源于荧光假单胞菌的联苯降解相关基因操纵子及其表达载体与应用

摘要

本发明涉及一种源于荧光假单胞菌的联苯降解相关基因操纵子及其表达载体与应用。所述的源于荧光假单胞菌的联苯降解相关基因操纵子的碱基序列如SEQ ID No 1所示，其含有碱基A 1313个，碱基C 1955个，碱基G 2117个，碱基T 1331个。本发明的源于荧光假单胞菌的联苯降解相关基因操纵子及其表达载体可用于联苯、多氯联苯的生物降解。

说明书

技术领域

本发明属微生物基因工程领域，具体涉及一种源于荧光假单胞菌的联苯 降解相关基因操纵子及其表达载体，特别是涉及一种源于荧光假单胞菌的联 苯降解相关基因操纵子及其表达载体在降解联苯和多氯联苯中的应用。

背景技术

多氯联苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)又称氯化联苯，是一类人 工合成的有机物，是联苯苯环上的氢原子被氯原子取代而形成的一类氯化物。 自1881年首次成功合成多氯联苯以来，人工已合成了209种这类化合物。 PCBs属半挥发或不挥发物质，具有较强的腐蚀性。PCBs具备典型的持久性 有机污染物的特性，即难降解性和远距离迁移性，对人类的健康造成了较大 的威胁【Furukawa和Gen，Appl Microbiol，2000，46：283-296；Wiegel和 Wu，FEMS Microbiology Ecology，2000，32，1-15；Jim和Reyes，Environmental  Pollution，2008，155：1-12】。

目前，许多降解PCBs的菌株被分离。Ahmed和Focht第一次分离得到 了2个无色菌株(Achromobacter)，它们可以使一些PCBs化合物降解成为 氯苯酸【Ahmed和Focht，Can JMicrobiol，1973，19：47-52】。然后Furukawa 和Matsumura报道了利用2种联苯降解菌降解31种不同的PCBs化合物 【Furukawa和Matsumura，J Agric Food Chem，1976，24：251-256】。 Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707是在日本北九州一个联苯生产工厂附 近的土壤中分离得到的，这个菌株降解PCBs的幅度很窄【Furukawa等，J  Bacteriol，1986，166：392-398】。Burkholderia cepacia LB400是在美国纽 约一个PCB污染场所分离得到的【Bedard等，Appl.Environ.Microbiol，1987， 53：1103-1112；Bopp，J.Ind.Microbiol.Biotechnol，1986，1：23-29】。通 过对LB400菌株的降解PCBs的实验显示，LB400比KF707降解PCB的范 围更大。通过19个不同的PCBs同分异构体测试显示，LB400可以降解17 种，而KF707只降解8种【Erickson and Mondello，Appl Environ Microbiol， 1993，59：3858-62；Gibson等，J Bacteriol，1993，175：4561-4564】。Jia  等分离得到了一株多氯联苯降解能力比较强的革兰氏阴性菌，命名为LY402。 LY402可以降解高氯联苯的菌株，这点是与过去的分离得到的菌株有所不同 【Jia等，J Microbiol Biotechnol，2008，18：952-957】。另外，一些真菌， 酵母和蓝细菌可以将低氯PCBs降解为一羟基和二羟基化合物。例如，一种 白腐真菌Phanerochaete chrysosporium对低氯PCBs具有较高的降解效率 【Dietrich等，Appl Environ Microbiol，1995，61：3904-3909；Beaudette等， Appl Environ Microbiol，1998，64，2020-2025】。降解PCBs主要是由bph 基因簇的bphA、bphB、bphC和bphD四个基因编码的联苯双加氧酶(BphA)， 二氢二羟基脱氢酶(BphB)，2，3二羟基双加氧酶(BphC)和水解酶(BphD) 共同发挥作用【Furukawa，Biodegradation，1994，5：289-300；Masayuki等， J Biosci Bioeng，2002，421-427】。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种荧光假单胞菌的联苯降解 相关基因操纵子，该操纵子源自于荧光假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。

本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种包含荧光假单胞菌联苯降解 相关基因操纵子的表达载体。

本发明所要解决的技术问题之三在于提供一种包含荧光假单胞菌联苯降解 相关基因操纵子的表达载体在生物降解联苯和多氯联苯中的应用。

本发明是通过如下技术方案来实现上述目的的。

所述联苯降解相关基因操纵子，来源于荧光假单胞菌，其碱基序列如SEQ  ID No 1所示，其含有碱基A 1313个，碱基C 1955个，碱基G 2117个，碱基T 1331 个。

所述的源于荧光假单胞菌的联苯降解相关基因操纵子的制备方法，包括 以下步骤：

1)菌株的筛选

选取土壤样品的地点为上海市浦东新区(原南汇区)老港一废弃化工厂 附近10米的小河淤泥。将土样装入灭菌的纸袋中，在超净工作台上称取10g 土样，放入陶瓷研钵中，加入50mL无菌水，用无菌研棒捣碎，静置5分钟后， 吸1-5mL上层清液加入到100mL含0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的M9液体基 本培养基中，于28℃ 150转/分钟培养3天，从中取样1mL加入到新100mL含 0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的M9液体基本培养基中继续继代培养，如此继 代4次后，取20μL图板于含0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的M9固体基本培养 基上，于28℃培养3天，将一个生长良好的荧光假单胞菌挑选出来进行进一步 研究。

2)菌株总DNA的提取

将分离获得的荧光假单胞菌株在100mL液体LB培养基中28℃、150转/分 钟培养过夜(16小时)，菌体培养液以6,000g重力加速度离心5min，得到菌体 沉淀。这些沉淀在-20℃下冷冻1h。之后使用TE(10mM Tris-HCl、1mM EDTA， pH 8.0)溶液清洗一次。加入浓度为10mg/mL溶菌酶的无菌水悬浮，在37℃下 摇床培养1h。加入0.5M EDTA，10％(w/v)SDS和浓度为5M的NaCl轻轻振 荡混匀。再加入浓度为20mg/mL蛋白激K，反应物在37℃下培养1h。用与培 养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取DNA。水 相用与相当水相体积1/2(0.5倍体积)的氯仿∶异戊醇(24∶1)萃取。振荡混匀 后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇。振荡混匀后 离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液 中重悬浮。所得总DNA储存于4℃下备用。

3)基因组文库的构建

上述荧光假单胞菌株总DNA用Sau3A I酶切，经琼脂糖凝胶回收10kb左右 的DNA片断备用。此片断经过末端去磷酸化连接到同样去磷酸化的 pACYC184质粒载体。上述连接产物转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α 电击感受态细胞，涂布与LB固体培养基，37℃下培养24h进行质粒大抽。这 样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。

4)序列测定

对在0.01wt％四氯联苯为唯一碳源的M9固体基本培养基上生长良好的 荧光假单胞菌落接种于LB液体培养基中进行过夜培养，质粒抽提后进行序 列测定。

5)序列分析

通过核苷酸序列测定分析，获得联苯降解相关基因操纵子片段，它具有 如SEQ ID No 1的碱基信息。

6)表达载体的构建

将联苯降解相关基因操纵子片段SEQ ID No 1的序列直接与表达载体 pMD-18 vector(takara大连)相连，4℃下连接12小时，然后将该载体转化 大肠杆菌DH5α感受态细胞(takara大连)中。

含有联苯降解相关基因操纵子SEQ ID No 1片段的表达载体转入原核微 生物细胞后，该细胞能够合成联苯降解相关酶。将联苯加入菌液中，经过培 养，联苯的含量下降。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明成功制得一种荧光假单胞菌联苯降解相关基因操纵子，为了进一 步分析该荧光假单胞菌来源的联苯降解相关基因操纵子在有机污染物降解中 的作用与功能，分析了含有该操纵子大肠杆菌菌株对联苯的降解能力。结果 表明本发明分离出的源于荧光假单胞菌的联苯降解相关基因操纵子及其表达 载体可用于生物降解联苯和多氯联苯。

附图说明

图1为Sau3AI酶切的片段，其中A为荧光假单胞菌总DNASau3AI酶切 的片段。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但不限于本发 明。

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株由上海市农业科学院生物技术研 究所植物基因工程研究室保存。载体、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连 接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司 和美国New England Biolabs公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司 和上海国药化学试剂公司购买。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试 剂盒购自美国应用系统公司。

本发明涉及的分子生物学实验若没有特殊说明，均参考《分子克隆》一 书【Sambrook J，Frets E F，Mannsdes T et al.In：Molecular Cloning.2nd ed.Cold  Spring Harbor Laboratory Press，1989】。该书及其后续出版版本是本领域技术 人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书 籍。

实施例1

降解多氯联苯菌株的筛选

(一)试验方法：

取土壤样品[地点为上海市浦东新区(原南汇区)老港一废弃化工厂附近 10米的小河淤泥]，将土样装入灭菌的纸袋中；在超净工作台上称取10g土 样，放入陶瓷研钵中；加入50mL无菌水，用无菌研棒捣碎；静置5min后； 吸1-5mL上层清液加入到100mL含0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的M9液 体基本培养基中；于28℃ 150转/分钟培养3天；从中取样1mL加入到新100 mL含0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的M9液体基本培养基中继续继代培养。 如此继代4次；取20μL图板于含0.01wt％三氯联苯为唯一碳源的M9固体基 本培养基上。

(二)试验结果：

于28℃培养3天，分离获得一个生长良好的荧光假单胞菌株。

实施例2

多氯联苯降解荧光假单胞菌株总DNA的提取

(一)试验方法：

接种分离获得的荧光假单胞菌株在100mL液体LB培养基中；28℃、150 转/分钟培养过夜(16h)；菌体培养液以6,000g重力加速度离心5min，得到菌 体沉淀；菌体沉淀在-20℃下冷冻1h；使用TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA， pH 8.0)溶液清洗一次；加入含浓度为10mg/mL溶菌酶的无菌水悬浮；在37℃ 下摇床培养1h；加入0.5M EDTA，10％(w/v)SDS和浓度为5M的NaCl 轻轻振荡混匀；再加入浓度为20mg/mL蛋白激K；反应物在37℃下培养1h。 用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取DNA； 加入与相当水相0.5倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)；振荡混匀后离心5min；吸 取水相；加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇；振荡混匀；离心15min； 取沉淀；用70％(v/v)酒精冲洗DNA；干燥；50uL TE缓冲液中重悬浮；所 得总DNA储存于4℃下备用。

(二)试验结果：

接种分离获得的荧光假单胞菌株在100mL液体LB培养基28℃过夜培 养生长良好。

实施例3

降解多氯联苯菌株基因组文库的构建

(一)试验方法：

取10μL荧光假单胞菌株的DNA，加入1∶100稀释的Sau3A I酶1μL；37℃ 分别酶切10min、20min、30min、40min、50min和60min；加入10×loading  buffer 1μL终止反应；电泳检测最适酶切反应时间；而后选择相同的体系酶切 30min进行大量酶切；0.7％(w/v)琼脂糖凝胶电泳；回收5-8kb的DNA片段。 回收片段采用杭州维特洁生化技术有限公司DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回 收；质粒载体pACYC184用BamH I完全酶切后SAP碱性磷酸酯酶进行末端去 磷酸化，以减少载体自连；上述回收后的荧光假单胞菌株DNA(200ng)和 末端去磷酸化的质粒载体pACYC184(150ng)用2U的T4ligase连接；4℃ 下连接16h；连接产物用正丁醇沉淀后，用70％(v/v)的乙醇离心洗涤；最 后用10μL的超纯水溶解。

(二)试验结果：

0.7％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测分离获得的荧光假单胞菌株的DNA的 Sau3A I酶解，发现37℃酶切20min的DNA片段呈现弥散状态(参见图1)。

实施例4

电击法转化大肠杆菌

(一)试验方法：

接种固体培养基上生长良好的荧光假单胞菌单菌落放入250mL SOB液 体培养基中培养；30℃，275转/分钟培养过夜；长至OD₅₅₀到0.75时，将菌液 倒入预冷的离心管中，冰置10min；4℃，5500转/分钟离心5-6min，倒上清； 加入无菌水重悬菌体；4℃，5500转/分钟离心5-6min，倒上清；再用无菌水 洗涤一遍，4℃，5500转/分钟离心5-6min，倒上清；加入10％无菌甘油重悬 菌体；4℃，5500转/分钟离心5-6min，倒上清；用1mL枪头吹起浓菌液，即 为电击感受态细胞；取微量DNA(0.1-1ng)样品于80-100μL感受态细胞中， 混匀，冰置2min；将混合物加入预冷的1mm电击杯中，进行电击，电击参 数为：电脉冲为2.5μF，电压2.5kV，电阻200Ω，电击时间为4.5s)；立即 加入1mL培养基，于37℃震荡培养1小时。

将菌液涂布于LB(含有50μg/mL氨苄青霉素)平板上，37℃培养12-16h；

抽提质粒，-20℃保存。

(二)试验结果：

上述连接产物电击转入大肠杆菌DH5α电击感受态细胞，涂布与LB固体 培养基，37℃下培养24h后，转化子库容为4×10⁴个。进行质粒大抽，构建成 了包含有目的基因的基因组文库。

实施例5

筛选降解多氯联苯的转化子

(一)试验方法：

将降解多氯联苯菌株基因组文库转入大肠杆菌DH5α；图板于含0.01wt％ 三氯联苯为唯一碳源的M9固体基本培养基上；于28℃培养3天。

(二)试验结果：

大肠杆菌菌落生长良好。

实施例6

联苯降解相关基因操纵子的序列测定与分析

(一)试验方法：

将长势良好的大肠杆菌菌落接入2mL的LB培养基中进行过夜培养；37度 振荡(150转/分钟)过夜培养。取1.5ml，13000rpm离心30秒；倒尽上清夜， 悬浮菌体于100ml预冷的溶液I中，Vortex。加入200ul新鲜配置的溶液II，快 速上下混匀。加入150ul预冷的溶液III，快速上下混匀，冰上放置15分钟。 13000rpm，4℃离心15分钟。将上清转入另一离心管中，加入900ul预冷的无 水乙醇，混匀。冰置10分钟。13000rpm 4℃离心15分钟。倒去上清，加入1ml70％ 乙醇，洗涤DNA沉淀。13000rpm离心5分钟，去上清。加入30μl TER溶解沉 淀，37℃水浴30分钟后，-20℃保存待用。进行抽提质粒的序列测定。

(二)试验结果：

大肠杆菌质粒后电泳检测，质粒含量约为100ng/μl。DNA序列测定显示， 联苯降解相关基因操纵子长度为6716bp，其中碱基A有1313个，碱基C有1955 个，碱基G有2117个，碱基T有1331个。具体见序列SEQ NO 1。

实施例7

HPLC检测联苯降解

(一)试验方法：

在250mL锥形瓶中加入100mL LB培养液，接入荧光假单胞菌菌种 100μL；28℃，120转/分钟过夜培养；加入1mL配好的联苯溶液(50mg/mL， 1g联苯溶于20mL甲醇)；继续28℃，120转/分钟培养；3天后，吸取500μL 菌液于dorf管，再加入500uL乙醚；振荡器振荡5-10min充分混匀；吸取 上清，置于新的dorf管中；在dorf管中加入500μL甲醇，混匀后进行旋转蒸 发；吸出剩余的甲醇，再加入500μL甲醇；过滤膜过滤于新的dorf管中；上 柱，HPLC条件：机器为安捷伦1100系列，流动相(乙腈∶水＝70∶30)，流速 1.0mL/min，固定相(C18反向柱)，柱温(常温)，检测波长(254nm)， 进样量(20μL)。

(二)试验结果：

联苯纯品的浓度为100μg/mL，出峰时间为5.9min左右。经过1天的含 联苯降解相关基因操纵子的大肠杆菌降解了培养基约46.8％的联苯，而对照 空白降解了1.5％，空白大肠杆菌降解了约3.2％。该结果表明：含有本发明 的联苯降解相关基因操纵子的大肠杆菌具有明显的降解联苯能力(参见表 1)。

表1 HPLC检测联苯降解分析

                                                                  

编号                                          降解效率

                                                                  

空白对照                                      1.5％

空白大肠杆菌菌株                              3.2％

含本发明的联苯降解相关基因操纵子的大肠杆菌    46.8％

                                                                  

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术 方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。