一种防治烟草青枯病的植物源杀菌剂

摘要

本发明属于农药技术领域，特别涉及植物源杀菌剂领域，具体提供了一种防治烟草青枯病的植物源杀菌剂，主要有效成分为苋菜粗提物和无菌水，其中每毫升植物源杀菌剂中含有苋菜粗提物的质量在0.17～0.5毫克之间。本发明具有的优点和较好效果为：1.苋菜菜叶粗提物取材方便，既可工厂化生产，又可由农民直接应用；2.效果显著，其抑制中浓度EC

说明书

技术领域

本发明属于农药技术领域，特别涉及植物源杀菌剂领域，具体涉及一种 防治烟草青枯病的植物源杀菌。

背景技术

苋菜是苋科(Amaranthaceae)苋属中以嫩茎叶为食的一年生草本植物， 富含多种营养成分。苋属全世界约有40种，我国有20余种，分布较广，原 产于中美洲和东南亚的热带与亚热带地区，中国也是苋属植物的原产地之一。 苋菜有两大类，一类是以叶子作为蔬菜食用的蔬菜苋，另一类则主要是收获 种子的籽粒苋，起源于中美洲或南美洲。蔬菜苋的主要品种是Amaranthus  tricolor，起源于南亚或东南亚，并逐渐扩展到热带和亚热带地区，这种蔬菜 在中国寻常人家餐桌上很常见。目前在长江流域以南地区栽培较多，是一种 营养型绿色蔬菜。

已有的研究结果表明：蔬菜苋耐旱耐瘠、抗病虫害能力强，其营养十分 丰富，含有氨基酸、脂肪酸及微量元素等，是一种天然的无公害绿色功能性 食品。美国、英国等国家根据苋菜的特点建立了提取叶蛋白的工厂，将苋菜 叶蛋白列入各种营养食谱；唐业昌等研究认为野苋菜每100g鲜物含有218 kJ的热量，其他营养也相当丰富。特别是苋菜籽中的蛋白质含量比常见植物 种子中含量都高，只是比大豆中的含量低，所含胡萝卜素比茄果类高2倍以 上，其铁的含量比菠菜高1倍，钙的含量则比菠菜高3倍，可为人体提供 丰富的营养物质，有利于强身健体，提高机体的免疫力；另外，还含有芸香 苷、槲皮素、鲨烯、短肽(lunasin)等。然而，苋菜不含草酸，其钙、铁进入 人体后很容易被吸收利用，还是减肥餐桌上的主角，常食可以减肥，促进排 毒，防止便秘。

近年来，随着苋菜研究的不断深入，人们研究发现苋菜的氯仿提取物对 温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、大肠杆菌(E.coli)、李斯特菌 (L.monocytogenes)、沙门菌(Salmonella spp.)、金黄色葡萄球菌(S.aureus) 具有很高的抗菌能力，并且提取分离了活性物质邻苯二甲酸二乙酯(Di-ethyl  phtalate)。Rizzello等在籽粒苋的种子水提取物中提取了抗真菌的活性肽。 Lina等在籽粒苋的种子中提取分离了具有抗菌活性的肽，并且该活性肽对白 色念珠菌(Candida albicans)、木霉菌(Trichoderma sp.)、茄病镰刀菌(Fusrium  solani)、产黄青霉(Penicillium chryso-genum)、荔枝酸腐病菌(Geotrichum  candidum)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、交链孢菌(Altemaria alterata) 等具有抑菌作用。另外也有研究认为野苋菜的乙醇提取物也对以上多种病原 微生物具有抗菌作用，而且从苋菜中提取的蛋白质对黄瓜花叶病毒(CMV) 具有显著的抑制作用。然而，目前的研究仅限于采用苋菜粗提物对食品污染 菌和部分致病真菌的探讨，而对植物致病细菌和真菌的研究较少，本发明基 于这一点，选用苋菜叶粗提物对烟草青枯病的控制效果进行了研究。

烟草青枯病是植物细菌性土传病害，是热带、亚热带和一些温暖地区烟 草的重要病害。目前在我国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、 福建、台湾、湖南、江西、广西东部、安徽南部、四川、重庆及贵州局部烟 区为害严重，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失，并且该病有向北方 烟区扩散的趋势。烟草青枯病病菌是一种土壤习居菌，主要在土壤中的植株 病残体上越冬，通常可以在土壤中存活数年之久，并可以随着流水、根际接 触和农事操作等多种途径广泛传播。该菌系复杂，寄主广泛，除危害烟草外， 还可侵染包括番茄、花生、马铃薯、香蕉等在内的近50个科300多种植物。 所以，烟草青枯病的防治十分困难，该病的防治一直是学术界的一大难题， 倍受重视。

目前针对该病，生产上主要是采用水旱轮作和休田期撒施石灰消毒等农 业措施进行防治，但水旱轮作易受环境和栽培条件的限制，实施起来较困难； 休田期撒施石灰虽可缓解病情，但易造成土壤板结。抗病育种工作也面临很 大的困难。人们尝试筛选一些抗菌素用于青枯菌防治，如链霉素、四环素、 青霉素、放线素酮等，但效果均不够理想。在化学防治上，虽然室内的毒力 测定筛选出不少对青枯病菌有较好抑制作用的化学药剂，但防治效果不稳定， 难以控制病害，迄今为止还没有一种化学农药可以有效地控制青枯病的发生。 因此，大多数的科研者积极探索生物防治烟草青枯病。

以往的研究，主要采用苋菜叶和种子粗提取物研究医疗、食品污染菌和 部分污染真菌，本发明在前期研究的基础上，研究了苋菜粗提取物对烟草青 枯病的控制效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够替代传统化学杀菌剂、对 烟草青枯病的防治效果好的植物源杀菌剂。该植物源杀菌剂可以有效防治烟 草青枯病。

本发明的技术方案之一：

一种植物源杀菌剂，主要有效成分为苋菜粗提物，其中每毫升植物源杀菌 剂中含有苋菜粗提物的质量为0.17毫克～0.5毫克。优选每毫升植物源杀菌剂 中含有苋菜粗提物的质量为0.5毫克。

所述苋菜粗提物的制备方法为：将苋菜叶片清洗晾干，研碎获得苋菜汁液， 再用旋转蒸发仪在温度为40℃-45℃，转速为110r/min-120r/min的条件下旋 转蒸发至膏状，得膏状物，即为所述苋菜粗提物。

本发明的植物源杀菌剂，可以由苋菜粗提物和无菌水组成，其中每毫升植 物源杀菌剂中含有苋菜粗提物的质量为为0.17毫克～0.5毫克，优选每毫升植 物源杀菌剂中含有苋菜粗提物的质量为0.5毫克。

本发明的植物源杀菌剂在防治烟草青枯病方面的应用。

本发明的技术方案之二：

本发明提供了苋菜粗提物在制备防治烟草青枯病植物源杀菌剂方面的应 用。

与现有技术相比，本发明具有的优点为：

1、本发明的植物源杀菌剂效果好，其抑制中浓度EC₅₀为0.0415mg/mL， 防病效果最好达到了90.29％，明显高于现有烟草青枯病杀菌剂的防病效果。

2、苋菜粗提物仿生农药毒性低、无公害，对环境安全，方便使用，又节 约成本。

3、本发明的成本低，易于大面积推广应用，盆栽烟草青枯病防治效果在 77.00～90.29％之间，显著高于现有烟草青枯病杀菌剂的防病效果。

4、苋菜粗提物选择性强，对人畜安全。

附图说明

图1是苋菜粗提物对烟草青枯病菌的拮抗效果图。

具体实施方式

下面结合具体试验和实施例对本发明的技术方案作进一步说明，本发明 试验和实施例中涉及的百分比均为质量百分比。

本发明所使用的苋菜粗提物可以用研钵将苋菜叶片研碎取其汁液，生产 技术成熟；原料供应充足，而且是可再生资源；获得途径多样，既可规模化 人工种植，也可采集野生植株。

实施例1：

一、实验仪器

HG-303型电热干燥培养箱(南京实验仪器厂)；RE-52A型旋转浓缩蒸发 仪(上海亚荣生化仪器厂)；LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌消毒器(上海申安 医疗器械厂)；SW-CJ-2FD型净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)； BCD-23O冰箱(Haier集团公司)；AUW-220电子天平(日本岛津公司)；工 农-16型人工背负式喷雾器(湖南农业大学生物安全实验室提供)；研钵、量 筒、烧杯、称量纸、培养皿、直尺、打孔器、试管、移液枪、塑料盆等常用 试验用品均有湖南农业大学生物安全科学技术学院提供。

二、实验试剂

本发明使用的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC由国药集团化学试剂有 限公司购买)；硫酸链霉素，(由华北制药集团购买)；77％可杀得湿性粉剂(由 美国国信公司购买)；25％多菌灵可湿性粉剂(由四川国光农化有限公司购买)； 3％克菌康可溶性粉剂(由厦门凯利生物制品有限公司购买)；牛肉膏、蛋白胨、 琼脂等其他常用试剂(由天根生化北京有限公司购买)；试验用的无菌水由湖 南农业大学生物安全科学技术学院提供。

三、菌种和烟草品种

烟草青枯病菌标准菌株，由湖南农业大学植物病理学实验室提供；烟草 品种为K326。

四、苋菜粗提物的制备

将新鲜的苋菜叶片用水冲洗完泥土后晾干，使用研钵把叶片研碎获得新 鲜的苋菜汁液，再使用旋转蒸发仪在温度为40℃～45℃，转速为110r/min～120 r/min的条件旋转蒸发至膏状，最后将膏状物放到三角瓶中，置于4℃冰箱备 用。

五、苋菜粗提物对烟草青枯病菌的拮抗活性检测

采用平皿打孔法。将烟草青枯病菌悬浮液(1×10⁸cfu/mL)200μL均匀涂 布于牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，然后打孔将待测粗提物注入孔内， 每孔50μL，28℃培养24h，观察抑菌状况及抑菌圈大小，每个处理3次重复。

六、苋菜粗提物对烟草青枯病菌的室内毒力测定

根据前期进行预备试验结果，将苋菜粗提物用无菌水分别配成浓度为0.5、 0.25、0.17、0.125、0.1mg/mL的标准溶液各1L，置于冰箱中备用。

烟草青枯病菌菌液制备

参照方中达的方法，先将烟草青枯病菌(细菌)在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面 培养基上培养24h后，缓慢加入无菌水轻微振荡将细菌洗于无菌水中配成细 菌悬浮液，采用TTC培养基平板计数法配制浓度为1×10⁸细菌悬浮液。

七、烟草青枯病菌的室内抑菌测定

在含有1×10⁸细菌悬浮液的试管中，分别加入苋菜粗提物浓度为0.5、0.25、 0.17、0.125、0.1mg/mL，硫酸链霉素浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05mg/mL， 可杀得浓度为10、5、2.5、1.25、0.625mg/mL，多菌灵浓度为2、1、0.5、0.25、 0.125mg/mL，克菌康浓度为4、2、1、0.5、0.25mg/mL，并以清水为对照，于 室温下静置0.5h，然后取0.1mL含药剂的细菌悬浮液于TTC牛肉膏蛋白胨 培养基上涂布，置于28℃暗培养48h，计算活菌数，每处理3次重复。然后， 通过菌落生长抑制概率值和提取物浓度对数值之间的线性回归分析 (y＝a+bX)，求出苋菜提取物对供试烟草青枯菌的有效抑制中浓度EC₅₀(mg/mL)。

实施例2：

苋菜粗提物对烟草青枯病的盆栽实验

盆栽实验选择在湖南农业大学植物医院温室大棚内进行，先将培育好的 烟草幼苗移栽到塑料盆内，移栽10d后采用茎部穿刺接种烟草青枯病菌，保 持大棚内温度白天29～32℃，晚上21～24℃，湿度为90％，以使不同盆内 的烟草均匀发病。盆栽实验共分为6个处理即：0.5、0.25、0.17、0.125、0.1mg/mL 苋菜粗提物和0.82mg/mL硫酸链霉素处理，并以清水为空白对照，每处理需 要烟苗100棵，每处理重复3次，在病害始发期施药，每隔10d施1次药， 共施药3次，每次试验用工农-16型人工背负式喷雾器施药，以喷湿叶片正反 面药液刚不下滴为度，用药液量5kg/百株。

取样和调查：

在处理区和对照区调查烟草青枯病的发病情况。调查对作物的其他影响； 观察是否有药害产生，有药害则记录药害程度；样品则采用五点取样法，选 择有代表性的烟株100株作为定点株，分别在是要后7d进行调查。按病情分 级标准，记录发病情况，计算各处理病株率、病情指数及防治效果。取样法、 分级标准和病情指数按全国烟草行业烟草病害调查分级标准 GB/T23222-2008进行，防治效果按烟草病害药效试验方法Yc/40-1996进行。 各级别分级标准及结果计算方法如下：

0级：全株无病。

1级：茎部偶有褪绿斑，或病侧二分之一以下叶片凋萎。

3级：茎部有黑色条斑，但不超过茎高二分之一，或病侧二分之一至三分之二 叶片凋萎。

5级：茎部黑色条斑超过茎高二分之一，但未到达顶部，或病侧三分之二以上 叶片凋萎。

7级：茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部凋萎。

9级：病株基本枯死。

药效计算方法：

结果与分析：

苋菜粗提物对烟草青枯病菌的拮抗效果

由图1所示，将苋菜粗提物对烟草青枯病菌具有较强的抑制效果，这一 结果证明本发明的苋菜粗提物对植物病害有抑制作用，并获得对烟草青枯病 有拮抗效果的结论。

苋菜粗提物对烟草青枯病菌的室内毒力测定结果

从表1中可以看出，苋菜粗提取液对烟草青枯病菌的毒力最强，其EC₅₀为0.0415mg/mL，其次为硫酸链霉素，余下药剂的毒力从大到小依次为：克 菌康＞多菌灵＞可杀得，因此，苋菜粗提物对烟草青枯病菌具有较好的抑制效 果，优于现有烟草青枯病杀菌剂，可有效控制烟草青枯病菌的发生。另外， 由于苋菜粗提物属于生物活性物质，对环境安全、高效、无毒、不存在抗药 性问题，具有进一步开发仿生农药的可能性。

表1苋菜粗提物对烟草青枯病菌的室内毒力测定

苋菜粗提物对烟草青枯病的盆栽实验效果：

由表2可知，3次施药后的防病效果依次为：第一次防病效果＞第二次防 病效果＞第三次防病效果，说明在一定时间范围内，防治烟草青枯病菌越早 越好。从不同浓度的苋菜粗提物分析，当苋菜粗提物的浓度为0.5mg/mL时， 防病效果最好达到了90.29％，随着苋菜粗提物浓度的降低，防病效果逐渐降 低，其中苋菜粗提物浓度在0.17～0.5mg/mL时，不同浓度粗提物的防病效果， 均高于硫酸链霉素的控制效果，以上几点显示在一定的苋菜浓度范围内，粗 提物中的防病物质比硫酸链霉素的活性强。当苋菜粗提物浓度为 0.1～0.125mg/mL时，苋菜粗提物的防病效果低于硫酸链霉素，其最差防病效 果为66.88％，这说明过低浓度的苋菜粗提物防病效果差。因此，苋菜粗提物 对烟草青枯病菌的最优防病范围在77.00～90.29％之间；方差分析结果表明： 不同浓度苋菜粗提物的处理之间差异显著，其中当苋菜粗提物浓度为 0.5mg/mL时，防病效果差异极显著。

表2不同浓度苋菜粗提物对烟草青枯病菌的盆栽控制效果

注：表中的数值均为3次平均值；不同小写字母表示显著差异(p＜0.05)，不 同大写字母表示极显著差异(p＜0.01)。

药剂评价

苋菜粗提物对烟草青枯病有较好的防治效果，其中当苋菜粗提物浓度为 0.17～0.5mg/mL时防病效果在77.00％～90.29％，明显高于硫酸链霉素的防病效 果，并达到了极显著水平。由于该粗提物防病效果稳定，高效、安全、无污 染，是防治烟草青枯病的良好粗提物。另外，根据药后系统观察，试药期间 未见明显药害发生，各试验药剂对作物生长无不良影响。