油脂酵母Δ12和Δ15双功能脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法

摘要

本发明涉及一个来源于橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)的具有Δ12/Δ15双功能的脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法。本发明分别以橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)为材料，通过设计简并引物扩增基因核心序列，再采用基因组步移的方法扩增出全长Δ15-脂肪酸去饱和酶基因lkfad15；通过在酿酒酵母INVScI中异源表达lkfad15证明该去饱和酶具有Δ12，15-脂肪酸去饱和酶的双功能，并且对C16和C18底物都具有较高的底物特异性。

说明书

技术领域

本发明涉及一个来源于橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)的具有Δ12/Δ15双功能 的脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法。

背景技术

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturased fatty acids，PUFAs)，如二十碳五烯酸(Eicosatetraenoic  acid，EPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)等是人体中枢神经系统膜脂结构 的主要成分，对人体特别是婴幼儿大脑和神经系统的发育是必不可少的，在医学和营养保健 方面具有重要的作用。人体合成EPA和DHA的效率极低，在日常生活中补充足够的EPA和 DHA对维持身体健康极为重要。目前市场上该类脂肪酸主要来源于深海鱼油，环境污染问题 及鱼类资源的有限性使得人们必需寻找持久的、稳定安全的EPA和DHA替代来源。已知某 些微生物如真菌和海洋微藻能从头合成PUFAs且体内含量丰富，目前直接从这些微生物发酵 培养制备商业化的PUFAs只是在极少数物种中取得成功，高提取成本和低产量是需要克服的 主要瓶颈。另一方面，基因工程已经能实现在一些植物中合成PUFAs，利用转基因植物尤其 是油料作物作为“绿色细胞工厂”生产PUFAs也是今后发展的一个重要方向。一些微生物拥 有合成PUFAs的全套基因，是转基因研究中优良基因的主要来源，因此从这些微生物中克隆 合成PUFAs所必需的去饱和酶基因和延长酶基因是转基因研究及开发的基础。

图1显示了生物体内合成PUFAs的主要过程，其中Δ15-脂肪酸去饱和酶处于整个代谢途 径的上游，可以将亚油酸(LA，C18:2^Δ9，12)转化生成α-亚麻酸(ALA，C18:3^{Δ9，12，15})，在ω-3途 径中ALA是合成EPA和DHA的底物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种油脂酵母Δ12和Δ15双功能脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方 法，该基因编码的蛋白具有Δ12和Δ15去饱和酶两种活性。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：油脂酵母Δ12和Δ15双功能脂肪酸去 饱和酶基因，其特征在于它的基因的全长序列如下：

atgtcagtcg ttgactttac cgataccaca agtggctcgg ctatcaattc ttcgaacatt     60

tcccagagag gaaatggatc tacgatagtc gaaaccaaaa aagggccatc ttcaaatttg    120

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ttgtcggcta tcccaaagca ttgttatgaa agatctcttg ttagatcgtt aggctacgtt    240

gctcgtgata taaccatgat gtgtttaatt ggttacattg gacaaaagac tatcccaatg    300

gttgagatcg caggcaagga agggttgagt agtaacatca gaggaggcct ctggtgcgtg    360

tattcatact tgttggggtt atttggtttt ggtttatgga ttttagctca cgaatgtgga    420

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tatttgatag tcccatattt ttcgtggaaa ttctctcatt caaagcatca caaggctact    540

ggccacttga ctaaggatat ggttttcatt ccttacacca aggaagaatt tgtcgaaaag    600

agcggcgtat ctaaggtgtc tgaagtcatg gaagattcgc caatctggtc gttgatggtt    660

ttgattttcc aacaaattgg tggtttacaa ttgtatttag ctactaatgc cactggtcaa    720

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gttgtgtacc aatggtacaa gaactttggt ttcttcaaca tgtttgtcaa ctggttcatg   900

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accatgcctc attaccgtga taatgaatgg actttcgctc gtggtgctgc tgctactatc  1020

gaccgtaact ttggtttcat cggacaacac attttccatg atatcattga aactcacgtt  1080

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agaaaggtta tgggcgaaca ttatagatat gaaggtgaat ctatgtggta ttctttatgg  1200

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atgtacagaa acgttaacgg tgcaggtcca gttaagccaa tagattaa               1308。

上述油脂酵母Δ12和Δ15双功能脂肪酸去饱和酶基因[橘林油脂酵母(Lipomyces  kononenkoae)双功能的脂肪酸去饱和酶基因lkfad15]的克隆方法，其特征在于：

对已经报道的Δ15-脂肪酸去饱和酶氨基酸序列进行比对，根据对应的保守区域设计简并 引物F2/R2，以提取的橘林油脂酵母总DNA为模板，采用降落PCR(Touch-down PCR)的 方法扩增出LKFAD15保守区对应的基因编码序列并克隆到pMD18-T载体并测序；根据测序 所得的DNA序列设进一步进行橘林油脂酵母基因组步移，利用接头PCR(Adaptor-PCR) 和热不对称交错PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR)扩增出橘林油脂酵 母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15 5’和3’端的侧翼序列；最后将获得的侧翼序列与之前得 到的基因片段进行拼接，即得到橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15结构基因的全 长序列(即油脂酵母Δ12和Δ15双功能脂肪酸去饱和酶基因的全长序列)。

与现有的脂肪酸去饱和酶基因相比，这个基因具有以下特点：

1)目前仅从原生动物和霉菌中克隆出具有Δ12/Δ15-双功能的脂肪酸去饱和酶基因。本 发明从一种油脂酵母(橘林油脂酵母)中克隆到具有Δ12/Δ15双功能的脂肪酸去饱和酶基因， 该基因编码的蛋白具有Δ12和Δ15去饱和酶两种活性；该脂肪酸去饱和酶也具有较为广泛的 底物特异性，这是从油脂酵母中克隆到具有双功能的脂肪酸去饱和酶基因的首次报道。橘林 油脂酵母亚油酸含量高，通过在橘林油脂酵母中过表达以及在其它宿主中异源表达lkfad15具 有提高LA或ALA含量的潜力。

2)在NCBI中经Blast分析表明，橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15与其它 物种的脂肪酸去饱和酶基因在核苷酸序列上没有同源性。

附图说明

图1是多不饱和脂肪酸(PUFAs)的合成途径图。

图2是橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15基因的酿酒酵母脂肪酸图谱。

图3是不同来源的Δ-15脂肪酸去饱和酶进化树。LKFAD15 from Lipomyces kononenkoae， PipFAD15(ABL63813.1)from Pichia pastoris，LidFAD15(AAA86690.1)from Limnanthes  douglasii，PefFAD15(AAL36934.1)from Perilla frutescens，CyaFAD15(EAZ92081.1)from  Cyanothece sp.，LynFAD15(EAW33450.1)from Lyngbya sp.，SynFAD15(BAA02924.1)from  Synechocystis sp.，CadFAD12(XP_002420902.1)from Candida dubliniensis， CopFAD12(EER27935.1)from Coccidioides posadasii，AsoFAD12(BAD04850.1)from  Aspergillus oryzae，CrcFAD12(AAU12575.1)from Cryptococcus curvatus， CrnFAD12(XP_570226.1)from Cryptococcus neoformans，PhcFAD12(ACJ26016.1)from  Phanerochaete chrysosporium，LeeFAD12(BAD51484.1)from Lentinula edodes， LabFAD12(XP_001876301.1)from Laccaria bicolor，MucFAD12(BAB69056.1)from Mucor  circinelloides，MoaFAD12(BAA81754.1)from Mortierella alpinea，Acc bi-functional FAD12，15(ABK15557.1)from Acanthamoeba castellanii.

图4是橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15基因的全长序列。

图5是橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15基因所编码的氨基酸序列。

具体实施方式

1.油脂酵母Δ12和Δ15双功能脂肪酸去饱和酶基因[橘林油脂酵母(Lipomyces  kononenkoae)双功能的脂肪酸去饱和酶基因lkfad15]的克隆方法：

对已经报道的Δ15-脂肪酸去饱和酶氨基酸序列进行比对，根据对应的保守区域设计简并 引物F2/R2，以提取的橘林油脂酵母总DNA为模板，采用降落PCR的方法扩增出LKFAD15 保守区对应的基因编码序列并克隆到pMD18-T载体并测序；根据测序所得的DNA序列设进 一步进行橘林油脂酵母基因组步移，利用接头PCR(Adaptor-PCR)和热不对称交错PCR(Ther  mal Asymmetric Interlaced PCR)扩增出橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15 5’和 3’端的侧翼序列；最后将获得的侧翼序列与之前得到的基因片段进行拼接，即得到橘林油脂 酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15结构基因的全长序列(即油脂酵母Δ12和Δ15双功能 脂肪酸去饱和酶基因的全长序列)。

橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15 5’和3’端的侧翼序列：5’-GTCATGTCAG TCGTTGACTTTACCGATA-3’；5’-GGCCATTAATCTATTGGCTTAACTGGACCT-3’。

采用TRIzol试剂盒提取橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)的总RNA，通过逆转录 PCR扩增出橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15基因对应的全长cDNA序列。测序 表明橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)结构基因的序列与其对应的全长cDNA序列一致， 证明橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15基因不含有内含子。

橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15基因的全长序列(即油脂酵母Δ12和Δ15 双功能脂肪酸去饱和酶基因的全长序列)：

atgtcagtcg ttgactttac cgataccaca agtggctcgg ctatcaattc ttcgaacatt     60

tcccagagag gaaatggatc tacgatagtc gaaaccaaaa aagggccatc ttcaaatttg    120

aaggctattg acacgtttgg taacgagttc aaagtaccag attacaccat taagcaaatt    180

ttgtcggcta tcccaaagca ttgttatgaa agatctcttg ttagatcgtt aggctacgtt    240

gctcgtgata taaccatgat gtgtttaatt ggttacattg gacaaaagac tatcccaatg    300

gttgagatcg caggcaagga agggttgagt agtaacatca gaggaggcct ctggtgcgtg    360

tattcatact tgttggggtt atttggtttt ggtttatgga ttttagctca cgaatgtgga    420

cacggggcat tttctgatta tcagaatgtt aatgatgttg ttggttggat tttacactcg    480

tatttgatag tcccatattt ttcgtggaaa ttctctcatt caaagcatca caaggctact    540

ggccacttga ctaaggatat ggttttcatt ccttacacca aggaagaatt tgtcgaaaag    600

agcggcgtat ctaaggtgtc tgaagtcatg gaagattcgc caatctggtc gttgatggtt    660

ttgattttcc aacaaattgg tggtttacaa ttgtatttag ctactaatgc cactggtcaa    720

tcatacctag gtcactcaaa gatcgccaag tctcattatg ctccagcttc tccagttttt    780

gacaaggaac actactggta tattatcttg tctgacatcg ggattattac aaccataacg    840

gttgtgtacc aatggtacaa gaactttggt ttcttcaaca tgtttgtcaa ctggttcatg    900

ccttggttat gggttaacca ctggttagtc tttgttactt tcttacaaca taccgatcca    960

accatgcctc attaccgtga taatgaatgg actttcgctc gtggtgctgc tgctactatc   1020

gaccgtaact ttggtttcat cggacaacac attttccatg atatcattga aactcacgtt   1080

ttgcaccatt acgtttcaag aataccattt tacaatgcta gagaagccac cgatgccatc   1140

agaaaggtta tgggcgaaca ttatagatat gaaggtgaat ctatgtggta ttctttatgg   1200

aaatgtatga gaatgtgtca atatgttgat gatgctgaca ctgacgccaa aggtgtttta   1260

atgtacagaa acgttaacgg tgcaggtcca gttaagccaa tagattaa                1308。

橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15基因所编码的氨基酸序列如下：

msvvdftdtt sgsainssni sqrgngstiv etkkgpssnl kaidtfgnef kvpdytikqi     60

lsaipkhcye rslvrslgyv arditmmcli gyigqktipm veiagkegls snirgglwcv    120

ysyllglfgf glwilahecg hgafsdyqnv ndvvgwilhs ylivpyfswk fshskhhkat    180

ghltkdmvfi pytkeefvek sgvskvsevm edspiwslmv lifqqigglq lylatnatgq    240

sypghskiak shyapaspvf dkehywyiil sdigiittit vvyqwyknfg ffnmfvnwfm    300

pwlwvnhwlv fvtflqhtdp tmphyrdnew tfargaaati drnfgfigqh ifhdiiethv    360

lhhyvsripf ynareatdai rkvmgehyry egesmwyslw kcmrmcqyvd dadtdakgvl    420

myrnvngagp vkpid                                                     435。

2.经序列分析，橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15基因的全长1308bp，不 含内含子，其氨基酸序列与来自白假丝酵母(Candida albicans)SC5314的Δ12-FAD和毕赤 酵母(Pichia pastoris)GS115的Δ15-FAD均具有很高的同源性，其相似性分别为76％和73％。

3.在NCBI中经Blast分析表明，橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15与其它 物种的脂肪酸去饱和酶基因在核苷酸序列上没有同源性。

4.橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15(即油脂酵母Δ12和Δ15双功能脂肪 酸去饱和酶基因)编码的蛋白具有Δ12和Δ15去饱和酶两种活性的双功能验证：

(1)将橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15克隆到酿酒酵母载体pHBM354， 得到酿酒酵母重组表达质粒INVScI-LkFAD15，并将重组表达质粒INVScI-LkFAD15与空载体 pHBM354以醋酸锂方法分别转入酿酒酵母。从尿嘧啶缺陷型培养基(Synthetic Complete  Medium lack of Uracil，SC-Ura：0.67％酵母氮碱，2％葡萄糖，0.002％亮氨酸，0.004％色氨 酸，0.002％组氨酸，1.5％琼脂，均为质量百分数)，105℃灭菌30min(待培养基的温度在 60℃左右时加入氨基酸，氨基酸的百分含量相当于单位为g/mL，即100mL尿嘧啶缺陷型液 体培养基中，亮氨酸、色氨酸和组氨酸的加入量分别为：0.002g、0.004g、0.002g)上挑取多 个阳性单菌落，接种于5mL SC-Ura的液体培养基(0.67％YNB，2％葡萄糖，0.002％Leu，0.004％ Trp，0.002％His)中，28℃、200rpm/min振荡过夜培养；按液体培养基质量的1％接种，将 过夜培养的菌液接种于50mL SC-Ura的液体培养基中振荡培养至OD₆₀₀＝2～4。收集细胞后用 无菌水洗涤细胞，用50mL重组酿酒酵母诱导培养基【Buffered Synthetic Complete Medium， BSC-Ura：0.67％酵母氮碱，2％半乳糖，0.005％亮氨酸，0.005％色氨酸，0.0025％组氨酸(均 为质量百分数)，50mM Tris-HCL PH8.0缓冲液，105℃灭菌30min】的液体培养基重悬细胞至 OD₆₀₀＝0.4，再将重悬液接种于新的100mL BSC-Ura液体培养基中，20℃、200rpm/min振荡 培养3～4天。收集酵母细胞提取总脂肪酸并甲酯化后上气相色谱(GC)进行分析。

(2)橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15基因在酿酒酵母INVScI中表达时，在 没有添加外源底物的条件下，通过GC检测发现酿酒酵母重组菌株INVScI-D15中产生了四种 新的脂肪酸成分即C16:2^Δ9，12，C16:3^{Δ9，12，15}，C18:2^Δ9，12，C18:3^{Δ9，12，15}(图2)，其含量分别占总脂肪 酸的6.23％，1.83％，12.25％，3.47％(表1，均为质量百分数)。

根据橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15去饱和酶在进化树中的位置，推测橘 林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15可能是一个新的双功能去饱和酶(图3)，即该基 因编码的蛋白具有Δ12和Δ15去饱和酶两种活性。对橘林油脂酵母(Lipomyces  kononenkoae)lkfad15在酿酒酵母中表达的功能分析进一步证实了这种推测。在橘林油脂酵母 (Lipomyces kononenkoae)lkfad15基因转化酿酒酵母中，首先由酵母细胞内自身合成的C16:1^Δ9作为底物，在橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15的Δ12去饱和酶活性作用下先生 成C16:2^Δ9，12，然后C16:2^Δ9，12在橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15的Δ15去饱和 酶活性作用下最后生成C16:3^{Δ9，12，15}，表1数据表明与空载体对照相比，转橘林油脂酵母 (Lipomyces kononenkoae)lkfad15基因的酿酒酵母中C16:1^Δ9脂肪酸含量下降了39.87％。C18 系列脂肪酸可能也是在相同过程的作用下合成新的C18系列脂肪酸产物。GC分析的结果同 时表明来源于橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15双功能去饱和酶对C16:1，C18:1 底物都具有较高的特异性。

表1橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)lkfad15基因的酿酒酵母脂肪酸组成(％total fatty  acids)