抗人VEGF和OPN双特异性抗体、其制备方法及用途

摘要

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了抗VEGF和OPN双可变区IgG分子样双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明公开的抗体具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，既能与VEGF结合，还能与OPN结合，具有与联合应用Bevacizumab和hu1A12相似的抗肿瘤治疗效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类抗人VEGF和OPN 双特异性抗体、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高 居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚 期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手 术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很 大的局限性，其疗效难以进一步提高。

血管生成对肿瘤的生长和转移有着重要作用，使肿瘤的生长有两个明显不 同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，促进肿 瘤增殖、侵袭。新生血管的生长和成熟是一个复杂的多因子和多信号传导过程 的结果，其中涉及到很多血管生成因子，其中最主要的是血管内皮生长因子 (VEGF)。VEGF能与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激 酶信号转导途径发挥功能，可以促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进 肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细 胞、成纤维细胞内、皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血 管，促进肿瘤转移。大量结果证明，VEGF在促进肿瘤血管生成过程中起重要作用， 阻断VEGF被认为是当前最为有效的抗肿瘤治疗方法之一。

肿瘤的发生发展是个多因素多机制多种因子参与的过程。有研究发现，在 肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌等多种癌组织中均可发现骨桥 蛋白(Osteopontin，OPN)表达增加。进一步研究发现，人骨桥蛋白是一种含 314个氨基酸残基的磷酸化糖蛋白，含有凝血酶的的酶切位点，参与调节细胞骨 架重构、细胞凋亡、细胞增殖和迁移等过程，且OPN受体和血管重建关系密切， 整合素α_vβ₃和OPN的共同表达可以刺激内皮细胞迁移。OPN在肿瘤生长过程中新 生血管形成的机制起到了重要的作用。因此，抑制OPN的活性可阻断肿瘤血管生 成，抑制肿瘤的生长。

大量研究表明，VEGF和OPN在血管生成的机制中有很大关联.VEGF可诱导内 皮细胞编码α_vβ3的mRNA增加，使新生血管表面有α_vβ3高水平表达.而VEGF同 样也可以诱导编码OPN的mRNA增加，而OPN是α_vβ3的配体，二者相互作用可促进 内皮细胞迁移.VEGF可以迅速增加微血管的通透性，导致包括凝血因子在内的血 浆蛋白浓度增高，上调一些蛋白分子的表达，如生长因子，粘附分子，蛋白酶，蛋 白酶受体，易于激活外源性凝血途径，产生凝血酶，促进OPN的酶切。体外实验 结果证实，经凝血酶酶切的OPN，其粘附力比未经酶切者强，能大大提高内皮细 胞的迁移速度，促进微血管的生成。此外，OPN还能激活Brk/NF-nB/ATF-4信号 转导途径来诱导VEGF的表达，并促进VEGF诱导内皮细胞增生的作用，进而促进新 生血管形成，加快肿瘤细胞的生长及转移。所以，如果能阻断OPN，不但可以抑 制其促肿瘤血管生成的作用，还可以下调VEGF的表达，进而阻止VEGF介导的肿 瘤新生血管的形成。

由上可知，如果能同时阻断VEGF和OPN，不但可以抑制VEGF的促血管生成的 功能和OPN的促进肿瘤转移的功能，还将降低内源性VEGF的表达，进而可进一步 抑制VEGF的促血管生成作用，并减少其介导的OPN的酶切，从而抑制OPN的促进 血管生成和肿瘤转移的功能，故可能会比单独阻断VEGF或OPN有更好的抑制肿瘤 生长转移的协同作用，对肿瘤的治疗将具有重要意义。

Genentech公司的抗VEGF人源化抗体Avastin(Bevacizumab)已于2004年 月获得美国FDA批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌。本发明的发明人以前 得到了一个特异性抗OPN的人源化抗体hu1A12(已经在WO2008128455，发明名称 为《骨桥蛋白的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其在制备抗肿瘤转 移药物中的用途》中公开，中国专利申请号200710039873.3，公开日2008年10 月29日)，该人源化抗体可特异性阻断OPN，在体内外有明显的抗肿瘤活性。若将 Bevacizumab和hu1A12联合应用，在理论上可同时阻断VEGF和OPN，进一步提高 抗肿瘤治疗效果。但是，单抗联合应用具有很多限制。首先，临床上同时应用 两种抗体的的安全性和效果至今未有详尽的报道，可能存在安全风险；另外，联 合应用两种抗体也存在调节障碍和造价太高的缺陷，限制了其临床应用。

因此，采用基因工程技术构建一个可以同时阻断两个靶点的双特性抗体， 既能阻断VEGF，又能阻断OPN，进而更有效的抑制肿瘤血管生成和转移，一直是 本领域的技术人员急待解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人进行了大量试验，得到了一个可以同 时阻断两个靶点的双特异性抗体，即可以阻断VEGF，也能阻断OPN，从而完成 了本发明。

本发明公开了：

1.一种抗VEGF和OPN双可变区IgG分子样双特异性抗体，该双特异性抗体 既能与VEGF结合，还能与OPN结合。

2.一种抗VEGF和OPN双可变区IgG分子样双特异性抗体，为VEGF/OPN-BsAb， 具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。

3.一种分离的核酸分子，编码上述2所述的可溶性双特异性抗体 VEGF/OPN-BsAb，具有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。

4.一种载体，含有上述3所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连 的表达调控序列，其中载体可以为pcDNA3.1，pDHFR之一。

5.上述5所述的载体，为pcDNA3.1。

6.一种宿主细胞，含有上述5所述的载体，为真核细胞。

7.上述6所述的宿主细胞，为哺乳动物细胞。

8.上述7所述的宿主细胞，为CHO细胞。

9.一种制备上述双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb的方法，该方法包括：

a)在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达双特异性抗体；

b)分离或纯化所述的双特异性抗体。

10.一种组合物，含有上述的双特异性抗体和药学上可接受的载体。

11.上述双特异性抗体在制备抗肿瘤药物中的用途。

12.上述11所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

13.上述11、12任一所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。

本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pCDNA3.1，pDHFF之一， 表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统可用于本发明的融合蛋白的表达， COS，CHO，NSO，sf9及sf21等均可适用于本发明。

可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a，BL21(DE3)，TG1 之一。

本发明中公开的双特异性抗体的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿 主细胞，从而表达双特异性抗体，分离或纯化所述的双特异性抗体。

利用上述方法，可以将双特异性抗体纯化为基本均一的物质，例如在 SDS-PAGE电泳上为单一条带。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的双特异性抗体进行分离纯化，根 据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方 法洗脱结合在亲和柱上的双特异性抗体多肽。

本发明公开的上述双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb是通过以下方法得到的： Bevacizumab的重链可变区通过overlap PCR的方法经由Linker(ASTKGP，AST 或GGGGS)或直接与PCR克隆出的hu1A12的重链可变区的N末端串联在一起分 别构成了VEGF/OPN-BsAb、VEGF/OPN-BsAb1、VEGF/OPN-BsAb2、VEGF/OPN-BsAb3 的重链可变区，然后分别再与人IgG1抗体的重链恒定区连接，构建出 VEGF/OPN-BsAb、VEGF/OPN-BsAb1、VEGF/OPN-BsAb2、VEGF/OPN-BsAb3的重链 基因；Bevacizumab的轻链可变区通过overlap PCR的方法经由Linker(TVAAP， TVA或GGGGS)或直接与hu1A12的轻链可变区的N末端串联在一起构成了 VEGF/OPN-BsAb、VEGF/OPN-BsAb1、VEGF/OPN-BsAb2、VEGF/OPN-BsAb3的轻链可 变区，然后用overlap的方法连接上C_κ，构建出VEGF/OPN-BsAb、VEGF/OPN-BsAb1、 VEGF/OPN-BsAb2、VEGF/OPN-BsAb3的轻链基因。将上述重、轻链基因分别装入 真核表达载体pcDNA3.1和pcDNA3.1Zeo。上述质粒一起用脂质体法转染CHO-K1 细胞，并用含600μg/ml G418和250μg/ml Zeocin的选择培养基筛选稳定表 达双特异性抗体的细胞克隆.利用Protein A柱通过亲和层析从细胞培养物的 上清中纯化双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb、VEGF/OPN-BsAb1、VEGF/OPN-BsAb2、 VEGF/OPN-BsAb3。用同样的方法也可以得到OPN/VEGF-BsAb、OPN/VEGF-BsAb1、 OPN/VEGF-BsAb2、OPN/VEGF-BsAb3，它们的结构与VEGF/OPN-BsAb、 VEGF/OPN-BsAb1、VEGF/OPN-BsAb2、VEGF/OPN-BsAb3相同，不同的仅仅是将 hu1A12的重、轻链可变区分别置于bevacizumab的重、轻链可变区之前。

本发明的发明人对上述的8种双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb、 VEGF/OPN-BsAb1、VEGF/OPN-BsAb2、VEGF/OPN-BsAb3、OPN/VEG-BsAb、 OPN/VEG-BsAb1、OPN/VEG-BsAb2、OPN/VEG-BsAb3进行亲和力检测，发现仅仅只 有VEGF/OPN-BsAb同时完好地保留了hu1A12和bevacizumab的亲和力，因此我 们选择VEGF/OPN-BsAb进行下一步实验，包括抑制HUVEC细胞增殖、体内抑瘤和 抑制肿瘤转移等实验，实验结果表明，本发明公开的双特异性抗体 VEGF/OPN-BsAb同时具有Bevacizumab和hu1A12的功能，它能够能阻断OPN和 VEGF诱导的血管内皮细胞的增值。此外，该双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb可以 和传统的IgG分子一样，最大程度地保留了传统单克隆抗体结构，因为有Fc片 段的存在，可以用普通的ProteinA柱亲和层析法纯化，利于大规模的生产纯化。 实验表明，在相等剂量下，双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb具有与联合应用 Bevacizumab和hu1A12相似的抗肿瘤治疗效果。

本发明公开上述双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb，可以和药学上可以接受的 辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发 明公开的双特异性抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的 多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液 体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在 30℃至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干 等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述可溶性双功能VECFR融 合受体蛋白的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液 稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表 面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八 烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使双功能双特异性抗体 蛋白的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖， 氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚 乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的 技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘 露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含双特异性抗体蛋白的组合物，在对包括人在内的动物给药 后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿 瘤药物使用。

本发明所指的肿瘤，包括腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，肿瘤 组织的来源包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、 心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴茎、前列腺、皮肤、 唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外，还可用于中 枢神经系统的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等，此外眼部的肿瘤包括基 底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，还包括内分泌腺肿瘤、神经内分泌系统 肿瘤、胃肠道胰腺内分泌系统肿瘤，生殖系统肿瘤及头颈部肿瘤等。这里不再 一一列举。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴 随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包 括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止 转移。

本发明中双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb及其组合物在对包括人在内的动物 给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而 异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体 讲静脉注射的剂量是1~1800mg/天。

本发明公开的双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb及其组合物还可以和其他的抗 肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物(1) 作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类； 铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成 的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷 合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶 抑制剂如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU) 等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核 酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制 RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、 光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花 碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主 要抑制蛋白质的合成；2、激素类 抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦 等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟 它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通 过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素-2；胸腺肽类；4、单克隆抗 体：美罗华(MabThera)；Cetuximab(C225)；赫赛汀(Trastuzumab) Bevacizumab(Avastin)；5、其他 括一些目前机制不明和有待进一步研究的 药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的双特异性 抗体VEGF/OPN-BsAb及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用 药。

附图说明

图1.双特异性抗体结构示意图；

图2.双特异性抗体与VEGFA结合活性实验结果；

图3.双特异性抗体与OPN的结合活性实验结果；

图4.双特异性抗体抑制VEGF-A和OPN引起的HUVEC细胞增殖活性实验结果；

图5.双功能抗体抑制HCCLM3肿瘤生成曲线；

图6.肺组织转移灶H&E染色形态特征；

图7.各治疗组肺转移灶数目统计；

图8.VEGF/OPN-BsAb有效抑制肿瘤血管生成实验结果。8-1：各治疗组CD31 抗体免疫组化染色结果。8-2：各治疗组微血管计数。

具体实施方式

以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的 限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方 法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞 的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在 许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais， T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd edition， Cold spring Harbor Laboratory Press.

实施例1.人抗体轻、重链恒定区和Fc区基因的克隆

用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公 司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22：197-207)和文献(Nucleic Acids  Research，1982，10：4071-4079)报道的序列分别设计引物扩增抗体重链和轻 链恒定区基因，PCR反应均采用热启动，反应条件：94℃分钟；94℃45秒，60℃ 45秒，72℃1分10秒，30个循环；72℃10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳 纯化回收并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，测序验证后确认获得 了正确的克隆。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别显示了重链恒定区(CH)的核 苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别显示了轻链恒定区(CL) 的核苷酸和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH、pGEM-T/CL。

实施例2：新型双特异抗体的构建

具体构建方法：根据(Cancer Res.57(1997)4593-4599)报道的序列，全 基因合成Bevacizumab的重、轻链可变区基因，Hu1A12的轻、重链可变区序列 请参见中国专利200710039873.3、WO2008128455。Bevacizumab的重链可变区 通过overlap PCR的方法经由Linker(ASTKGP，AST或GGGGS)或直接与PCR克 隆出的hu1A12的重链可变区的N末端串联在一起分别构成了VEGF/OPN-BsAb、 VEGF/OPN-BsAb1、VEGF/OPN-BsAb2、VEGF/OPN-BsAb3的重链可变区，然后分别 再与人IgG1抗体的重链恒定区连接，构建出VEGF/OPN-BsAb、VEGF/OPN-BsAb1、 VEGF/OPN-BsAb2、VEGF/OPN-BsAb3的重链基因；Bevacizumab的轻链可变区通 过Overlap PCR的方法经由Linker(TVAAP，TVA或GGGGS)或直接与hu1A12 的轻链可变区的N末端串联在一起构成了VEGF/OPN-BsAb、VEGF/OPN-BsAb1、 VEGF/OPN-BsAb2、VEGF/OPN-BsAb3的轻链可变区，然后用overlap的方法连接 上C_κ，构建出VEGF/OPN-BsAb、VEGF/OPN-BsAb1、VEGF/OPN-BsAb2、 VEGF/OPN-BsAb3的轻链基因。将上述重、轻链基因分别装入真核表达载体 pcDNA3.1(Invitrogen公司产品)和pcDNA3.1Zeo(Invitrogen公司产品)。上述 质粒一起用脂质体法转染CHO-K1细胞(ATCC)，并用含600μg/ml G418和 250μg/ml Zeocin的选择培养基筛选稳定表达双特异性抗体的细胞克隆。利用 Protein A柱通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化双特异性抗体 VEGF/OPN-BsAb、VEGF/OPN-BsAb1、VEGF/OPN-BsAb2、VEGF/OPN-BsAb3；用同样 的方法也可以得到OPN/VEGF-BsAb、OPN/VEGF-BsAb1、OPN/VEGF-BsAb2、 OPN/VEGF-BsAb3，它们的结构与VEGF/OPN-BsAb、VEGF/OPN-BsAb1、 VEGF/OPN-BsAb2、VEGF/OPN-BsAb3相同，不同的仅仅是将hu1A12的重、轻链可 变区分别置于bevacizumab的重、轻链可变区之前。下面以VEGF/OPN-BsAb为 例详细说明双特异抗体构建表达过程：

VEGF/OPN-BsAb的重链和轻链可变区为VEGF/OPN-BsAbVH和 VEGF/OPN-BsAbVL，经Overlap PCR合成后回收目的条带并克隆到PGEM-T载体 中，筛选阳性克隆测序，分别得到pGEM-T/VEGF/OPN-BsAbVH(核苷酸序列和氨 基酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示)和pGEM-T/VEGF/OPN-BsAbL(核 苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示)。PCR采用Roche 公司的高保真扩增系统，反应条件均为：95℃5分钟；94℃45秒，55℃45秒， 72℃55秒，30个循环；72℃7分钟。

采用Overlap PCR将pGEM-T/VEGF/OPN-BsAbVH中的VEGF/OPN-BsAbVH基因与 质粒pGEM-T/CH中的重链恒定区基因连接，并克隆到pGEM-T载体中，挑选正确 克隆后以HindⅢ和EcoR Ⅰ酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶 切的质粒pcDNA3.1(+)用T4 DNA连接酶进行连接，构建成真核表达载体 pcDNA3.1(+)(VEGF/OPN-BsAbVHCH)(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：9和 SEQ ID NO：10所示)。

采用Overlap PCR将pGEM-T/VEGF/OPN-BsAbVL中的VEGF/OPN-BsAbVL基因与 pGEM-T/CL中的轻链恒定区基因相连，并克隆到pGEM-T载体中，挑选正确克隆 后以HindⅢ和EcoR Ⅰ酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的 质粒pcDNA3.1/ZEO(+)载体相连，构建成真核表达载体pcDNA3.1/ZEO(+) (VEGF/OPN-BsAbVLCL)(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示)。

于3.5cm组织培养皿中接种3×10⁵ CHO-K1细胞，细胞培养至90％-95％ 融合时进行转染：取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(VEGF/OPN-BsAbVHCH)4μg， 质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(VEGF/OPN-BsAbVLCL)6μg)和20μl Lipofectamine2000 Reagent[Invitrogen公司产品]分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静 置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成， 其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的 DNA-脂质体复合物加入到板中，CO₂孵箱培养4小时后补加2ml含10％血清的DMEM 完全培养基，置于CO₂孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418和250μg/ml Zeocin的选择培养基筛选抗性克隆。将筛选得到的高表达 克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化 双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb。将VEGF/OPN-BsAb用PBS进行透析，最后以紫 外吸收法定量。VEGF/OPN-BsAb的结构如图1所示。图1中还显示了 OPN/VEGF-BsAb的结构。

实验例1：双特异性抗体与VEGF和OPN的结合活性检测

将VEGF(R&D公司产品)用0.05mmol/L碳酸钠.碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6) 稀释成2ug/ml，50ul/孔，4℃包被过夜。10％脱脂奶室温封闭2h后，加入 不同浓度的双特异性抗体和bevacizumab(Roche公司产品)，50ul/孔，每个 浓度取3个平行孔，室温孵育2h。弃上清液，PBS洗涤3次，加入按效价稀释好 的HRP标记的羊抗人IgG单抗(KPL公司产品)，50ul/孔，室温孵育45min。 PBS充分洗涤后，TMD显色后，置酶标仪(Elx型自动酶标比色仪，美国BIO-TEK 公司)中测定450nm吸光度(A450)值。实验结果如图2所示。实验结果表明：可 能由于抗体可变区的互相干扰，双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb1， VEGF/OPN-BsAb2，VEGF/OPN-BsAb3，OPN/VEGF-BsAb，OPN/VEGF-BsAb1， OPN/VEGF-BsAb2，OPN/VEGF-BsAb3与VEGF-A的结合活性明显低于亲本抗体 bevacizumab。但是，VEGF/OPN-BsAb与VEGF的结合活性与Bevacizumab相似。

将OPN用0.05mmol/L碳酸钠.碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)稀释成2ug/ml， 50ul/孔，4℃包被过夜。10％脱脂奶室温封闭2h后，加入不同浓度的双特异 性抗体和亲本抗体hu1A12，50ul/孔，每个浓度取3个平行孔，室温孵育2h。 弃上清液，PBS洗涤3次，加入按效价稀释好的HRP标记的羊抗人IgG单抗(KPL 公司产品)，50ul/孔，室温孵育45min。PBS充分洗涤后，TMD显色后，置酶 标仪(Elx型自动酶标比色仪，美国BIO-TEK公司)中测定450nm吸光度(A450) 值。实验结果如图3所示。双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb1，VEGF/OPN-BsAb3， OPN/VEGF-BsAb1，OPN/VEGF-BsAb2，OPN/VEGF-BsAb3与OPN的结合活性明显低 于亲本抗体hu1A12。但是，双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb，VEGF/OPN-BsAb2， OPN/VEGF-BsAb的结合活性均与hu1A12相似。

总之，以上实验结果表明在这8个构建的双特异性抗体中，只有 VEGF/OPN-BsAb同时完好保留了两个亲本抗体的结合活性。

实验例2：Biacore分析

基于上述结果，我们选取VEGF/OPN-BsAb进行下一步实验。将VEGF蛋白(R&D 公司)或OPN蛋白包被到CM5芯片(GE公司)，用Biacore T100(GE Healthcare) 检测VEGF/OPN-BsAb的亲和力，具体检测亲和力数值见表1。

表1.Biacore分析

Biacore分析结果表明VEGF/OPN-BsAb分别拥有与hu1A12相似的结合OPN的亲 和力和与bevacizumab相似的结合VEGF的亲和力。

实验例3：双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb抑制HUVEC细胞增殖实验

取生长状态良好的HUVEC细胞(Cascade Biologics公司产品)，调整细胞浓度为 2.5×10⁴/ml，接种于96孔细胞培养板，200μl/孔，于37℃、5％CO2孵箱中培 养24h后换无血清培养基，继续培养72h，加入不同浓度梯度的双特异性抗体 VEGF/OPN-BsAb，bevacizumab，hu1A12，bevacizumab+hu1A12，无关human IgG (Rituximab购自Roche公司)，，每个浓度取3个平行孔，37℃孵育1h，加入终 浓度各为35ng/ml的VEGF-A和OPN继续培养24h后，加入10μl[³H].TdR(18.5 kBq/孔)，37℃孵箱中孵育7h，细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤膜上，采用[³H] 液闪计数仪进行测定。

实验结果如图4所示。实验结果表明，双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb可同时抑 制VEGF-A、OPN引起的HUVEC细胞增殖，比Bevacizumab和hu1A12有更显著的抑 制效果，与Bevacizumab及hu1A12联合应用的双抗体组效果相似。

实验例4：双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb体内抑制肿瘤生长实验

为检测双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb体内抑瘤活性，首先用HCCLM3细胞 (人肝癌细胞，上海中山医院肝癌研究所))，接种于到雌性BALB/c裸鼠(第二军 医大学实验动物中心)右胁侧皮下，成瘤后尾静脉注射20mg/kg各组下列抗体： 双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb，Bevacizumab，hu1A12，无关对照human IgG，Bevacizumab和hu1A12两种单抗各20mg/kg联合应用，每周注射2次，持 续10周，每天测量肿瘤的长宽，计算肿瘤体积.

肿瘤生长曲线如图5所示。结果表明：VEGF/OPN-BsAb治疗组肿瘤生长速度 显著小于Bevacizumab及hu1A12治疗组(20天后，P＜0.01，Mann-Whitney检验)。 VEGF/OPN-BsAb的治疗效果与Bevacizumab和hu1A12联合应用效果相似。

实验例5：双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb体内抑制肿瘤转移实验

10周后处死以上各组小鼠，肺组织经Bouin’s液固定，石蜡包埋，进行连 续切片和H&E染色，显微镜下观察肺组织内转移灶的生长情况。实验结果如图 6和图7所示，结果表明，VEGF/OPN-BsAb治疗组肺的转移灶与Bevacizumab与 hu1A12双抗体联合治疗组相似(P＞0.05，Mann-Whitney检验)。但VEGF/OPN-BsAb 治疗组肺转移灶较Bevacizumab或hu1A12治疗组显著减少(P＜0.01， Mann-Whitney检验)。

实验例6：双特异性抗体VEGF/OPN-BsAb抑制肿瘤血管生成

10周后处死以上各组小鼠，肿瘤组织用石蜡包埋进行切片并用大鼠抗小鼠 CD31单克隆抗体(BioLegend公司)染色，二抗为羊抗大鼠IgG/HRP。CD31蛋白主 要表达于血管内皮细胞膜上，单个血管内皮细胞及微血管都有CD31蛋白表达。 用抗CD31抗体可以观察到肿瘤内微血管，镜下观察计数结果。实验结果见图8， VEGF/OPN-BsAb治疗组的肿瘤微血管密度(MVD)与bevacizumab和hu1A12联合 治疗组相似(P＞0.05，Mann-Whitney检验)。但VEGF/OPN-BsAb具有比 bevacizumab或hu1A12明显更强的抑制肿瘤血管形成的作用(P＜0.05， Mann-Whitney检验)。