干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入剂

摘要

本发明属于抗病毒药物的组合物领域，涉及干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入剂。所述的雾化吸入剂含有治疗有效量的干扰素α、地塞米松磷酸钠与适宜量的可药用辅料；优选单次给药剂量中含有2.5-30μg的干扰素α，1-4mg的地塞米松磷酸钠，以及适宜量的可药用辅料；更优选单次给药剂量中含有10-20μg的干扰素α，2-3mg的地塞米松磷酸钠，以及适宜量的可药用辅料。用本发明的干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入剂治疗病毒性肺炎，可较单独使用干扰素α或地塞米松磷酸钠治疗明显提高疗效。

说明书

技术领域

本发明涉及抗病毒药物的组合物及其在制备治疗病毒性肺炎药物中的应用。

背景技术

病毒性肺炎是一种婴幼儿时期的常见病，严重危害婴幼儿的生命健康。据不 完全统计，超过90％的婴幼儿在2岁以前感染过病毒性肺炎，其中80％以上病 例在1岁以内，发病高峰年龄为2-6个月，1-6个月可见较重病例。婴幼儿因感 染病毒性肺炎造成的死亡在发达国家为0.5％-2.0％，在发展中国家可达7％，在 我国更是婴幼儿死亡的首要原因。此外，病毒性肺炎的传染性和再感染性很强， 有报道表明家庭成员间可发生相继感染，已感染婴幼儿在10年内再感染发生率 高达65％。

引起病毒性肺炎的病毒主要是腺病毒(adenovirus，ADV)和呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus，RSV)，其次是流感病毒(influenza virus，IFV)和副流 感病毒(parainfluenzavirus，PIV)，再次是巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、 单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)、肠道病毒(enterovirus，EV)、人类偏 肺病毒(hMPV)等。由于这些病毒极易发生变异，加之在病毒感染后容易诱发 进一步的细菌感染，从而给患儿造成混合感染和并发症，因此婴幼儿病毒性肺炎 很难实现全面的特异防治，临床上缺乏有效的药物治疗。

化学药物是目前治疗病毒性肺炎的最主要药物，原因是临床使用时间最长， 可迅速清除感染病毒；但化学药物治疗病毒性肺炎的缺点是停药后病情容易反 弹，不能调节和提高患儿机体免疫力对抗病毒，且在长期使用过程中容易产生耐 药性。目前临床上治疗病毒性肺炎的化学药物主要有利巴韦林、更昔洛韦、奥司 他韦、阿糖腺苷、金刚烷胺等。例如美国专利US 5,290,540公开了利巴韦林用于 治疗病毒性肺炎的方法。

中药对病毒性肺炎的治疗在近年的研究使用日益广泛，这源于中药药性的温 和持久，并兼具免疫调节作用。但中药治疗病毒性肺炎周期长，且中药在很大程 度上并不适宜于婴幼儿使用。另外中药治疗的长期安全性问题也是一个不容忽视 的问题。目前有报道临床研究用于病毒性肺炎治疗的中药主要有大青叶、板蓝根、 银花、连翘、射干、黄芩、黄连、麻黄、苦杏仁等。例如中国专利CN 03131642.5 公开了一种治疗小儿病毒性肺炎的清肺口服液制剂，其由麻黄、生石膏、苦杏仁、 葶苈子、桑白皮、前胡、僵蚕、丹参、虎杖、拳参等中草药组成。又如中国专利 CN 02138175.5公开了一种治疗小儿病毒性肺炎的药物组合物，其由麻黄、苦杏 仁、石膏、甘草、前胡、僵蚕、丹参、虎杖、拳参、葶苈子、桑白皮十一味中药 组成。

伴随着生物技术药物的迅猛发展，近年来越来越多的研究关注生物技术药物 对病毒性肺炎的治疗，其中使用的生物技术药物包括干扰素、白细胞介素、人血 丙种球蛋白、胸腺肽、特异性抗病毒抗体等，尤其以干扰素使用的报道最多。生 物技术药物，尤其是干扰素用于病毒性肺炎的治疗，作用持久，可调节和提高患 儿机体免疫力对抗病毒，不易产生耐药性，安全性更高。例如中国专利CN 03147580.9公开了一种治疗病毒性肺炎的重组人干扰素α喷雾剂，其由重组人干 扰素α原液配以适当的保护剂、粘膜吸收促进剂、抑菌剂等制成，pH值在5.0-8.0。

但是由于前述患儿在感染病毒性肺炎后容易进一步诱发细菌性感染，从而给 患儿造成混合感染和并发症，因此单独使用一种药物治疗婴幼儿病毒性肺炎的临 床效果并不理想，产生了联合用药或两种以上药物有效成分的药物组合物用于病 毒性肺炎的治疗。例如《中国实用医药》2009年3月第4卷第9期144-145页发 表的文章“干扰素联合利巴韦林治疗小儿病毒性肺炎30例疗效观察”报道了干扰 素联合利巴韦林治疗小儿病毒性肺炎的疗效，表明联合用药组治疗有效率为 96.7％，而单独使用利巴韦林的对照组的有效率只有76.6％，两者具有统计学上 的显著性差异。但联合用药或组合物用药用于病毒性肺炎的研究目前还不够系 统，且研究种类还较少，因此研究成果还不适于在临床上的规模化推广应用。

在治疗病毒性肺炎的药物递送系统方面，雾化吸入剂是一种近年来在临床上 发展起来的新的给药剂型。所谓雾化吸入剂，是指将药液经过雾化变成药雾，经 吸入达呼吸系统靶部位起治疗作用的剂型。雾化吸入剂的给药必须借助一定的雾 化吸入装置，包括压缩雾化器、超声雾化器等。由于雾化吸入剂给药后不经过吸 收可直接作用于呼吸系统病变部位，从而相比其他剂型有明显更高的生物利用度 与药效，因此雾化吸入剂已逐渐成为临床上治疗小儿病毒性肺炎的首选剂型。

此外，地塞米松磷酸钠是一种临床上治疗急性肺损伤的药物，对病毒性肺炎 的治疗可能会有一定的辅助作用。

但现有技术中未见有干扰素α与地塞米松磷酸钠联合使用治疗病毒性肺炎 的报道。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入剂，以 用于婴幼儿病毒性肺炎的治疗，进一步提高治疗效果。

在基础的实施方案中，本发明的干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入剂含 有治疗有效量的干扰素α、地塞米松磷酸钠与适宜量的可药用辅料。

雾化吸入剂的制备可选择本领域技术人员公知的方法，甚至是与注射液相类 似的方法。但无论雾化吸入剂的组成，还是雾化吸入剂的制备均要充分考虑干扰 素α与地塞米松磷酸钠的稳定性，尤其是干扰素α的热稳定性、pH稳定性和地 塞米松磷酸钠的化学稳定性。

例如，辅料中应含有有利于干扰素α与地塞米松磷酸钠稳定的缓冲溶液体 系，这样的缓冲溶液体系的pH应该在5.0-8.0之间，这样的缓冲溶液体系包括但 不局限于磷酸盐缓冲溶液体系、枸橼酸盐缓冲溶液体系；应含有干扰素α活性保 护剂，以防止干扰素α活性在长期储存过程中降低或丧失，这样的保护剂包括但 不局限于各种氨基酸、白蛋白和多元醇类物质，例如白蛋白、甘露醇、海藻糖、 右旋糖酐。另外辅料中还优选含有渗透压调节剂，以将溶液的渗透压调节到与身 体内基本等渗，这样的渗透压调节剂包括但不局限于NaCl、甘露醇；优选含有 防止干扰素、地塞米松磷酸钠和其他辅料沉淀和吸附的促溶剂，这样的促溶剂包 括但不局限于吐温-80；优选含有防止药物制剂染菌的防腐剂，这样的防腐剂包 括但不局限于苯扎氯铵、尼泊金酯、苯甲醇等。

在雾化吸入剂的制备过程中，优选将难溶性辅料先用更加适宜的方法溶解后 再和已经溶解的干扰素α、地塞米松磷酸钠及其他辅料混合。制备过程中应快速 混合，注意避免pH、温度等的急剧变化，从而引起药物活性成分干扰素α、地 塞米松磷酸钠的生物失活和/或化学降解。

由于在药物活性成分干扰素α、地塞米松磷酸钠和辅料混合后，药物活性成 分之间，辅料之间，以及每一药物活性成分和辅料之间有可能会发生相互作用， 引起药物活性成分的生物失活和/或化学降解，从而降低雾化吸入剂的临床使用 效果，甚至给雾化吸入剂的临床使用带来安全性问题，所以需要对混合得到的雾 化吸入剂进行必要的检测，以确认这样的生物失活和/或化学降解不存在或很少 存在。所述的雾化吸入剂的必要的检测手段包括但不局限于外观检测(观察干扰 素α、地塞米松磷酸钠和辅料混合后是否有颜色的变化、气体的出现和/或沉淀的 产生)、pH检测、干扰素α生物活性检测、干扰素α含量检测、干扰素α分子量 检测、干扰素αN末端序列检测、干扰素αC末端序列检测、干扰素α氨基酸 组成分析检测、地塞米松磷酸钠含量检测、地塞米松磷酸钠纯度检测等。优选进 行干扰素α活性检测、干扰素α分子量检测、地塞米松磷酸钠纯度和含量检测。

干扰素α活性检测优选采用《中国药典2010版(三部)》规定的标准方法。

干扰素α分子量检测应采用质谱法而不是电泳法，因为质谱法可以检测到干 扰素α氨基酸序列上的微小变化(干扰素α序列上几个氨基酸的降解或替换就会 导致干扰素α分子量的变化，从而可被质谱检测检测到)，而电泳法的灵敏度则 达不到。

地塞米松磷酸钠纯度/含量检测优选采用《中国药典2010版(二部)》规定 的标准反相HPLC法，因为这样的方法可以保证检出地塞米松磷酸钠可能的降解 产物，也可使地塞米松磷酸钠与辅料在检测中能充分分离，从而防止辅料对地塞 米松磷酸钠含量检测的影响。为了确定某一保留时间的色谱峰是地塞米松磷酸钠 降解产物峰还是可溶性辅料成分峰，可以在相同的色谱条件下上各可溶性辅料对 照品，通过保留时间比对进行确定。

根据本领域技术人员公知常识，在采用HPLC法对地塞米松磷酸钠进行含量 检测时，需要在HPLC填料柱上分别上同体积不同浓度的地塞米松磷酸钠对照品 或同浓度不同体积的地塞米松磷酸钠对照品以绘制工作曲线。

在上述各种检测中，如果需要进行溶解处理，但应采用温和的条件防止溶解 过程中干扰素α、地塞米松磷酸钠生物失活和/或化学降解；为了消除可能存在的 沉淀物对检测的影响，需要对沉淀物进行过滤或离心处理；为了消除大分子干扰 素α对小分子地塞米松磷酸钠纯度/含量检测的影响，可以用超滤法除去溶液中 的干扰素α；为了消除小分子可溶性物质对干扰素α检测的影响，可以用超滤、 透析等方法除去溶液中的小分子物质。

在一种优选的实施方案中，本发明的干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入 剂单次给药剂量中含有2.5-30μg的干扰素α与1-4mg的地塞米松磷酸钠，以及 适宜量的可药用辅料。

在一种优选的实施方案中，本发明的干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入 剂单次给药剂量中含有10-20μg的干扰素α与2-3mg的地塞米松磷酸钠，以及适 宜量的可药用辅料。

在一种优选的实施方案中，本发明的干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入 剂中的干扰素α是干扰素α2a、干扰素2b和干扰素α1b中的一种或以任意比例 混合的几种。

在一种优选的实施方案中，本发明的干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入 剂中的干扰素α是干扰素α1b。

本发明的另一个目的是提供干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入剂在制 备治疗病毒性肺炎药物中的应用。利用本发明的雾化吸入剂治疗病毒性肺炎，可 较单独使用干扰素α或地塞米松磷酸钠治疗病毒性肺炎取得明显更好的治疗效 果。

附图说明

图1是地塞米松磷酸钠对照品上DIKMA Platisil C₁₈反相高效液相色谱柱 (4.6×250mm)后获得的色谱图。

具体实施方式

通过如下的实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式并不 局限于如下的实施例。

实施例1：干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入剂的制备

按如下表1的方法制备干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入剂。其中“安 福隆”(商品名)为天津华立达生物工程有限公司生产的规格为50μg/ml/支的重 组人干扰素α2b注射液；“因特芬”(商品名)为沈阳三生制药有限责任公司生产 的规格为50μg/ml/支的重组人干扰素α2a注射液；“运德素”(商品名)为北京三 元基因工程有限公司生产的规格为50μg/ml/支的重组人干扰素α1b注射液，“地 塞米松磷酸钠注射液”为神威药业有限公司生产，规格为5mg/ml/支；“PBS” 为含有0.15mol/L NaCl的25mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH7.0)。 以上各商品名在后续实施例中如无特别指出，含义与本实施例中的含义相同。

表1干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入剂的制备

实施例2：干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后的地塞米松磷酸钠纯度检测

将按实施例1的方法制备得到的各干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入剂 在放置预设的时间后分别用截留分子量为3000Da的Millipore超滤离心管进行超 滤处理，滤过液用去离子水稀释至与超滤离心前体积相同后分别取20μl上 DIKMAPlatisil C₁₈反相高效液相色谱柱(5μm填料粒径，柱尺寸4.6×250mm)， 于柱温25℃下进行色谱操作，流动相三乙胺溶液(取三乙胺7.5ml，加水稀释至 1000ml，用磷酸调节pH值至3.0±0.05)-甲醇-乙腈(35∶55∶10)洗脱，流 速1.0ml/min，检测波长242nm。测定结果如下表2所示。

表2干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后的地塞米松磷酸钠纯度检测结果

  编号   混合后0小时   混合后12小时   混合后24小时   混合后48小时   雾化吸入剂1   99.0％   99.1％   99.0％   99.0％   雾化吸入剂2   98.9％   98.8％   98.8％   98.8％   雾化吸入剂3   99.0％   98.8％   98.7％   98.9％   雾化吸入剂4   99.1％   99.2％   99.0％   99.1％   雾化吸入剂5   99.0％   99.1％   99.1％   99.0％   雾化吸入剂6   98.9％   99.1％   99.0％   99.0％   雾化吸入剂7   99.0％   98.8％   98.8％   98.9％   雾化吸入剂8   99.2％   99.1％   99.3％   99.1％   雾化吸入剂9   99.1％   99.1％   99.1％   99.0％

可见，干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后对地塞米松磷酸钠的纯度没有影 响。

实施例3：干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后的地塞米松磷酸钠含量检测

将地塞米松磷酸钠对照品(中国药品生物制品检定所制备，批号 100016-200914)用水分别溶解稀释至浓度为0.068、0.136、0.272、0.544、 0.816mg/ml后按实施例2的高效液相色谱条件分别上样测定主峰峰面积。用峰面 积(y)对浓度(x)进行线性回归得工作曲线，方程为y＝28000000x-13187，回 归系数为r＝0.9999。

将按实施例1的方法制备得到的各干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入剂 在放置预设的时间后分别按实施例2的方法进行超滤离心处理，滤过液分别用去 离子水稀释至与超滤离心前体积相同后再分别用去离子水稀释到其中的地塞米 松磷酸钠的理论含量在上述工作曲线覆盖的浓度范围内，然后分别按实施例2 的高效液相色谱条件上样测定主峰峰面积。将各测定得到的峰面积代入工作曲 线方程便可得到各稀释后的雾化吸入剂中地塞米松磷酸钠的浓度，再乘以稀释 倍数便可得到各雾化吸入剂中地塞米松磷酸钠的浓度。测定结果如下表3所示。

表3干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后的地塞米松磷酸钠含量检测结果

可见，干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后对地塞米松磷酸钠的含量没有影 响。综合实施例2干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后地塞米松磷酸钠纯度的检测 结果，说明干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后地塞米松磷酸钠没有发生化学降 解。

实施例4：干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后的干扰素α分子量检测

将按实施例1的方法制备得到的各干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入剂 分别对100倍体积的去离子水进行透析(透析袋截留分子量为7000Da)处理， 期间换去离子水一次。对透析液分别进行MALDI-TOF质谱分子量检测，记录分 子量25000Da以下的检测结果如表4所示。在各次检测结果中均只检测到一个 分子量数值，说明干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后未出现干扰素α降解产物。

表4干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后的干扰素α分子量检测结果

实施例5：干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后的干扰素α活性检测

将按实施例1的方法制备得到的各干扰素α与地塞米松磷酸钠的雾化吸入剂 按《中国药典2010版(三部)》规定的干扰素α测活的标准方法分别测定其中的 干扰素α的活性。测定结果如下表5所示。

表5干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后的干扰素α活性检测结果

上述检测结果说明干扰素α与地塞米松磷酸钠混合后对干扰素α的活性没有 影响。

综合实施例4和实施例5的检测结果，说明干扰素α与地塞米松磷酸钠混合 后干扰素α没有发生生物失活和化学降解。

实施例6：干扰素α与地塞米松磷酸钠雾化吸入剂治疗病毒性肺炎的动物试验

1)RSV病毒培养

将呼吸道合胞病毒标准株RSV-Long(引自北京儿科研究所)接种于Hep-2 细胞上，待细胞病变达80％以上时收获，将病毒液冻存于液氮中，用时于37℃ 融化，1000rpm离心10分钟，取上清液备用。

2)RSV小鼠感染模型的建立

取96只小鼠均用乙醚麻醉后，经鼻腔滴入10⁶PFU/ml RSV病毒液0.1ml， 每天滴病毒1次，共滴2次，第3天小鼠出现竖毛、烦躁不安、呼吸急促、腹肌 抽搐阳性反应，表明RSV感染小鼠模型建立成功。

3)分组及给药

将上述已经感染RSV病毒的96只小鼠随机分为12组，每组8只。组1至 组9分别每日超声雾化吸入前述实施例所述的雾化吸入剂1至雾化吸入剂9各 1ml；组10每日超声雾化吸入注射规格为30μg/ml/支的“运德素”一支，组11 每日超声雾化吸入规格为5mg/ml/支的“地塞米松磷酸钠注射液”一支；组12 每日超声雾化吸入生理盐水1ml。所有各组每日均只超声雾化吸入1次，共超声 雾化吸入5次(5天)。5天后取小鼠血进行BALF白细胞计数，结果如下表6 所示。

表6BALF白细胞计数结果