子IX外，还含有其他依 赖维生素K合成的凝血因子II、VII、X。20世纪50年代PCC开始制备并用于临床，目前该 制品除用于乙型血友病、有抗凝血因子VII的甲型血友病外，还广泛用于由肝脏疾病、维生素 K缺乏所引起的凝血因子水平低下而导致的出血症及替代新鲜冰冻血浆逆转香豆素类抗凝剂 过量而导致的各种出血性疾病，随着PCC临床适应症的扩大，其使用量也在逐年增加。

自PCC用于临床治疗以来，不断有临床输注后导致血栓形成并发症的报道，主要包括弥 散性血管内凝血、静脉血栓、肺水肿及致死性心肌梗塞等。虽然PCC导致血栓形成的确切原 因目前还未完全阐明，但动物模型实验揭示，制品中含有激活激肽释放酶原、高分子量激肽 原、磷脂以及接触因子等都可能促使血栓形成，因此，高纯度PCC制品，其他杂质蛋白含有 较少，可有效降低血栓形成的风险。当前国内成型PCC制品，凝血因子II、VII、IX、X的比 活性大多在0.3-1.0IU/mg之间，杂蛋白所含比例相对较大，在一定程度上增加了血栓副反应 发生的机率。

PCC由健康人血浆制备而成，但不能排除乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、 艾滋病毒(HIV)、人嗜T细胞病毒(HTLV)等传染的可能，因此在制备过程中必须有病毒灭 活或去除的方法。2002年5月，国家药品监督管理局《血液制品去除/灭活病毒技术方法及 验证指导原则》中明确规定：凝血因子类制品生产过程中应有特定的能去除/灭活脂包膜和非 脂包膜病毒的方法，可采用一种或多种方法联合去除/灭活病毒。100℃、30min干热病毒灭 活法对脂包膜和非脂包膜病毒均有灭活效果，该病毒灭活方法通常在制品冻干后进行，操作 简便，可控性强，被很多生产厂家采用，但制品在100℃高温条件处理，有效活性蛋白易失 活变性，因此在干热病毒灭活过程中，制品需加一定量的保护剂对活性蛋白进行保护。

高纯度PCC，凝血因子纯度较高，蛋白含量相对较少，对保护剂的要求则更为苛刻，至 今未见对高纯度PCC干热病毒灭活过程保护剂的研究，此外，也未见海藻糖或/和组氨酸用于 PCC干热病毒灭活过程保护剂的报道。

发明内容

要解决的技术问题

为了减少高纯度PCC在干热病毒灭活过程中凝血因子的活性损失，提高制品活性回收率， 本发明提供几种和几组高纯度PCC干热病毒灭活过程的保护剂，100℃、30min干热病毒灭活 处理对凝血因子II、VII、IX、X有较好的保护效果，其中凝血因子IX活性收率均＞74％。

技术方案

本发明以高纯度PCC为实验材料，通过冷冻干燥、干热病毒灭活(100℃、30min)、活性 测定、对比试验，获得2种和8组高纯度PCC干热病毒灭活处理的保护剂，具体步骤如下：

a)高纯度PCC制备

健康人混合血浆2-4℃离心去除冷沉淀，以血浆上清为原料，利用扩张床技术制备高纯 度PCC。将收集的洗脱液用所含0.01M柠檬酸钠、0.5％NaCl、pH7.0超滤缓冲液在超滤浓缩 系统中超滤、脱盐、浓缩并活性测定，获得高纯PCC实验材料。

上述制备的高纯度PCC组成特征为：

  凝血因子种类   比活(IU/mg)   凝血因子II   3.5-6.0   凝血因子VII   3.5-6.0   凝血因子IX   3.5-6.0   凝血因子X   3.5-6.0

b)添加保护剂

适当调整浓缩液中凝血因子IX单位活性，按一定比例加入海藻糖或/和组氨酸保护剂，调 整pH至7.0，除菌过滤、分装。

c)冷冻干燥

上述分装制品-40℃预冻8hr后，冻干机真空冷冻干燥。

d)干热病毒灭活

冻干后制品置于水浴中，升温至100℃计时，30min后取出。

e)活性测定

注射用水溶解干热病毒灭活前后制品，一期法测定凝血因子活性，对比分析。

有益效果

本发明的有益效果是，提供了2种和8组高纯度PCC干热病毒灭活处理的保护剂，凝血 因子IX的活性收率均高于74％，最优保护剂组合干热病毒灭活处理后II、VII、IX、X四种凝 血因子活性回收率均可达98％以上。

具体实施方式

结合实施例对本发明保护剂在干热病毒灭活过程对高纯度PCC的保护作用作详细说明， 但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：海藻糖及组氨酸对高纯度凝血酶原复合物主要作用凝血因子IX的保护试验

未加保护剂的空白对照制品经100℃、30min干热病毒灭活处理后，凝血因子IX回收率 低于58％，而添加不同浓度(1.5％、2.5％)海藻糖作保护剂的制品，凝血因子IX活性回收率 在75％以上；添加不同浓度(1.5％、2.5％)组氨酸作保护剂的制品，凝血因子IX活性回收率 在74％以上(见表1)，说明本发明保剂在单因素条件下能对高纯PCC主要作用凝血因子IX进 行有效保护。

表1海藻糖及组氨酸对干热病毒灭活处理的高纯PCC凝血因子IX活性回收率的影响

实施例2：海藻糖及组氨酸对高纯度凝血酶原复合物四种凝血因子的保护效果

未加保护剂的空白对照制品经干热病毒灭活处理后，四种凝血因子回收率不超过59％， 而添加2.0％海藻糖作保护剂的制品，四种凝血因子活性回收率均在81％以上；添加2.0％组氨 酸作保护剂的制品，四种凝血因子活性回收率均在76％以上(见表2)，说明本发明保剂在单 因素条件下即能有效保护高纯度PCC中的四种凝血因子。

表2海藻糖及组氨酸对干热病毒灭活处理的高纯PCC四种凝血因子活性回收率的影响

  凝血因子类型   空白对照   2.0％海藻糖   2.0％组氨酸   凝血因子IX   57.9％   82.9％   79.5％   凝血因子II   58.6％   81.4％   84.4％   凝血因子VII   53.1％   85.2％   76.2％   凝血因子X   49.5％   91.8％   80.6％

实施例3：海藻糖或/和组氨酸+甘氨酸对高纯度凝血酶原复合物主要作用凝血因子IX的 保护试验

在2.0％甘氨酸基础上，添加不同浓度(0.5％、1.5％)海藻糖作保护剂，凝血因子IX活性 收率在97％以上(见表3)；在2.0％甘氨酸基础上，添加不同浓度(0.5％、1.5％)组氨酸作保 护剂，凝血因子IX活性收率在76％以上(见表3)，均高于2.0％甘氨酸对照组67.4％的收率。 在2.0％甘氨酸基础上，分别添加0.5％组氨酸+0.5％海藻糖、1.0％组氨酸+0.5％海藻糖、0.5％ 组氨酸+1.0％海藻糖、1.0％组氨酸+1.0％海藻糖作保护剂，凝血因子IX最低活性收率为92.8％ (见表4)，均高于2.0％甘氨酸对照组，可明显看出，本发明保护剂海藻糖或/和组氨酸在干 热灭活过程中对高纯度PCC主要作用凝血因子IX活性有很好的保护作用。

表3海藻糖+甘氨酸及组氨酸+甘氨酸对干热病毒灭活处理的高纯PCC凝血因子IX活性回收 率的影响

表4组氨酸+海藻糖+甘氨酸对干热病毒灭活处理的高纯PCC凝血因子IX活性回收率的影响

  凝血因子类型   凝血因子IX   2.0％甘氨酸对照   67.4％   2.0％甘氨酸+0.5％组氨酸+0.5％海藻糖   108.7％   2.0％甘氨酸+1.0％组氨酸+0.5％海藻糖   112.7％   2.0％甘氨酸+0.5％组氨酸+1.0％海藻糖   113.5％   2.0％甘氨酸+1.0％组氨酸+1.0％海藻糖   92.8％

实施例4：海藻糖+组氨酸+甘氨酸对高纯凝血酶原复合物四种凝血因子保护效果

在2.0％甘氨酸基础上，添加0.5％组氨酸+1.0％海藻糖作保护剂，四种凝血因子活性收率 最低为98.4％(见表5)；在2.0％甘氨酸基础上，添加1.0％组氨酸+0.5％海藻糖作保护剂，四 种凝血因子活性收率最低为95.3％(见表6)，而2.0％甘氨酸对照组，四种凝血因子活性收率 最高为70.1％(见表5和表6)，由此可见，本发明保护剂海藻糖和组氨酸在干热灭活过程中 对高纯度PCC四种凝血因子均有较好的活性保护作用。

表5海藻糖+组氨酸+甘氨酸对干热病毒灭活处理的高纯PCC四种凝血因子活性回收率的影 响

  凝血因子类型   2.0％甘氨酸对照   2.0％甘氨酸+0.5％组氨酸+1.0％海藻糖   凝血因子IX   67.4％   113.5％   凝血因子II   70.1％   110.2％   凝血因子VII   57.6％   105.4％   凝血因子X   68.5％   98.4％

表6海藻糖+组氨酸+甘氨酸对干热病毒灭活处理的高纯PCC四种凝血因子活性回收率的影 响

  凝血因子类型   2.0％甘氨酸对照   2.0％甘氨酸+1.0％组氨酸+0.5％海藻糖   凝血因子IX   67.4％   112.7％   凝血因子II   70.1％   108.6％   凝血因子VII   57.6％   95.3％   凝血因子X   68.5％   99.5％