公开/公告号CN102406749A
专利类型发明专利
公开/公告日2012-04-11
原文格式PDF
申请/专利权人 九芝堂股份有限公司;
申请/专利号CN201010555455.1
申请日2010-11-22
分类号A61K36/804(20060101);A61K9/16(20060101);G01N30/02(20060101);G01N30/06(20060101);G01N30/36(20060101);A61P7/06(20060101);A61K35/36(20060101);
代理机构11278 北京连和连知识产权代理有限公司;
代理人贺小明
地址 410008 湖南省长沙市芙蓉中路一段129号
入库时间 2023-12-18 04:47:14
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-08-28
授权
授权
2013-02-27
著录事项变更 IPC(主分类):A61K36/804 变更前: 变更后: 申请日:20101122
著录事项变更
2012-05-23
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K36/804 申请日:20101122
实质审查的生效
2012-04-11
公开
公开
技术领域
本发明涉及药学领域中质量控制的运用方法,尤其涉及一种同时测定 驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法。
背景技术
在驴胶补血制剂的处方中,阿胶是君药,所占的比例最大,是中国传 统的补血药,其中阿胶中的蛋白质和氨基酸是其补益药效的营养物质基 础。
在中药部颁标准中,驴胶补血颗粒检查项中有针对阿胶的总氮量的检 查。总氮量的测定方法只能粗略地反映样品中含氮的化合物的量,不能很 好地反映阿胶中蛋白质和氨基酸的情况。
现有文献中,也仅有记载:高效液相色谱_蒸发光散射法测定驴胶补 血颗粒中黄芪甲苷的含量、高效液相色谱法测定驴胶补血颗粒中阿魏酸含 量、驴胶补血颗粒中微量铁的含量测定”,也并没有记载对氨基酸的含量 测定。
尽管2010版药典中收载了阿胶原料氨基酸的含量测定,但仅限于单 方药材,而且样品的处理方法较复杂,只测定了其中L-羟脯氨酸、甘氨酸、 丙氨酸、L-脯氨酸4种氨基酸的含量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含 量的HPLC测定方法,其主要包含步骤:
1)将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中,加入5-7mol/l(最佳为6mol/l) 盐酸,130℃-160℃(最佳为150℃)水解,将水解后的溶液移入蒸发皿中, 用水洗涤,将洗液并入蒸发皿,水浴蒸干,残渣加入0.1mol/L盐酸溶液溶 解,转移至量瓶中,加入0.05-0.15mol/L(最佳为0.1mol/L)盐酸溶液稀释, 摇匀、离心后取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液;
2)取6种氨基酸对照品:L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨 酸、L-精氨酸和L-脯氨酸,将以上6种氨基酸对照品加入0.1mol/L盐酸 溶液溶解,制得氨基酸混合标准品溶液;
3)将步骤1)所述驴胶补血制剂待测品溶液和步骤2)所述基酸混合 标准品溶液分别加入异硫氰酸苯酯-乙腈溶液中,混匀、静置后分别加入 正己烷,再次混匀、静置后分别取其下层溶液,进行过滤,得衍生化后的 驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液;
4)吸取步骤3)获得的衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后 的氨基酸标准品溶液注入液相色谱仪,进行驴胶补血制剂中氨基酸的测 定,其中,色谱条件为:填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶;流动相A为乙 腈与醋酸钠、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾三种中的任意一种或两种的组合, 流动相B为乙腈-水,检测波长为254nm,流速为1.0ml·min-1,柱温为 30℃,按下表中的梯度进行洗脱:
5)根据步骤4)所得色谱图计算驴胶补血制剂中L-谷氨酸、L-羟脯 氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸的含量。
步骤1)具体可以为:将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中,精密称定, 加入5-7mol/l盐酸5ml,置酒精喷灯上拉丝封口,超声30分钟使其溶解, 130℃-160℃水解,放冷,移入蒸发皿中,用10ml水分次洗涤,洗液并入 蒸发皿,水浴蒸干,残渣加入0.1mol/L盐酸溶液溶解,转移至量瓶中,加 入0.05-0.15mol/L盐酸溶液稀释至刻度,摇匀,离心后取上清液即得驴胶 补血制剂待测品溶液。
步骤1)更具体地可以为:将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中,精密称 定,加入6mol/l盐酸5ml,置酒精喷灯上拉丝封口,超声30分钟使其溶 解,150℃水解1小时,放冷,移入蒸发皿中,用10ml水分次洗涤,洗液 并入蒸发皿,水浴蒸干,残渣加入0.1mol/L盐酸溶液溶解,转移至25ml 量瓶中,加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度,摇匀,3000r/min离心5分 钟取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液。
步骤2)具体可以为:取6种氨基酸对照品:L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、 甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸,将以上6种氨基酸对照品加入 0.1mol/L盐酸溶液溶解制成每1ml分别含L-谷氨酸73.1μg、L-羟脯氨酸 86.4μg、甘氨酸0.1609mg、L-丙氨酸64.8μg、L-精氨酸59.3μg、L-脯氨 酸93.9μg的混合溶液,即得氨基酸混合标准品。
步骤3)具体可以为:将步骤1)所述驴胶补血制剂待测品溶液和步 骤2)所述基酸混合标准品溶液分别置10ml离心管中,加入0.1mol/L异 硫氰酸苯酯-乙腈溶液1.0ml,1mol/L三乙胺-乙腈溶液1.0ml,漩涡混合1 分钟,室温放置1小时后,加入4ml正己烷,振摇,漩涡混合1分钟后, 放置10分钟,取下层溶液,微孔滤膜滤过,即得衍生化的标准品溶液和 衍生化的待测品溶液。
所述的方法,步骤4)中,流动相A中,醋酸钠的浓度为0.1mol/L。 乙腈与0.1mol/L醋酸钠的比例为3∶97。
所述的方法,步骤4)中,流动相B中,乙腈与水的比例为4∶1。
本发明所具有的有益技术效果,至少包含:
a.本发明所述的同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC 测定方法,首次将液相色谱技术应用于复方制剂(驴胶补血制剂)中同时 测定L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸共 6种氨基酸的含量。
本技术领域的技术人员公知的是,复方制剂中包含多种成分,要测定 其中某一种物质的含量,受到的干扰远远大于单方药材中的干扰。正因为 如此,尽管在2010版中国药典中,收载了阿胶原料中氨基酸的含量测定, 但其仅用于测定单方药材中的氨基酸,在含有阿胶的其他复方中药中皆未 采用HPLC进行氨基酸的含量测定,而且,药典中收载的阿胶原料中氨基 酸的含量测定方法所测定的氨基酸的种类也仅有4种,且处理方法复杂。
所以,本发明的方法解决了复方中药制剂中氨基酸含量测定的技术难 题,并且扩展了能同时测定的氨基酸的种类,为更好地控制驴胶补血制剂 的质量提供了一种可靠、有效的方法。
b.本发明提供的同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC 测定方法,样品处理方法较简单,选择了6种主要的氨基酸含量测定能较 好地反映阿胶中蛋白质及氨基酸的情况,测试方法的专属性、重复性、准 确度都较好,能很好地控制驴胶补血制剂的内在质量。
c.本发明通过柱前衍生化法,采用反相高效液相测定了驴胶补血制剂 中6种主要氨基酸的含量,本方法对仪器的要求和操作人员的操作熟练程 度的要求较低,很容易普及推广,并且能得到很好的重现性。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂,下文特举 较佳实施例,并配合附图,作详细说明如下。
附图说明
图1是6种氨基酸混合标准品HPLC色谱图;
图2是驴胶补血颗粒流动相1色谱图;
图3是驴胶补血颗粒流动相2色谱图;
图4是驴胶补血颗粒流动相3色谱图。
具体实施方式
仪器与试药
仪器:岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪,SPD-10Avp紫外可见检测器, N2000数据工作站;KQ2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公 司);AE240分析天平(METTLER);SZ-1型旋涡混合器(金坛市大地 自动化仪器厂);DHG-9101-15A型电热恒温鼓风干燥箱(扬州鸿都电子 有限公司);Milli-Q A10型超纯水机(美国密里博公司);80-2型离心机 (上海手术器械厂);色谱柱:大连依利特公司Hypersil ODS2 C18色谱柱 (4.6mm×200mm,5μm)。
试药:
驴胶补血颗粒样品17批由湖南省九芝堂股份有限公司提 供,批号:200801090、200806016、200811091、200901010、200903002、 200908029、200909036、200909066、200909068、200909069、200909071、 200909072、200909073、200909075、200909076、200909077、200909078;
L-谷氨酸对照品(140690-200401)、L-羟脯氨酸对照品 (111578-200201)、甘氨酸对照品(110735-200102)、L-丙氨酸对照品 (140680-200401)、L-精氨酸对照品(140685-200802)、L-脯氨酸对照品 (140677-200405)由中国药品生物制品检定所提供(供含量测定用);乙 腈为色谱纯;异硫氰酸苯脂为化学纯;其他试剂均为分析纯;水为超纯水。
实施例1 6种氨基酸混合标准品的制备
取L-谷氨酸对照品、L-羟脯氨酸对照品、甘氨酸对照品、L-丙氨酸对 照品、L-精氨酸对照品、L-脯氨酸对照品适量,精密称定,加0.1mol/L盐 酸溶液制成每1ml分别含L-谷氨酸73.1μg、L-羟脯氨酸86.4μg、甘氨酸 0.1609mg、L-丙氨酸64.8μg、L-精氨酸59.3μg、L-脯氨酸93.9μg的混合溶 液,即得6种氨基酸混合标准品。
实施例2待测品溶液的制备
方法1.将待测的驴胶补血颗粒研磨成粉后,取0.25g置安瓿瓶中,精 密称定,加5mol/l盐酸5ml,置酒精喷灯上拉丝封口,超声30分钟使其溶解, 130℃水解1小时。放冷,移入蒸发皿中,用10ml水分次洗涤,洗液并入蒸 发皿,水浴蒸干。残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解,转移至25ml量瓶中,加 0.05mol/L盐酸溶液稀释至刻度,摇匀,3000r/min离心5分钟取上清液即得 待测品溶液。
方法2.将待测的驴胶补血颗粒研磨成粉后,取0.25g置安瓿瓶中,精 密称定,加6mol/l盐酸5ml,置酒精喷灯上拉丝封口,超声30min使其溶解, 150℃水解1小时。放冷,移入蒸发皿中,用10ml水分次洗涤,洗液并入蒸 发皿,水浴蒸干。残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解,转移至25ml量瓶中,加 0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度,摇匀,3000r/min离心5分钟取上清液即得 待测品溶液。
方法3.将待测的驴胶补血颗粒研磨成粉后,取0.25g置安瓿瓶中,精 密称定,加7mol/l盐酸5ml,置酒精喷灯上拉丝封口,超声30分钟使其溶解, 160℃水解1小时。放冷,移入蒸发皿中,用10ml水分次洗涤,洗液并入蒸 发皿,水浴蒸干。残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解,转移至25ml量瓶中,加 0.15mol/L盐酸溶液稀释至刻度,摇匀,3000r/min离心5分钟取上清液即得 待测品溶液。
实施例3衍生化
取上述标准品溶液和待测品溶液各2ml,分别置10ml离心管中,加入 0.1mol/L异硫氰酸苯酯(PITC)-乙腈溶液(取120μl异硫氰酸苯脂于10ml 容量瓶中,乙腈稀释并加至刻度,摇匀,当日配制当日使用)1.0ml,1mol/L 三乙胺-乙腈溶液(取三乙胺1.4ml于10ml容量瓶中,乙腈稀释并加至刻度, 摇匀)1.0ml,漩涡混合1min,室温放置1小时后,加入4ml正己烷,振摇, 漩涡混合1min后,放置10分钟,取下层溶液,微孔滤膜滤过,即得衍生化 的标准品溶液和衍生化的待测品溶液。
实施例4色谱测定
分别精密吸取衍生化后的标准品溶液与待测品溶液各5μl,注入液相 色谱仪,进行测定。
其中,流动相1:以乙腈-0.1mol/L醋酸钠溶液(3∶97)为流动相A(称 取13.2g结晶醋酸钠,加水970ml溶解,用冰醋酸调节pH值至6.5,加乙腈 30ml,摇匀,微孔滤膜滤过即得),以乙腈-水(4∶1)为流动相B,按表1 进行梯度洗脱。
流动相2:以乙腈-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液(3∶97)为流动相A(称取 13.4g结晶醋酸钠,加水970ml溶解,用冰醋酸调节pH值至6.5,加乙腈30ml, 摇匀,微孔滤膜滤过即得),以乙腈-水(4∶1)为流动相B,按表1进行梯度 洗脱。
流动相3:以乙腈-0.1mol/L磷酸二氢钾溶液(3∶97)为流动相A(称取 13.2g结晶醋酸钠,加水970ml溶解,用冰醋酸调节pH值至6.5,加乙腈30ml, 摇匀,微孔滤膜滤过即得),以乙腈-水(4∶1)为流动相B,按表1进行梯度 洗脱。
表1梯度洗脱表
检测波长:254nm;流速:1.0ml·min-1;柱温:30℃;进样量:5μl。
色谱测定时,在选定的色谱条件下,经HPLC法测定L-羟脯氨酸和样 品中其它组的峰可达基线分离,且与其它相邻峰分离度大于1.5;按L-羟脯 氨酸计算,理论板数在4000以上。色谱图请参照图1-2,图1是6种氨基酸 混合标准品HPLC色谱图;图2是驴胶补血颗粒流动相1色谱图;图3是驴胶 补血颗粒流动相2色谱图;图4是驴胶补血颗粒流动相3色谱图。
实施例5线性关系考察
分别精密称取L-谷氨酸对照品、L-羟脯氨酸对照品、甘氨酸对照品、 L-丙氨酸对照品、L-精氨酸对照品、L-脯氨酸对照品,加0.1mol/L盐酸溶 液制成每1ml分别含L-谷氨酸0.338mg、L-羟脯氨酸0.356mg、甘氨酸 0.762mg、L-丙氨酸0.324mg、L-精氨酸0.236mg、L-脯氨酸0.506mg的混 合溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml, 分别置于10ml容量瓶中,用0.1mol/L盐酸加至刻度,摇匀,分别衍生化。 分别吸取5μl注入液相色谱仪中,测定其峰面积积分值,以对照品浓度为 横坐标,相应峰面积积分值为纵坐标,绘制标准曲线,并计算回归方程, L-谷氨酸回归方程为:y=419353x+25116,r=0.9995;L-羟脯氨酸回归 方程为:y=1322317x+28128,r=0.9999;甘氨酸回归方程为:y=1917735x +167893,r=0.9995;L-丙氨酸回归方程为:y=1240844x+59284,r= 0.9995;L-精氨酸回归方程为:y=495902x+9913.5,r=0.9996;L-脯氨 酸回归方程为:y=1497459x+41779,r=0.9999。结果表明L-谷氨酸在 0.169~1.014μg范围内;L-羟脯氨酸在0.178~1.068μg范围内;甘氨酸在 0.381~2.286μg范围内;L-丙氨酸在0.162~0.972μg范围内;L-精氨酸在 0.118~0.708μg范围内;L-脯氨酸在0.253~1.518μg范围内均具有良好的线 性关系。结果见表2~7。
表2L-谷氨酸线性关系考察结果表
表3L-羟脯氨酸线性关系考察结果表
表4甘氨酸线性关系考察结果表
表5L-丙氨酸线性关系考察结果表
表6L-精氨酸线性关系考察结果表
表7L-脯氨酸线性关系考察结果表
实施例6仪器精密度试验
取装量差异合格的本品(批号:200909072),研细,取约0.25g,依法 制备供试品溶液并进行衍生化。精密吸取同一份衍生化后的供试品溶液 5μL,重复进样6次,测定其峰面积积分值,结果见表8。
表8精密度试验(n=6)
结果:6种氨基酸的峰面积积分值RSD均小于2.0%,表明本方法精密 度良好。
实施例7被测溶液稳定性试验
取装量差异合格的本品(批号:200909072),研细,取约0.25,照上 述方法制备供试品溶液并进行衍生化后,分别于0、2、4、8、12、24小时 进样5μL,测定其峰面积,结果见表9。
表9稳定性试验(n=6)
结果:6种氨基酸的峰面积积分值RSD均小于2.0%,供试品溶液在24 小时内基本稳定。
实施例8重复性试验
取同一批号样品(批号:200909072)6份,照上述方法平行制备供试 品溶液,进行衍生化后测定样品中L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙 氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸含量,结果见表10。
表10重复性试验(n=6)
结果:六种氨基酸含量RSD均小于2%,本方法重复性好。
实施例9准确度试验
取同一批号(批号:200909072)样品约0.125g,共6份,精密称定, 分别精密加入混合对照品溶液(L-谷氨酸对照品浓度为0.997mg.mL-1、L- 羟脯氨酸对照品浓度为1.08mg.mL-1、甘氨酸对照品浓度为2.222mg.mL-1、 L-丙氨酸对照品浓度为0.893mg.mL-1、L-精氨酸对照品浓度为 0.705mg.mL-1、L-脯氨酸对照品浓度为1.43mg.mL-1)1mL,以下操作按前 述含量测定项下的方法进行,按下式计算加样回收率,结果见表11-17。
表11谷氨酸回收率测定结果表
表12羟脯氨酸回收率测定结果表
表13甘氨酸回收率测定结果表
表14丙氨酸回收率测定结果表
表15精氨酸回收率测定结果表
表16脯氨酸回收率测定结果表
表17六种氨基酸含量之和回收率测定结果表
结果:谷氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸及脯氨酸的平均 回收率分别为101.43%,101.23%,102.87%,102.37%,102.73%,98.69%; RSD分别为3.20%,3.25%,2.32%,3.36%,2.41%,2.34%;六种氨基酸 含量之和平均回收率为101.54%,RSD为1.37%,本方法回收率较好。
实施例10驴胶补血颗粒成品含量测定
按拟定的含量测定方法测定17批驴胶补血颗粒成品中L-谷氨酸、L-羟 脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸的含量,结果见表18。
表18含量测定结果(n=2)
结果:17批驴胶补血颗粒L-谷氨酸的平均含量为0.743%,L-羟脯氨 酸的平均含量为0.880%,甘氨酸的平均含量为1.817%,L-丙氨酸的平均 含量为0.692%,L-精氨酸的平均含量为0.579%,L-脯氨酸的平均含量为 1.190%,6种氨基酸平均含量和为5.900%,按平均含量的80%计算,所以 本品的含量限度为L-谷氨酸不得少于0.6%,L-羟脯氨酸不得少于0.7%, 甘氨酸不得少于1.5%,L-丙氨酸不的少于0.6%、L-精氨酸不得少于0.5%, L-脯氨酸不得少于1.0%,6种氨基酸含量之和不得少于5.0%。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上,然其并非用以限定本发明,任 何所属技术领域的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围内,当可作些 许的更动与改进,因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
机译: 胶态铋果胶或含胶态铋果胶制剂中铋含量的测定方法
机译: 胶态铋果胶或胶态铋果胶制剂中铋含量的测定方法
机译: 胶态铋果胶或含胶态铋果胶制剂中铋含量的测定方法