低聚异麦芽糖的生产及其用途

摘要

本发明描述了从碳水化合物底物制备低聚异麦芽糖(“IMO”)的方法，及其用途。在存在产麦芽糖酶和其他IMO前体的条件下，曲霉属的转化酶能够由淀粉浆液生产IMO。转化酶作为转葡糖苷酶发挥功能的能力赋予了用于IMO糖化的同步机制。

说明书

本申请要求2010年8月24日提交的美国临时专利申请号61/376,545的优 先权，其通过全文引入作为参考。

技术领域

本技术一般涉及用源自黑曲霉(Aspergillus niger)和/或米曲霉(Aspergillus  oryzae)的转化酶(invertase)生产低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharides)的方 法，及其用途。所述方法从碳水化合物底物生产低聚异麦芽糖。

背景

提供下列说明帮助读者的理解。所提供的任何信息或其引用的参考文献都 不被认为是现有技术。

低聚异麦芽糖(“IMO”或“IMOs”)是混合连接的低聚糖(mixed linkage  oligosaccharide)，具有α-1，4和/或α-1，6糖苷键(glucosidic linkage)的混合物。 IMO包括异麦芽糖、潘糖(panose)、异麦芽三糖(isomaltotriose，isomaltotetraose， isopanose)、异麦芽四糖(isomaltotetraose)、异潘糖(isopanose)、或其他高级支 链低聚糖，例如低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖和低聚龙胆糖 (gentiooligosaccharide)。IMO生产是通过复杂的酶促过程(enzymatic process)发生 的，藉此起始原材料转化为麦芽糖底物，例如玉米糖浆。随后，通过酶催化的 转葡萄糖苷(transglucosidic)反应合成IMO。

IMO属于一类划分为功能性健康食品低聚糖(“FHFO”)的低聚糖。当有 规律地消耗时，IMO与提高的健康状态相关联，有时被称为“益生元 (prebiotics)”。益生元被定义为不可消化的物质，例如膳食纤维，通过刺激共生 或有益微生物的生长而对个体产生一些生物学效应。IMO可用作增甜产品 (sweetening product)，用于食品和饮料中。

概述

在一个方面，本公开内容提供了用于制造低聚异麦芽糖组合物的方法，该 方法包括步骤：(a)将淀粉浆液与液化酶(liquefaction enzyme)接触，和(b) 将步骤(a)的产物与产麦芽糖酶(maltogenic enzyme)和转化酶接触，其中分 别的、顺序的或同时的与所述产麦芽糖酶和转化酶接触，以产生低聚异麦芽糖。

在一个具体实施方式中，所述产麦芽糖酶和转化酶是同时接触的。在一个 具体实施方式中，所述浆液包含按重量计15％至45％的淀粉。在一个具体实施 方式中，所述转化酶按重量计是步骤(b)的所有反应物的至少0.0009％。在一 个具体实施方式中，所述转化酶按重量计少于步骤(b)的所有反应物的2％。 在一个具体实施方式中，步骤(b)在高于2和低于10的pH下发生。在一个具 体实施方式中，步骤(b)在高于10℃和低于85℃的温度下发生。

在一个方面，低聚异麦芽糖选自异麦芽糖、支化的葡萄糖、DP3葡萄糖、 潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、异麦芽五糖、异麦芽六糖和异麦芽七糖，或 其任意的组合。在一个具体实施方式中，至少10％的所产生的低聚异麦芽糖是 潘糖。在一个具体实施方式中，所述方法进一步包括纯化所述低聚异麦芽糖。

在一个具体实施方式中，所述液化酶是α-淀粉酶。在一个具体实施方式中， 所述产麦芽糖酶是β-淀粉酶。在一个具体实施方式中，所述转化酶具有转葡糖 苷活性。在一个具体实施方式中，所述转化酶是曲霉的转化酶。在一个具体实 施方式中，所述曲霉的转化酶是黑曲霉转化酶。额外的或可选的，在一些具体 实施方式中，所述曲霉的转化酶是米曲霉转化酶。

在一个具体实施方式中，所述浆液是由一种或多种淀粉和液体(liquid)形 成的。在一个具体实施方式中，所述一种或多种淀粉选自玉米淀粉、大米淀粉、 小麦淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、甘薯淀粉、西米淀粉、大麦淀粉、热/酸处 理的淀粉、珍珠淀粉、蜡质玉米淀粉、高粱淀粉、高直链淀粉的玉米淀粉、液 体右旋糖(liquid dextrose)，及其组合。在一个具体实施方式中，所述淀粉是玉 米淀粉。

在一个方面，通过用于制造低聚异麦芽糖组合物的方法生产低聚异麦芽糖 组合物，所述方法包括：(a)将淀粉浆液与液化酶接触，和(b)将步骤(a) 的产物与产麦芽糖酶和转化酶接触，其中与所述产麦芽糖酶和转化酶分别的、 顺序的或同时的接触。

在一个方面，通过用于制造低聚异麦芽糖组合物的方法生产包含低聚异麦 芽糖的食品添加剂，所述方法包括：(a)将淀粉浆液与液化酶接触，和(b)将 步骤(a)的产物与产麦芽糖酶和转化酶接触，其中与所述产麦芽糖酶和转化酶 分别的、顺序的或同时的接触。

在一个方面，通过用于制造低聚异麦芽糖组合物的方法生产包含至少一种 食品成分和低聚异麦芽糖的食物产品，所述方法包括：(a)将淀粉浆液与液化 酶接触，和(b)将步骤(a)的产物与产麦芽糖酶和转化酶接触，其中与所述 产麦芽糖酶和转化酶分别的、顺序的或同时的接触。

附图简介

图1是描述常规糖化反应和同步糖化反应的图表。

图2是描述在常规糖化反应和同步糖化反应的过程中IMO含量改变的图 表。

详细说明

本文公开了用于生产低聚糖，特别是IMO的方法。本文进一步公开了用于 商业化生产IMO的方法、步骤和反应，所述方法、步骤和反应使用的步骤产生 了用于便利的IMO生产的改良方法。

在下列详细的说明书中，在详细的说明书、附图和权利要求中描述的示例 性具体实施方式并非意在限制。在不脱离上述主题的精神和范围的条件下，可 以利用其它的具体实施方式，和进行其它的改变。在以下的说明书中，多个术 语是广义的使用的。通过整体参考说明书，可以更全面的理解下文描述的术语。 可以用其可接受的SI形式标识单位、前缀和符号。

除非明确的说明了单数形式，否则本文所用的术语“a”和“an”意指“一个 或多个”。因此，例如，指代“a carbohydrate”包括两种或多种碳水化合物的混合 物，以及单种的碳水化合物。

作为这里所使用的，“约”将被本领域普通技术人员所理解并将一定程度上 依赖于使用它的上下文而不同。假设在其所使用的背景中，如果这里使用了对 于本领域普通技术人员不清楚的术语，“约”将意味着最多±10％的该特定术语 含义。

作为这里所使用的，术语“碳水化合物”将被本领域技术人员理解为包括 多羟基-醛或-酮以及由此衍生的化合物。碳水化合物可以包括至少由一个基本的 单糖单位组成的化合物。它们可以被归类为简单的碳水化合物和复杂的碳水化 合物。简单的碳水化合物是单糖和二糖。复杂的碳水化合物是多糖，或由直链 或支链的单糖组成的大分子。如本文使用的，术语“液化糖浆(liquefaction syrup)” 或“液化糖浆(liquefying syrup)”指已经与液化酶反应的碳水化合物底物，例如淀 粉，所述液化酶例如但不限于α-淀粉酶。液化糖浆是通过液化反应产生的。

如本文使用的，术语“液化反应”指降低混合物中的一种或多种碳水化合物 的粘度和/或增加其流动性的酶促或化学反应。

如本文使用的，术语“转葡糖苷的”或“转葡糖苷酶”指催化水解和/或转移反 应以形成新的α-1，6键的酶或活性。这类酶包括但不限于转葡糖苷酶和转化酶。

如本文使用的，术语“液化酶”或“液化酶”可以是多种α-淀粉酶或其它淀粉 酶中的一种。液化酶影响淀粉的流动性或粘度，即淀粉流化(fluidization)。示 例性的淀粉液化酶包括α-淀粉酶。

如本文使用的，术语“产麦芽糖酶”指催化从较大的碳水化合物聚合物生产 麦芽糖的酶。产麦芽糖酶可以是多种β-淀粉酶或其它淀粉酶中的一种。产麦芽 糖反应产生麦芽糖。

如本文使用的，术语“转化酶”指一类催化水解和转移反应以形成新的α-1，6 键的酶。转化酶通过转糖苷反应转移单糖，来催化糖的合成。例如，可用于本 发明方法的转化酶具有转葡糖苷活性，即，它通过水解葡糖苷键催化糖类的水 解。转化酶可以是植物的、动物的、细菌的或真菌的转化酶。在一个具体实施 方式中，转化酶是曲霉属转化酶。作为示例但并非限制，在一些具体实施方式 中，转化酶源自黑曲霉和/或米曲霉。如本文使用的，“具有转葡糖苷活性的转化 酶”或“本技术的转化酶”指能够催化糖化反应的转化酶。

如本文使用的，“糖化反应”或“糖化作用”指通过产麦芽糖反应和转葡糖苷 反应将液化糖浆转化为IMO的过程。本文所述的糖化反应可以在一个或多个步 骤或反应中发生，其中所述步骤或反应是分别的、顺序的或同时发生的。

IMO生产的方法

本技术涵盖了用于IMO生产的改良的方法。除分别的、顺序的或同时的糖 化反应外，IMO生产方法的改良发生在碳水化合物底物与液化酶反应之时，来 生产IMO产物。

在一个方面，本技术提供了用于制造低聚异麦芽糖组合物的方法，包括步 骤：(a)将淀粉浆液与液化酶接触，和(b)将步骤(a)的产物与产麦芽糖酶 和转化酶接触，其中分别的、顺序的或同时的与所述产麦芽糖酶和转化酶接触 以产生低聚异麦芽糖。

在一些具体实施方式中，本文的方法包括了第一糖化反应和第二糖化反应， 或者同步的糖化反应。在一个具体实施方式中，第一糖化反应导致了产麦芽糖 产物的生产，即麦芽糖或麦芽糖浆。第二糖化反应包括向产麦芽糖产物应用一 种或多种的酶，例如具有转葡糖苷活性的转化酶，由此将一些或全部的产麦芽 糖产物转化为IMO。在一个具体实施方式中，原材料(即，淀粉浆液)向麦芽 糖的转化发生在第一糖化反应即产麦芽糖反应的过程中。IMO的生产发生在第 二糖化反应即转葡糖苷反应的过程中，其中在所述反应的过程中使用了具有转 葡糖苷活性的转化酶。

底物

本方法使用碳水化合物底物。如本文所述，术语“碳水化合物”或“碳水化合 物底物”表示但不限于淀粉、天然未变性的淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、木薯淀 粉、马铃薯淀粉、甘薯淀粉、西米淀粉、大麦淀粉、大米淀粉、热/酸处理的淀 粉(糊精)、珍珠淀粉、蜡质玉米淀粉、高粱淀粉、高直链淀粉的玉米淀粉、高 固体含量的液体右旋糖，及其组合。

在一个具体实施方式中，所述碳水化合物底物是淀粉底物。淀粉底物可以 是，但不限于，玉米淀粉。在一个具体实施方式中，碳水化合物底物是淀粉浆 液。如本文所述，术语“浆液”指含有不可溶性成分，例如但不限于淀粉颗粒， 的含水混合物。有时，术语“浆液”或“糖浆”或“悬浮液”在本文中可互换的使用。 如本文所述，术语“淀粉底物”或“淀粉浆液”指与淀粉混合的液体溶液，其中淀粉 是由通式为(C6H10O5)x的复杂多糖碳水化合物组成的任何材料，其中X可以是任 何数值。该液体可以是任何含水溶剂(aqueous solvent)，例如水。

在一个具体实施方式中，淀粉浆液包括一种或多种形式的淀粉。如美国专 利号7,638,151所述，一种形式的淀粉是直链淀粉，直链多糖。其他形式的淀粉 包括支链淀粉，支链多糖。直链淀粉含有长的非支化链，其中所有的D-葡萄糖 单元都通过α-(1，4)键连接，即“α-(1，4)键”或“1，4-α-D-葡糖基键(1，4-α-D-glucosyl  linkages)”。支链淀粉是高度支化的，其中骨架的糖苷键是α-(1，4)键，然而支链 位点也提供α-(1，6)键。如本文中使用的，术语“键”指连接葡萄糖或其他分子的 碳部分的编号(number)。α和β前缀分别表示所述键相对于碳环是垂直的(axial) 或是平伏的(equatorial)。相应的，α键对环是垂直的，而β键是平伏的。

在一个具体实施方式中，淀粉底物的量或浓度，即淀粉浆液的浓度，可以 是具有浓度在1-60％、5-45％、10-40％、20-40％或25-35％的可溶解固体(“ds”) 的含水浆液。如本文所述，术语“可溶解固体”或“ds”指悬浮在溶液中的固体(即， 淀粉)的百分比。在一个具体实施方式中，浆液的pH是在1.0-9.0、2.0-8.0、3.0-7.5、 4.0-6.5或4.5-6.0之间。在另一个具体实施方式中，浆液的pH是在5.8-6.1之间。 在一个方面，本技术提供了淀粉浆液的浓度或密度在5-25、10-25、15-23或 18-22°Be之间。在一个具体实施方式中，淀粉浆液的密度在19-22°Be之间。如 本文中使用的，“°Be”或“波美(Baum)”密度是作为特定温度下的淀粉浆液的比 重的函数来测量的。

液化反应

在一个具体实施方式中，将淀粉浆液与液化酶接触，由此产生液化糖浆。 在一个具体实施方式中，液化作用可包括淀粉的主要成分的酶促水解。在一个 具体实施方式中，可以通过α淀粉酶，例如α-(1，4)-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，来 水解直链淀粉。α淀粉酶水解α-(1，4)-键以产生葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和更 高级糖类(higher sugar)的混合物。参见例如美国专利号4,113,509。还可以通 过β-淀粉酶水解直链淀粉。β-淀粉酶从非还原端开始切割连续的麦芽糖单元， 以定量地产生麦芽糖。α-和β-淀粉酶也水解支链淀粉。但α-和β-淀粉酶都不能 水解在支链淀粉的支链位点的α-(1，6)-键。β-淀粉酶彻底作用于支链淀粉的终端 产物是大的、高度支化的核或β-极限糊精(β-limit dextrin)。脱支酶，例如支链淀 粉酶、α-(1，6)-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶或α-(1，6)-葡糖苷酶可以水解在支链位点的 α-(1，6)-键。如本文中使用的，术语“脱支酶”指催化α-(1，6)-键的水解的酶。示例 性的脱支酶是支链淀粉酶，也称为α-糊精-内切-(1，6)-α-葡糖苷酶、极限糊精酶、 脱支酶或(1，6)-葡聚糖水解酶，参见例如Schulein等人，Characterization of a New  Class of Thermophilic Pullulanases from Bacillus acidopullulyticus，Annals of the New  York Academy of Sciences，第434卷，第1期，第271-74页(2006)。

在一个方面，液化酶是从细菌、真菌、植物或其它来源衍生、分离或提取 的酶。在一个具体实施方式中，细菌来源是芽孢杆菌属α-淀粉酶。在一个具体 实施方式中，α-淀粉酶源自芽孢杆菌属，包括源自至少一种细菌来源的那些， 所述细菌来源选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、嗜热脂肪芽 孢杆菌(B.stearothermophilus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、解淀粉芽孢杆菌 (B.amyloliquefaciens)和迟缓芽孢杆菌(B.lentus)。在一个具体实施方式中，来 自地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶是液化酶。在另一个具体实施 方式中，除α-淀粉酶以外的淀粉酶被用作液化酶。在一个具体实施方式中，考 虑特征是增加的氧化作用或热稳定性的淀粉酶，包括变体、基因变性的淀粉酶， 或如美国专利号5,763,385、5,824,532、5,958,739和6,008,026中所述的变体淀粉 酶。在一个具体实施方式中，液化酶是耐热的α-淀粉酶。

在一个具体实施方式中，液化酶与淀粉浆液接触，以降低液化的或可溶化 淀粉的粘度。通过糊精化作用，将不可溶的淀粉组分转化为可溶性物质。如本 文中使用的，术语“糊精化作用”指将淀粉转化为可溶的多糖或低聚糖。在一个 具体实施方式中，向淀粉浆液中添加一种或多种液化酶。可以手动的或自动的 向该浆液中添加液化酶，量为0.0001-10％、0.001-5％或0.01-1％(w/w/ds)。在 一个具体实施方式中，向该浆液中添加的液化酶的量为0.40-0.70％、0.50-0.60％ 或0.55％(w/w/ds)。在一个具体实施方式中，向该浆液中添加的液化酶的量为 0.55％(w/w/ds)。

在一个具体实施方式中，液化酶浓度是在0.0001-10％、0.001-5％或0.005-1％ (w/w/ds)的液化酶/每ds的淀粉浆液之间。在一个具体实施方式中，液化酶浓 度是在0.015-0.035％或0.022-0.025％(w/w/ds)的液化酶/每ds的淀粉浆液之间。 在另一个具体实施方式中，使用的液化酶浓度在0.04-0.07％、0.05-0.06％或 0.04-0.05％(w/w/ds)之间。在一个具体实施方式中，液化酶浓度是0.045％ (w/w/ds)的液化酶/每ds的淀粉浆液。

在一个具体实施方式中，液化酶与淀粉浆液在合适的温度下反应15-210分 钟(“min”)、60-210min、90-180min或120-150min。在一个具体实施方式中， 液化酶与淀粉浆液在合适的温度下反应约130min。在90-125℃、95-115℃、 100-110℃或100-108℃之间的温度下，可以手动的或自动的向该浆液中添加液 化酶。在一个具体实施方式中，将液化反应的pH维持在4.0-8.0、5.0-7.0或5.8-6.1 的范围。熟练的技术人员可以认识到，任选地，通过使用和应用合适量的酸或 碱，例如盐酸(“HCl”)或氢氧化钠(“NaOH”)，可以维持液化反应的pH。在 一个具体实施方式中，可以通过液化反应生产含有IMO前体的液化糖浆。

产麦芽糖反应

在一个具体实施方式中，淀粉浆液与液化酶接触后，再与产麦芽糖酶接触， 从而产生麦芽糖。在一个具体实施方式中，淀粉浆液与含有产麦芽糖酶促功能 (functionalities)的液化酶接触，从而生产含有麦芽糖的液化糖浆。如本文中使 用的，术语“产麦芽糖酶”指将碳水化合物转化为麦芽糖及其衍生物的酶。示例 性的产麦芽糖酶包括但不限于真菌、细菌和植物来源的α-淀粉酶和β-淀粉酶。 如本文中使用的，术语“麦芽糖”是指具有通过α-(1，4)-D-糖苷键连接的两个葡糖 基残基的二糖。在一个具体实施方式中，从富含麦芽糖的浆液或糖浆(即，液 化糖浆)中生产麦芽糖。

在一些具体实施方式中，糖化反应包括液化的碳水化合物底物(即，液化 糖浆)的水解。糖化反应包括产麦芽糖反应和转葡糖苷反应，其中所述反应可 以分别的、顺序的或同步的发生。糖化反应一般通过向液化糖浆中添加一种或 多种糖化酶来实施。在一个具体实施方式中，将选自β-淀粉酶、转葡糖苷酶、 转化酶、支链淀粉酶及其组合的一种或多种酶与液化糖浆反应，以生产IMO或 IMO前体。如本文中使用的，“IMO前体”指含有任何形成IMO所需的IMO构 成组分的组合物。在一个具体实施方式中，IMO前体是麦芽糖或其衍生物。

在一些具体实施方式中，在存在产麦芽糖酶的条件下发生液化糖浆的水解。 在一个具体实施方式中，产麦芽糖酶是β-淀粉酶。当一些α-淀粉酶也是产麦芽 糖的，达到将所述α-淀粉酶与淀粉底物接触能够产生麦芽糖的程度，使用β-淀 粉酶时有利的，因其与各种淀粉的接触提供了增加量的IMO前体，即麦芽糖， 而排除了其他的糖类，如葡萄糖，参见例如美国专利号4,970,158和4,647,538。 在一个具体实施方式中，所述β-淀粉酶是植物、微生物的酶，或耐热细菌的β- 淀粉酶。本领域技术人员可以容易的理解，合适的β-淀粉酶可以是天然存在的， 也可以是重组的和突变的β-淀粉酶。如本文中使用的，术语“β-淀粉酶”指催化 α-(1，4)-糖苷键的水解以释放麦芽糖单元的酶。β-淀粉酶还描述为造成多糖中的 α-(1，4)-D-糖苷键水解，而从糖链的非还原端去除连续的麦芽糖单元的酶，参见 例如美国专利号7,638,151。

在一个具体实施方式中，产麦芽糖反应进行至少12、20、72或120小时(h)。 在一个具体实施方式中，在范围从40℃、50℃、55℃、60℃和65℃至90℃的温 度下实施产麦芽糖反应。在一个具体实施方式中，产麦芽糖反应发生在60-65℃ 下。在一个具体实施方式中，产麦芽糖反应发生在4.0-、5.0-、5.5-、6.0-和7.0 之间的碱性pH下。在一个具体实施方式中，产麦芽糖反应的pH在5.0-5.5之间。 本领域技术人员可认识到，任选地，通过使用和应用合适量的酸或碱，例如盐 酸(“HCl”)或氢氧化钠(“NaOH”)，可以维持产麦芽糖反应的pH。

在一些具体实施方式中，本方法包括在产麦芽糖反应的过程中应用合适量 的产麦芽糖酶，其作为液化糖浆中存在的溶解麦芽糖的量的函数。为此目的， 在碳水化合物(即，淀粉)液化后，确定液化糖浆的溶解麦芽糖含量，并将合 适量的产麦芽糖酶应用于产麦芽糖反应。产麦芽糖酶的量的范围在0.0001-10％ (w/w)，或0.0005-1％(w/w)，或0.001-0.25％(w/w)，取决于所添加的特定的 产麦芽糖酶，和液化糖浆的总重量，即该糖浆的固体含量。

在一个具体实施方式中，在产麦芽糖反应的过程中向糖化反应应用 0.0001-10％(w/w)之间的支链淀粉酶。在一个具体实施方式中，在产麦芽糖反 应的过程中向糖化反应应用0.001-1％(w/w)之间的支链淀粉酶。在另一个具 体实施方式中，在产麦芽糖反应的过程中向糖化反应应用0.05-0.1％(w/w)的 支链淀粉酶。

在一个具体实施方式中，可以以0.001-1％(w/w)之间的浓度、以35-40°Bx 之间的Brix相对密度，向第一糖化反应或产麦芽糖反应添加产麦芽糖酶和/或支 链淀粉酶。如本文所述，术语“Brix相对密度”、“Brix”或“°Bx”指用于测量给定 温度下溶液的糖含量的普遍已知的液体比重刻度。因此，单位“°Bx”指对溶液中 的溶解的(solubilized)糖的测量。Brix刻度测量了每100克含糖水溶液中存在 的糖的克数(总溶解的固体含量)。例如，1.0°Bx的测量值指溶液中10mg/ml 的糖。在一个具体实施方式中，向35-40°Bx的第一糖化反应或产麦芽糖反应中 应用0.01-0.1％(w/w)的产麦芽糖酶和/或支链淀粉酶。在一个具体实施方式中， β-淀粉酶是用于第一糖化反应的产麦芽糖酶。在一个具体实施方式中，β-淀粉酶 和支链淀粉酶都用于第一糖化反应。

在一个具体实施方式中，在存在或缺少支链淀粉酶的条件下，以0.005-5％、 0.01-1％或0.02-0.05％(w/w)的浓度，向35-40°Bx的第一糖化反应或产麦芽糖 反应应用β-淀粉酶。在另一个具体实施方式中，向35-40°Bx的第一糖化反应或 产麦芽糖反应应用支链淀粉酶，其浓度在0.005-5％、0.01-1％或0.02-0.05％(w/w) 之间。在一个具体实施方式中，向35-40°Bx的第一糖化反应或产麦芽糖反应应 用支链淀粉酶，其浓度是0.025％(w/w)。

在一些具体实施方式中，产麦芽糖反应进行10-100小时(“h”)。在一个具 体实施方式中，产麦芽糖反应进行15-30h。在一个具体实施方式中，产麦芽糖 反应进行20-24h。在一个具体实施方式中，在50-70℃之间的温度下发生产麦芽 糖反应。在另一个具体实施方式中，在55-65℃之间的温度下发生产麦芽糖反应。 在一个具体实施方式中，在碱性pH下发生产麦芽糖反应。在一个具体实施方式 中，产麦芽糖反应的pH是在4.0-7.0之间。在另一个具体实施方式中，在pH 5.5-5.8之间发生产麦芽糖反应。本领域技术人员可以认识到，任选地，通过使 用和应用合适量的酸或碱，例如盐酸(“HCl”)或氢氧化钠(“NaOH”)，可以维 持产麦芽糖反应的pH。

转葡糖苷反应

在存在转葡糖苷酶的条件下可以发生葡萄糖部分及其衍生物的转移。产麦 芽糖反应和转葡糖苷反应可以分别的、顺序的或同步的发生，取决于用于特定 反应的糖化酶。在一个具体实施方式中，在存在转化酶的条件下发生同步糖化 反应。在一个具体实施方式中，同步糖化反应包括产麦芽糖反应和转葡糖苷反 应。例如，转葡糖苷反应可以和产麦芽糖反应同时发生，从而造成同步糖化反 应。如本文中使用的，术语“同步糖化反应”指第一糖化反应和第二糖化反应时 空邻近的(in temporal and spatial proximity)发生。在同步糖化反应中，第一糖 化反应的产物可立即用作第二糖化反应的底物。在一个具体实施方式中，在存 在产麦芽糖酶和具有转葡糖苷活性的转化酶的条件下，发生同步糖化反应。本 技术的另一个方面公开了与产麦芽糖底物反应的转化酶。在一个具体实施方式 中，具有转葡糖苷活性的转化酶与产麦芽糖底物发生反应。

在一个具体实施方式中，通过向产麦芽糖反应的产物中依次添加一种或多 种糖化酶来实施转葡糖苷反应。在一个具体实施方式中，一种或多种酶选自β- 淀粉酶、转葡糖苷酶、转化酶、支链淀粉酶及其组合，其与液化糖浆或产麦芽 糖反应的产物反应，而在转葡糖苷反应的过程中产生IMO。在一个具体实施方 式中，转化酶是在转葡糖苷反应的过程中与液化糖浆反应以产生IMO的转葡糖 苷酶。在另一个具体实施方式中，曲霉属的转化酶是在转葡糖苷反应的过程中 与液化糖浆反应以生产IMO的转葡糖苷酶。

在另一个具体实施方式中，由两种或多种酶催化转葡糖苷反应。例如，在 糖化反应中可使用具有转葡糖苷活性的转化酶与转葡糖苷酶(“TG”)的组合。 在一个具体实施方式中，转葡糖苷酶是曲霉属的TG。在一个具体实施方式中， 转葡糖苷酶是黑曲霉TG。如本文之前描述的，虽然TG可作为转葡糖苷酶发挥 功能，但是使用转化酶是有利的，因为当相比使用TG的常规方法时，它与多 种基于淀粉和麦芽糖的底物的接触提供了增加的IMO产生。

在一个具体实施方式中，转葡糖苷反应(即，第二糖化反应)进行10-100h。 在一个具体实施方式中，第二糖化反应进行30-90h。在一个具体实施方式中， 第二糖化反应进行48-72h。在一个具体实施方式中，第二糖化反应在50-70℃之 间的温度下加热10-100h、30-90h或48-72h。在另一个具体实施方式中，第二 糖化反应在55-65℃之间的温度下加热10-100h、30-90h或48-72h。在一个具体 实施方式中，第二糖化反应在60-65℃下进行。在一个具体实施方式中，反应发 生在4.0-、5.0-、5.5-、6.0-和7.0之间的碱性pH下。在一个具体实施方式中， 第二糖化反应的pH在5.0-5.5之间。本领域技术人员可认识到，必需时，通过 使用和应用合适量的酸或碱，例如盐酸(“HCl”)或氢氧化钠(“NaOH”)，可以 维持产麦芽糖反应的pH。

在一些具体实施方式中，向同步糖化反应使用合适量的转化酶，其作为液 化糖浆中的底物的量的函数。为此目的，在碳水化合物(即，淀粉)液化后， 可以确定糖浆的溶解麦芽糖含量，并将合适量的酶应用于同步糖化反应。酶的 量取决于液化糖浆的总重量，即干固体含量。除应用转化酶外，还可以向同步 糖化反应应用一种或多种产麦芽糖酶。

在一个具体实施方式中，向糖化反应应用0.0001-10％(w/w)之间的转化 酶作为糖化酶。在一个具体实施方式中，向糖化反应应用0.001-5％(w/w)之 间的转化酶作为糖化酶。在一个具体实施方式中，向糖化反应应用0.01-1％(w/w) 的转化酶。在一个具体实施方式中，向糖化反应应用0.05-0.5％(w/w)的转化 酶。在另一个具体实施方式中，向糖化反应应用0.16％(w/w)的转化酶。

可以手动的或自动的、单独的或组合的向同步糖化反应中添加糖化酶，浓 度如前所述，其中液化糖浆的Brix密度在35-40°Bx之间。在一个具体实施方式 中，液化糖浆的Brix密度是36°Bx。在一个方面，糖化反应将一些或全部的产 麦芽糖产物转化为IMO。

IMO纯化及其用途

在一些具体实施方式中，本方法包括从IMO反应中去除外源物质的步骤。 外源物质包括但不限于未反应的原材料和变性的蛋白质、碳水化合物和淀粉。 在一些具体实施方式中，纯化包括但不限于过滤、沉淀和絮凝，包括它们的变 体和组合。在一个具体实施方式中，使用过滤装置过滤IMO糖浆。挤压和辅助 过滤的过滤装置包括：鼓式过滤器；转筒式过滤器；珍珠岩；硅藻土(cellite)； 及其组合。

在一些具体实施方式中，方法包括脱色步骤。脱色是通过用能够去除产生 颜色物质的材料(color inducing material)处理IMO产物或IMO糖浆而实现的， 所述材料例如颗粒状的活性炭。在一个具体实施方式中，在60-90℃之间或70-75 ℃之间的温度下，将IMO糖浆通过装填了颗粒状活性炭的碳柱。在一个具体实 施方式中，可以将在36°Bx下IMO糖浆通过碳柱10min-15h。在一个具体实施 方式中，可以将在36°Bx下IMO糖浆通过碳柱1-15h。在另一个具体实施方式 中，可以将在36°Bx下的IMO糖浆通过碳柱5-10h。

在一些具体实施方式中，方法包括分离离子型组分与IMO糖浆。能够从 IMO糖浆去除离子物质的第一种分离手段包括但不限于离子交换树脂、超滤、 逆向渗透和本领域技术人员可以容易的知道的其他层析技术。在一个具体实施 方式中，第一分离步骤是在40-75℃之间或55-60℃之间的温度下进行的。

在一个具体实施方式中，第一种分离手段还包括阳离子交换树脂、阴离子 交换树脂或其组合。合适的阳离子树脂的体积包括基于IMO糖浆体积的 0.1-100％(v/v)或1-5％(v/v)。在一个具体实施方式中，可以使用阴离子交换树脂。 合适的阴离子树脂包括基于IMO糖浆体积的0.1-100％(v/v)或2-10％(v/v)。

在一个具体实施方式中，可以通过将IMO糖浆通过离子交换柱来实施离子 交换。在一个具体实施方式中，离子交换柱包含阳离子交换树脂、阴离子交换 树脂或两者。在一个具体实施方式中，IMO糖浆在离子交换柱中的流速在0.1 ml/min至1000l/min之间，或10-50l/min之间。

在一个具体实施方式中，使用分离的交换树脂处理IMO糖浆。为此目的， 首先将IMO糖浆通过阳离子交换树脂，之后再通过阴离子交换树脂。在一个具 体实施方式中，额外的或可选的，将IMO糖浆通过同时含有阳离子和阴离子树 脂物质的树脂。在一个具体实施方式中，使用运输泵将IMO糖浆通过本文所述 的交换树脂。在一个具体实施方式中，在40-75℃下实施离子交换层析。在一个 具体实施方式中，在55-60℃下实施离子交换层析。

在一些具体实施方式中，方法包括将IMO糖浆浓缩至理想的含水量或固体 含量。在一个具体实施方式中，将IMO糖浆浓缩至30-75°Bx、40-50°Bx或 45-50°Bx。为此目的，通过去除水分而浓缩IMO糖浆的手段，来加工IMO糖 浆。在一个具体实施方式中，去除水分的手段是蒸发。在一个具体实施方式中， 可以使用连续的或不连续的机械蒸汽再压缩(Mechanical Vapor Recompressor) “MVR”)。本领域技术人员也可以使用并容易的了解本领域已知的其他蒸发或 蒸汽装置，例如三效蒸发仪(triple evaporator)。

在一个具体实施方式中，在浓缩IMO糖浆后，实施催化性IMO氢化作用。 在一个具体实施方式中，催化剂包括铂类金属，如铂、钯和钌。非贵金属催化 剂如镍、镍合金、雷尼镍(Raney nickel)和漆原镍(Urushibara nickel)也可用 作本技术的催化剂。

在一个方面，本技术提供了使用本文描述的方法生产的IMO。所述方法可 用于生产各种IMO。在一个具体实施方式中，生产了支链葡萄糖、DP3葡萄糖、 潘糖、异麦芽四糖、异麦芽七糖或其组合。

在一个具体实施方式中，使用本方法生产的IMO可用作食品添加剂或甜味 剂。在一个具体实施方式中，通过浓缩和干燥IMO糖浆、浆液、分离的不可溶 性组分和/或分离的可溶性组分，可以从其获得粉状物(flour)或其他的干燥粉 末(powder)。所获得的粉末或粉状物可以加入到这样的组合物中，在所述组合 物中IMO的存在是所需的，例如在食物中，即早餐谷类、意大利面、或食物添 加剂和焙烤物品。如本文所述，术语“食物添加剂”指IMO以下的用途，所述用 途是作为撒布材料(sprinkle-on material)、作为生产其他食物中使用的成分，和 /或作为添加到食物和/或液体中的局部成分。

在另一个具体实施方式中，干燥的粉末可以加入到食物增补剂 (supplements)中。可以以任何可接受的补充物或形式来提供干燥的粉末在食物 增补剂中的加入。可以配制膳食增补剂用于在基质中口服施用，例如药物散剂 (drug powder)、晶体、颗粒剂(granule)、微粒(包括大小在微米数量级的颗粒， 例如微球和微胶囊)、颗粒(particle)(包括大小在毫米数量级的颗粒)、珠、微 珠、球粒(pellet)、丸剂、微片(microtablet)、压缩片剂或研制片剂(tablet triturates)、 模制片剂或研制片剂，和胶囊剂，所述胶囊剂是硬胶囊或软胶囊并包含作为粉 末、颗粒、珠、溶液或悬浮液的所述组合物。还可以配制膳食增补剂作为在含 水流体中的溶液或悬浮液、作为加入到凝胶胶囊中的液体或作为任何其他施用 便利的形式进行口服施用，或作为栓剂、灌肠剂或其他便利的形式进行直肠施 用。IMO还可以作为控释体系提供。

实施例

下列实施例进一步示例了本发明，所述实施例不应以任何方式视为限制。 下文描述的实施例示例了生产和制造属于本发明技术的IMO的方法。在实施例 中，使用黑曲霉转化酶从基于麦芽糖(玉米糖浆)的底物生产IMO。可以理解， 还可以使用来自其他来源，例如来自米曲霉的转化酶。麦芽糖的水解和转糖苷 作用对IMO生产是关键的。常规的IMO生产是通过两步糖化过程实施的。所 述两次反应包括分别的或顺序的产麦芽糖反应和转葡糖苷反应。利用常规方法， 首先将β-淀粉酶与液化糖浆反应生产麦芽糖，之后添加转葡糖苷酶(即TG)来 生产IMO。然而，通过使用下文进一步描述的改良的同步方法，现在可以在存 在β-淀粉酶的条件下同时向液化糖浆中添加转化酶进行IMO生产。因而，下文 的实施例证实了，来自黑曲霉的转化酶具有通过目前尚未发现的转葡糖苷机制 从麦芽糖底物生产IMO的功能性能力。

实施例1——IMO生产的常规方法

通过向容器中添加1kg玉米淀粉和1.5kg水来制备淀粉浆液，最终浓度为 19-22°Be。在105℃下，在5.8-6.1的pH下，将液化酶——0.04-0.05％(w/w/ds) 的源自地衣芽孢杆菌的耐热α-淀粉酶(Novo Nordsik，丹麦)添加到浆液中持续 10min。之后，通过将糖浆经过冲洗槽2小时，对液化的糖浆进行二次液化过程， 从而产生最终10-12右旋糖当量(“DE”)的糖浆。然后，在60-65℃下，在5.0-5.5 的pH下，通过添加0.052％(w/w)的来自大麦的β-淀粉酶(Genencor，Rochester， NY)和0.07％(w/w)的源自地衣芽孢杆菌的支链淀粉酶(Amano Pharmaceuticals， 日本)，进行液化浆液的第一次糖化反应，持续48-72小时。通过添加0.1％(w/w) 的源自黑曲霉的转葡糖苷酶(Genencor，Rochester，NY)溶液，并在55-60℃ 下反应48-72小时，实施第二次糖化反应。通过过滤，从糖化溶液中去除未反应 的物质，并用活性炭处理糖化的溶液以去除颜色。在60-75℃的温度下，将糖化 溶液通过装填了颗粒状活性炭的碳柱持续约30分钟至3小时。使用阳离子、阴 离子混合床交换树脂(cation，anion，and mixed bed，exchange resins)(Samyang  Genex，韩国)，在30-50℃下，以5-10m³/hr的流速，从溶液中层析分离离子型 组分。最后，通过MVR蒸发仪将IMO糖浆浓缩至约75°Be。

实施例2——使用转化酶进行IMO生产的同步方法

通过向容器中添加1kg玉米淀粉和1.5kg水来制备淀粉浆液，最终浓度为 19-22°Be。在100-108℃下，在5.8-6.1的pH下，将液化——0.04-0.05％(w/w/ds) 的耐热α-淀粉酶(如实施例1列举的)添加到浆中，持续2-2.5小时。液化浆液 之后进行单次糖化步骤。此时，在5.0-5.5的pH下，向液化浆液中添加0.052％ (w/w)的来自大麦的β-淀粉酶(Genencor，Rochester，NY)、0.07％(w/w)的 源自地衣芽孢杆菌的支链淀粉酶(Amano Pharmaceuticals，日本)和0.16％(w/w) 的黑曲霉转化酶，至最终浓度为35-40°Be。糖化混合物在60-65℃反应持续48-72 小时。通过过滤，从糖化溶液中去除未反应的物质。如上文实施例1所述，用 活性炭处理糖化的溶液以去除颜色。如上文实施例1所述，使用离子交换树脂 从溶液中分离离子型组分，最后，通过MVR蒸发仪将IMO糖浆浓缩至75°Be。 见图1。

实施例3——比较用于IMO生产的常规方法和同步方法

该实施例比较了在糖化过程中IMO含量的改变。对于常规方法和同步方 法，如上所述实施反应。图2证实，常规方法和同步方法的低聚糖的干基百分 比(DB％)是相同的。横坐标描述了以小时为单位的完整糖化反应的时间长度， 纵坐标代表了DB％。见图2。

实施例4——比较常规方法和同步方法的糖类分布

在独立的实验中，比较了常规方法和同步方法的IMO糖类分布。如表1所 示，常规方法和同步方法的总IMO生产分布是相同的。如表1所示，总IMO 生产包括：异麦芽糖；支化葡萄糖；DP3葡萄糖；潘糖；异麦芽三糖；异麦芽 四糖；和异麦芽七糖。

表1：常规方法和同步方法的糖类分布

因而，如前述实施例证实的，从黑曲霉分离的转化酶具有转葡糖苷酶活性。 该新型转化酶含有预料不到的特征，即具有与麦芽糖底物接触和反应的能力。 该新型转化酶通过催化同步的、单步骤的糖化反应，令人惊讶的和预料不到的 改良了生产IMO的常规方法。通过减少生产IMO所需的时间和能量，该新方 法可以降低IMO的制造成本。

本公开不被限制在本申请所描述的特定实施方案方面。不超出偏离其精神 和范围，可以做出许多修改和变化，这对于本领域技术人员将是显而易见的。 除了这里列举的那些方法，公开范围内的具有等同功能的方法和设备对上述描 述的本领域技术人员来说是显而易见的。这些修改和变化旨在落入附加的权利 要求的范围内。本公开仅限于附加权利要求的条款，连同对那些授权的权利要 求的等效特征的全部范围。这是可以理解的，该公开不限于特定的方法、试剂、 化合物、组合物或生物系统，它们当然可以不同变化。这也是可以理解的，此 处使用的术语只是为了描述特定的实施方案，并无意限制。

此外，在用马库什组描述的公开的功能特征或方面用马库什组描述的地方， 本领域技术人员会认识到该公开也因此用马库什组成员的任意个别成员或子组 来描述。

正如本领域技术人员会理解，对于任意或所有目的，特别是在提供书面说 明的方面，本文公开的所有的范围也包括任意或所有可能的子范围和这些子范 围的组合。任意列出的范围可以容易地看做充分地描述和使相同的范围被分为 至少相等的2份，3份，4份，5份，10份等。作为非限制性实施例，本文讨论 的每个范围可以容易地分解为较低的三分之一，中间三分之一和较高三分之一 等。正如本领域技术人员将会理解的，所有的语言例如但不限于，如“高达”、 “至少”、“高于”、“少于”以及类似的，包括列举的数字并涉及那些如上所述可 随后分解为子范围的范围。最后，正如本领域技术人员将会理解的，范围包括 每个单独的值。因此例如，具有1-3个组分的组是指具有1个、2个或3个组分 的组。类似的，具有1-5个组分的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个组 分的组，以此类推。

在各个方面和实施方案已经在本文中公开的同时，其它的方面和实施方案 对本领域技术人员是显而易见的。根据下列权利要求所表示的真实范围和精神， 本文公开的不同的方面和实施方案是为了说明性的目的而并非意在限制。