筛选与鉴定幽门螺杆菌抗原表位肽的方法

摘要

本发明提供了一种筛选与鉴定幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽的方法。所述方法包括体外放大培养Hp抗原特异性T细胞的方法、抗原特异性T细胞体外应答的检测方法、利用抗原特异性T细胞结合抗原步移合成重叠肽来筛选免疫显性表位的方法以及利用HLA-II类分子抗体阻断实验和不同HLA-II类分子亚型的EBV转化B淋巴细胞系(BLCL)对表位的递呈实验来确定表位HLA限制性的方法。根据本发明方法所得到的幽门螺杆菌HpaA抗原免疫显性表位多肽具有SEQ ID No：8、22、30和42所示的氨基酸序列。本发明所提供的方法可避免漏筛和误筛，并且所筛选到的表位肽可以被抗原递呈细胞自然递呈。

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及筛选和鉴定抗原表位肽的方法，尤其涉及筛选和鉴定幽门螺杆菌抗原表位肽的方法。 

背景技术

幽门螺杆菌(Hp)是澳大利亚学者Warren和Marshall在1982年发现的。在过去的近30年时间里，研究证实Hp是胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡的主要病因，并与胃癌，胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)的发生密切相关，被世界卫生组织列为胃癌的I类致癌因子。并且，Hp的感染率非常高，流行病学调查显示全世界有50％的人口携带该细菌，特别是某些发展中国家的感染率甚至高达80％。因此，有效的治疗Hp感染对人类的健康是非常重要的。 

目前，临床上主要采用抗生素多联疗法治疗Hp感染。虽然能够达到85％的根除效率，但是存在以下缺点：1、药物疗法毒副作用大；2、复杂的联合用药导致病人的依从性差；3、药物不能防止Hp的潜在感染；4、抗生素治疗易产生赖药性而导致治疗失败；5、对发展中国家病人而言，药物疗法在经济上也比较困难。免疫接种是预防和控制感染性疾病最经济而有效的方法，鉴于Hp感染的高发病率及其与慢性胃炎、消化性溃疡以及胃癌、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的密切关系，如何通过免疫接种达到防治这些疾病的目的，一直是各国科研人员研究的重点问题。疫苗接种通过有效地调动机体免疫系统，克服细菌对宿主的免疫逃避来达到预防感染和消除已感染的细菌的目的，经济而简便，可在人群中大规模运用，并且对赖药细菌仍然有效，因此研究Hp疫苗具有重要意义。 

动物实验研究表明，疫苗接种可以减少Hp在胃黏膜的定植，并减轻胃黏膜的炎症反应，起到预防和治疗Hp感染的作用。目前关于Hp的疫苗多是采用全菌疫苗或重组亚单位疫苗及核酸疫苗等，其引发的免疫应答与Hp感染是的免疫应 答相似。Hp感染使机体内产生强烈的细胞与体液免疫应答，但是感染仍慢性持续化甚至是终身感染，说明机体已经对Hp的存在免疫耐受，自然感染时产生的免疫应答不能起到保护作用，因而通过疫苗接种的方式清除Hp就必须在抗原选择以及在表位水平对抗原进行改造，激发更有效的免疫应答。表位疫苗是以抗原表位为基础制备的疫苗，是目前感染性疾病，恶性肿瘤以及自身免疫性疾病等疫苗设计的新方向。相对传统疫苗其具有很多的优点：1.选择性提高所选择表位的免疫原性；2.去除表位所在蛋白中不必要甚至有害的部分，降低疫苗使用风险。3.可以对表位进行优势组合，扩大免疫应答的宽度；4.应用广泛，不仅有预防作用，还可以作为治疗性疫苗使用。 

研制表位疫苗的第一步是表位的筛选和鉴定。Hp是一种胞外感染细菌，研究证实，CD4+T淋巴细胞在抗Hp感染免疫应答中起着非常重要的作用，因此，在Hp表位疫苗的设计中加入CD4+T细胞表位(及辅助T细胞表位)尤为重要。此外，并非所有的表位均能诱导机体产生强烈的免疫应答，只有免疫显性表位才能引起机体强烈的免疫应答，亚显性表位引起的免疫应答远远弱于显性表位，因此，免疫显性CD4+T细胞表位才是Hp表位疫苗所需要的。 

目前，已报道的Hp抗原CD4+T细胞表位均为小鼠H-2限制性Th表位，由于小鼠和人MHC分子的差别，H-2限制性表位可能不适用于人类疫苗设计，因此需要筛选鉴定HLA限制性表位。此外，现有报道的Hp表位多采用生物信息学软件预测而来，准确率不高，虽能通过实验加以验证，但是仍不能避免表位漏筛现象。此外，软件预测方法筛选表位难以解决表位的免疫显性问题，而免疫显性表位才是Hp表位疫苗最佳的候选表位。因此，建立一种系统的筛选免疫显性CD4+T细胞表位的方法显得尤为重要。本发明利用抗原特异性T细胞及步移重叠合成肽，建立了一种系统筛选Hp抗原HLA限制性免疫显性辅助T细胞(Th细胞)表位的方法。 

发明内容

本发明提供一种筛选与鉴定幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽的方法，包括以下步骤：培养外周血单核细胞；在HpaA抗原条件下，体外扩增外周血单核细胞中的HpaA抗原特异性CD4+T细胞，并收集所获得的 细胞；在收集的细胞中加入待筛选的多肽刺激这些细胞，并继续培养；检测特异性CD4+T细胞对步骤c的多肽的应答频率，根据应答频率的不同筛选出免疫显性表位肽，以及确定所述免疫显性表位肽的HLA限制性。 

上述体外扩增外周血单核细胞中的HpaA抗原特异性CD4+T细胞的步骤包括：用RPMI-1640完全培养基调整所培养的外周血单核细胞的浓度至2.5～5×10⁶/ml，加入HpaA抗原进行刺激，该HpaA抗原的终浓度为0.05～1μM，培养5-8天时加入终浓度为25U/ml的重组人IL-2，继续培养13-16天后收集细胞。 

上述待筛选的多肽通过以下方法获得：在UniProt蛋白数据库中检索幽门螺杆菌11637菌株来源的HpaA蛋白序列，从第28号氨基酸开始，每次步移6个氨基酸，合成步移重叠的18个氨基酸多肽；或者在获得的步移重叠的18个氨基酸多肽中每次步移2个氨基酸合成步移重叠的13个氨基酸多肽。其中所述18个氨基酸多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3-39所示；所述13个氨基酸多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：40-44所示。 

本发明还提供了鉴定所筛选到的免疫显性表位肽的HLA限制性的方法，包括以下步骤：在特异性CD4+T细胞的培养液中加入抗HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ分子的单克隆抗体，然后加入目的肽段进行刺激，ICS和流式检测特异性CD4+T细胞对多肽的应答频率，被抗HLA-DR分子的单克隆抗体阻断同时不被抗HLA-DP和HLA-DQ分子的单克隆抗体阻断的多肽即是HLA-DR限制性免疫显性表位肽。 

所述鉴定所筛选到的免疫显性表位肽的HLA限制性的方法，进一步包括：用含有EBV的B淋巴细胞系作为抗原递呈细胞负载目的肽段后与该肽段特异性CD4+T细胞进行混合淋巴细胞反应，然后进行ICS和流式检测多肽对特异性CD4+T细胞对多肽的应答频率，根据特异性CD4+T细胞的应答频率检测所述免疫显性表位肽的HLA限制性亚型。 

本发明还提供根据筛选与鉴定幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽的方法所得到的幽门螺杆菌HpaA抗原的HLA限制性免疫显性表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8、22、30和42所示。其中，氨基酸序列如SEQ ID NO：42所示的表位多肽具有HLA-DR限制性，该HLA限制性亚型为HLA-DRB1*0406。 

本发明所提供的幽门螺杆菌HpaA抗原的免疫显性表位肽可在制备用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗中应用。 

本发明所提供的筛选和鉴定方法准确率高，可以避免漏筛和误筛现象，可以区别抗原表位的免疫显性和免疫亚显性，并且所筛选出的抗原表位均能被抗原递呈细胞自然递呈，由此使得制备高效、低毒、高安全性的Hp疫苗成为可能。 

本发明所提供的免疫显性表位多肽具有高免疫原性，可引发强烈的免疫反应。另外所述免疫显性表位多肽不含有不必要甚至有害的部分，从而降低由其所制备的疫苗的使用风险。本免疫显性表位多肽可以与其他疫苗成分进行优势组合，从而扩大免疫应答的宽度。由本免疫显性多肽制备的疫苗对幽门螺杆菌感染不仅有预防作用，还可以作为治疗性疫苗使用。 

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。 

附图说明

图1A表示经ICS方法检测到的Hp感染阳性者PBMC中抗原特异性CD4+T细胞频率，可见DMSO对照组和肽库刺激组之间没有显著差别； 

图1B表示经ELISPOT方法检测到的Hp感染阳性者PBMC中抗原特异性CD4+T细胞频率，可见Hp感染阳性者PBMC中HpaA特异性CD4+T细胞频率极低； 

图2A表示Hp感染者外周血中抗原特异性CD4+T细胞的体外有效扩增； 

图2B表示Hp感染者外周血中抗原特异性CD4+T细胞的体外扩增过程中，最佳抗原刺激浓度为0.2μM； 

图2C表示Hp感染者外周血中抗原特异性CD4+T细胞的体外扩增过程中，最佳的细胞培养时间是13-16天； 

图3A表示利用抗原特异性CD4+T细胞和步移重叠合成肽对18氨基酸 (18-mer)免疫显性表位进行筛选，其中：第28条肽段(P28，H_190-207)为免疫显性肽段，第6(P6，H_58-75)和第20(P20，H_142-159)条肽段免疫亚显性肽段； 

图3B表示利用抗原特异性CD4+T细胞和步移重叠合成肽对13-mer免疫显性表位进行筛选，其中：P28-3(H_192-204)为免疫显性肽段； 

图4表示利用HLA-II类分子抗体阻断实验初步确定免疫显性肽P28-3H_192-204是HLA-DR限制性的； 

图5表示利用BLCL递呈实验确定免疫显性肽P28-3(H192-204)的HLA限制性是HLA-DRB1*0406； 

图6表示应用来源于样本号为5250的HpaA特异性T淋巴细胞进一步验证了所筛选到的13-mer短肽P28-3为免疫显性肽段； 

图7表示将系统筛选方法与生物信息学软件预测法所得表位进行比较； 

图8表示在相同HLA限制性的不同幽门螺杆菌感染者中对免疫显性表位的进一步验证。 

具体实施方式

材料与方法 

(一)蛋白和肽段 

重组幽门螺杆菌粘附素A亚单位(rHpaA)蛋白(不含信号肽部分)为本单位重组构建(洪愉，幽门螺杆菌黏附素HpaA的克隆、表达及生物学活性研究中华微生物学和免疫学杂志2003年11期)；多肽肽段通过化学方法合成(由上海吉尔生化公司合成)，用二甲亚砜(DMSO)溶解至5mM的浓度，在-70℃保存，临用时用RPMI-1640完全培养基稀释到1mM的浓度。 

(二)主要溶液及试剂配制 

1.RPMI-1640不完全培养基： 

分别称取10.4g RPMI-1640粉末，2.4g Hepes和2g NaHCO3，加入去离子水至100mL，搅匀过滤除菌，分装冻存。 

2.RPMI-1640完全培养基： 

分别量取950mL RPMI-1640不完全培养基和50mL人AB血清，加入20万单位/mL的青霉素和链霉素双抗各0.5mL(终浓度为100U/mL)。 

3.冻存液： 

将胎牛血清与DMSO按照9∶1的比例混合，然后分装冻存。 

(三)所使用的主要试剂及其来源 

  试剂名称   来源   人淋巴细胞分离液   北京TBD公司   幽门螺杆菌血清抗体检测试剂盒   北京贝尔公司   重组人IL-2   美国PeproTech公司   人IFN-γELISPOT检测试剂盒   北京达科为公司   胎牛血清   美国GIBCO公司   APC标记抗CD4单抗   美国BD公司   PE标记抗CD3单抗   美国BD公司   FITC标记抗IFN-γ单抗   美国BD公司   细胞内因子染色试剂盒   美国BD公司   磁珠标记抗CD3/CD4单抗   美国MiltenyiBiotec公司   RPMI-1640不完全培养基   美国GIBCO公司

实施例1：步移重叠18个氨基酸短肽的合成及混合肽库的制备 

HpaA是幽门螺杆菌鞭毛粘附素蛋白A亚单位，在各菌株之间序列是保守的，全长260个氨基酸，其中，1-27氨基酸为信号肽。重组构建的rHpaA为28-260多肽，来源于11637国际标准菌株。于是在UniProt蛋白数据库中检索幽门螺杆菌11637来源的HpaA蛋白序列(编号P55969)，从第28号氨基酸开始合成步移重叠18个氨基酸短肽(由上海吉尔生化公司协助合成)，共37条(最后一条为17个氨基酸短肽)。纯度均大于90％。合成肽信息见表1。将合成的肽段用DMSO溶解至5mM的储存浓度，另取37条短肽各10μL混合在一起组成肽库。分装后-70℃保存。 

UniProt蛋白数据库检索网址： 

http://www.uniprot.org/uniprot/P55969

HpaA1-260的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，HpaA28-260的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 

表1 步移重叠合成HpaA的18个氨基酸短肽基本信息 

(依次对应序列表中的SEQ ID No：3-39) 

实施例2：Hp感染阳性者PBMC中抗原特异性CD4+T细胞频率的检测 

2.1 Hp感染阳性者PBMC的采集保存 

Hp感染阳性者外周血来自解放军重庆血站，在采血前用C¹³尿素酶呼气实验筛查幽门螺杆菌感染阳性者，采血后取白膜层细胞，再用聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液(天津TBD公司)分离PBMC，按照实际说明书进行。分离得到的PBMC用冻存液重悬至细胞密度1×10⁷/mL，以1mL/管的量加入冻存管，放入冻存盒中-70℃冰箱过夜，然后转入液氮冻存。 

2.2 ICS方法检测Hp感染阳性者PBMC中HpaA特异性CD4+T细胞频率 

复苏一管Hp感染阳性者PBMC，用RPMI-1640完全培养基重悬细胞至5×106/ml，96孔平底板每孔铺细胞悬液0.2ml。加入1μl肽库和0.15μl蛋白分泌阻断剂GolgiStop(BD公司)，37℃、5％CO2细胞培养孵箱培养5小时后收 集细胞。用PE标记的抗人CD3单抗、APC标记的抗人CD4单抗以及FITC标记的抗人IFN-γ单抗进行染色(BD公司)。流式细胞仪检测分泌IFN-γ的CD4+T细胞比例。 

2.3酶联免疫斑点实验(Enzyme-linked Immunospot，ELISPOT)检测Hp感染阳性者PBMC中HpaA特异性CD4+T细胞频率 

由于细胞内因子染色的灵敏度不及ELISPOT，且Hp感染者外周血中Hp特异性CD4+T细胞频率较低。因此，拟采用ELISPOT提高检测灵敏度。复苏一管Hp感染阳性者PBMC，用免疫磁珠阳性选择的方法(Miltenyi Biotec公司)分离PBMC中CD4+T淋巴细胞，操作按照试剂盒说明书进行。分离后的CD4+T淋巴细胞用PE标记的抗人CD3单抗、APC标记的抗人CD4单抗染色，流式细胞计数鉴定纯度大于95％。用RPMI-1640完全培养基重悬细胞至密度1×10⁷/ml，将细胞加入预包被了IFN-γ单抗的96孔ELISPOT板孔中，再取1μl肽库用10μl RPMI-1640完全培养基稀释后加入细胞悬液中。37℃、5％CO2细胞培养孵箱培养20小时。其后按照试剂盒说明书的操作进行抗体标记和底物显色(深圳达科为生物技术公司)。用斑点计数仪记数斑点数量。 

结果：ICS的方法未能有效检测到Hp感染阳性者PBMC中HpaA特异性CD4+T细胞，与DMSO对照组和肽库刺激组比较没有显著差别(图1A)。而ELISPOT方法检测发现：在20万个CD4+T细胞中仅含有一个抗原特异性T细胞，频率极低(图1B)。以上结果说明：Hp感染阳性者PBMC中HpaA特异性CD4+T细胞频率极低，难以进行免疫显性表位的直接离体水平(ex vivo)筛选，需要通过体外培养对抗原特异性T细胞进行有效扩增。 

实施例3：Hp感染者外周血中抗原特异性CD4+T细胞的体外有效扩增 

3.1体外扩增抗原特异性T细胞方法 

调整Hp感染阳性患者PBMC细胞浓度至2.5×10⁶/ml，接种于48孔细胞培养板(1ml/孔)，加入适量HpaA抗原，混匀后在37℃、5％CO₂条件下培养。在第五天时加入低剂量的重组人IL-2(rhIL-2)(终浓度为25U/ml)。在第8天的时候培养基开始变黄，进行半量换液(换入的培养液含有25U/ml的rhIL-2，适时进行细胞分孔传代。 

3.2体外抗原特异性T细胞的检测 

经过在体外水平对抗原特异性CD4+T细胞的有效扩增，其频率已经达到了ICS的检测范围，采用ICS的方法对抗原特异性CD4+T细胞频率进行检测。收集培养的细胞，离心去除含有rhIL-2的培养基(rIL-2会刺激细胞非特异性应答)，加入新鲜的不含rhIL-2的RPMI-1640完全培养基重悬细胞至1×10⁶/ml，在96孔U型板中加入100微升RPMI-1640完全培养基，然后加入刺激肽段1μl(终浓度10μM)及Golgistop 0.15μl，再加入细胞悬液100μl，37℃、5％CO₂细胞培养孵箱培养5个小时后离心收集细胞，按照1.3所述方法进行ICS及流式检测。 

3.3最佳抗原浓度 

为了优化Hp感染者外周血中抗原特异性CD4+T细胞的体外扩增条件，设立了不同的抗原刺激浓度组。调整Hp感染阳性者PBMC浓度至5×10⁶/ml。96孔平底培养板，加入100μl RPMI-1640完全培养基，然后加入合适体积的抗原HpaA蛋白，再加入100μl细胞悬液，使刺激体系中HpaA蛋白的终浓度分别为0.05μM，0.1μM，0.2μM，0.5μM，1μM。混匀后按照前面2.1所述方法进行培养。培养到第13天时用ICS检测抗原特异性T细胞的增值情况。同时，为了证明方法的特异性，用相同方法对Hp感染阴性者PBMC也进行了扩增。 

3.4收获细胞的最佳时间 

为了在抗原特异性T细胞频率最大的时候收获细胞，在不同培养时间点对抗原特异性T细胞频率进行了动态观察。调整Hp感染阳性者PBMC至5×10⁶/ml，48孔板中加入0.5mlRPMI-1640完全培养基，再加入最佳刺激浓度的HpaA抗原，与0.5ml细胞悬液混匀，此后按照前面2.1所述方法进行培养。培养到第9天的时候开始用ICS检测抗原特异性T细胞的增殖情况，在其后的一周多时间内对抗原特异性T细胞的增殖情况进行动态检测。同时，为了证明方法的特异性，用相同方法对Hp感染阴性者PBMC也进行了扩增。 

结果：在进行特异性CD4+T细胞体外扩增培养前，Hp感染阳性者PBMC中HpaA特异性CD4+T淋巴细胞的频率小于0.01％(图1A)，经过该方法扩增之后，其频率可达到3％(图2A)。摸索得到抗原的最佳刺激浓度是0.2μM，当无抗原刺激时检测不到抗原特异性T细胞信号，随着抗原浓度增大，特异性 信号增强，到0.2μM浓度时达到峰值，再增大抗原浓度却导致了特异性信号的变弱，说明浓度太高或者太低均不能很好的刺激HpaA特异性CD4+T淋巴细胞的有效扩增(图2B)。在培养时间的优化实验中，结果显示：特异性CD4+T细胞的最佳收获时间段是第13-16天，此时HpaA特异性CD4+T淋巴细胞的频率处于峰值水平，13天之前的信号强度不足，且细胞数量也有限，16天以后，虽然细胞数量较大，但是信号较弱，细胞活性也下降了(图2C)。另外，所有ICS检测前的DMSO对照刺激组均无明显信号，且所有的HpaA特异性CD4+T淋巴细胞只能从Hp感染阳性患者的PBMC中扩增出来，而不能从Hp感染阴性者PBMC中扩增出来，证明了所该方法扩增出来的HpaA特异性CD4+T淋巴细胞信号是真实可信的(图2B、2C)。 

实施例4：利用抗原特异性CD4+T细胞和步移重叠合成肽对免疫显性表位进行筛选 

4.1免疫显性18个氨基酸短肽的筛选 

按照实施例3中描述的最佳抗原刺激浓度和培养方法刺激培养HpaA特异性T淋巴细胞，肽库刺激检测其特异性细胞应答频率达到2.5％。利用实施例1中合成的37条18个氨基酸短肽分别刺激这些细胞，再按照实施例2.2中描述的ICS方法检测各条短肽刺激所能产生的特异性T细胞频率。 

4.2针对免疫显性18个氨基酸短肽步移重叠合成13个氨基酸短肽 

针对4.1筛选得到的免疫显性18个氨基酸短肽，再采用步移法重叠合成13个氨基酸的短肽，每次步移两个氨基酸(由上海吉尔生化公司合成)，短肽纯度均大于90％。合成肽信息见表2。将合成的肽段用二甲亚砜(DMSO)溶解成5mM的储存浓度，分装后-70℃保存。临用时用完全1640稀释成1mM，使用终浓度为10μM。 

表2 步移重叠合成免疫显性18-mer肽的13-mer肽基本信息 

(依次对应序列表中的SEQ ID No：40-44) 

4.3免疫显性18个氨基酸短肽特异性T淋巴细胞的体外扩增 

调整Hp感染阳性者PBMC细胞浓度至5×10⁶/ml，48孔板中加入0.5mlRPMI-1640完全培养基，再加入5mM免疫显性18个氨基酸短肽1μl(终浓度5μM)，与0.5ml细胞悬液混匀，按照前面2.1所述方法进行培养。 

4.5免疫显性13个氨基酸短肽的筛选 

免疫显性18个氨基酸短肽特异性T淋巴细胞体外扩增培养到第13天，用3.2中步移重叠合成的13个氨基酸短肽，按照实施例1.2中描述的ICS方法检测各条短肽刺激所能产生的特异性T细胞频率。 

结果：通过免疫显性18个氨基酸短肽的筛选得到一个免疫显性肽段以及两个亚显性肽段，如图3A，第28条肽段(P28，H_190-207)能够刺激出和肽库相当的信号，是一段免疫显性肽；而第6(P6，H_58-75)和20(P20，H_142-159)条肽段虽然不能刺激出于肽库相当的信号，但其信号明显高出其他肽段，为两段亚显性肽段。针对显性P28(H_190-207)合成的5条13个氨基酸短肽经过筛选，只有P28-3(H_192-204)能够刺激出与P28(H_190-207)相当的信号(图3B)。故HpaA的免疫显性表位即为P28-3(H_192-204)。 

实施例5：利用HLA-II类分子抗体阻断实验初步确定表位HLA限制性 

5.1免疫显性13个氨基酸短肽P28-3(H192-204)特异性T淋巴细胞的体外扩增 

调整幽门螺杆菌感染阳性者PBMC浓度至5×10⁶/mL，48孔板中加入0.5mLRPMI-1640完全培养基，再加入1μL免疫显性13个氨基酸短肽P28-3(H192-204)(终浓度5μM)，与0.5mL细胞悬液混匀，按照前面2.1所述方法进行培养。 

5.2利用HLA-II类分子抗体阻断实验初步确定免疫显性表位P28-3(H192-204)的HLA限制性 

收集5.1中培养13天的P28-3(H192-204)特异性T淋巴细胞，离心去除含有rhIL-2的培养基，以新鲜的不含rhIL-2的RPMI-1640完全培养基重悬细胞至1×10⁶/mL，在96孔U型板中加入细胞悬液100μL，分成4孔，其中三孔再分别加入HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ的三种单克隆抗体(抗-DR(L243)，抗-DP(B7/21)，抗-DQ(SPV-L3))各10μL；另外一孔加入不含rhIL-2的RPMI-1640完全培养基10μL，混匀后37℃、5％CO2细胞培养孵箱培养30分钟后，每孔再加入100μL含有1μL肽段P28-3(H192-204)(终浓度10μM)和0.15μLGolgiStop的RPMI-1640完全培养基，混匀后37℃、5％CO2细胞培养孵箱培养5个小时，随后收集细胞进行ICS和流式检测。 

结果：免疫显性表位刺激表位特异性T细胞的应答能够被HLA-DR的单克隆抗体完全阻断，而不能被HLA-DP和HLA-DQ的单克隆抗体所阻断(图4)，证明该免疫显性表位是HLA-DR限制性的。但其HLA-DR的亚型仍需进一步鉴定。 

实施例6：利用不同HLA-II类分子亚型的B淋巴母细胞系对表位的递呈实验确定表位HLA限制性的具体亚型 

6.1EBV转化的B淋巴细胞系(BLCL)的制备 

以接种密度10⁶/mL(50mL培养瓶装5mL)培养含有EBV的B95-8细胞，培养2-3天后，离心弃上清，用新鲜培养基将细胞以1∶4的比例传代，培养5-7天后收获细胞，用50mL离心管离心，吸取15mL所得上清至另一无菌离心管，用剩下的5mL上清重悬细胞沉淀，在-70℃和37℃反复冻融3次以破碎细胞和释放EBV，使之与原来的15mL上清混合，以2000rpm的速度离心20分钟后，取上清，用0.22μm滤器过滤，分装至1mL/冻存管，-70℃保存。该上清中含有EBV，即得EBV病毒液。复苏一管幽门螺杆菌感染阳性者PBMC，调整细胞浓度至(1-2)×10⁶/mL，24孔板中加入1mL细胞悬液，再加入上述EBV病毒液，同时加入环孢素A至终浓度1μg/mL。37℃、5％CO₂细胞培养孵箱培养细胞，注意适时换液和分孔。2个月后，BLCL建立完毕，用液氮冻存该BLCL细 胞。 

6.2PCR-SBT技术分析患者HLA-II类分子亚型 

取建立好的BLCL，用QIAGEN公司DNA抽提试剂盒抽提核酸DNA，按照试剂盒说明书进行操作。其后将核酸样本送往深圳华大基因公司，该公司用PCR扩增测序分型(PCR-SBT)技术对样本的HLA-II类分子亚型进行分析。本发明中所使用的相关BLCL样本的HLA-II类分子基因亚型为见表3： 

表3 患者HLA-II类分子分型信息 

6.3BLCL递呈实验确定免疫显性表位P28-3(H192-204)的HLA限制性 

由实施例4可知，免疫显性表位P28-3(H_192-204)是HLA-DR限制性的，而该个体的的HLA-DR是杂合子：HLA-DRB1*0406和HLA-DRB1*1602，因此并不清楚关于该表位的具体限制性亚型。现选择与该个体HLA-DR的亚型相同和不同的BLCL，即5248(DR04-/DR16+)、5250(DR04+/DR16-)和5751(DR04-/DR16-)作为抗原递呈细胞(APC)进行亚型鉴定。用免疫显性表位P28-3(H_192-204)(浓度10mM分别负载上述BLCL 1h，用RPMI-1640不完全培养基洗涤细胞3遍以完全去除未结合到HLA上的游离肽段。其后，在GolgiStop存在的体系中，用这些负载了P28-3(H_192-204)肽段的APC与P28-3(H_192-204)特异性T淋巴细胞进行混合淋巴细胞反应。其后用ICS的方法检测P28-3(H_192-204)特异性T淋巴细胞的应答频率。 

结果：如图5，只有用含有HLA-DRB1*0406等位基因的BLCL负载肽段P28-3(H_192-204)后才能刺激P28-3(H_192-204)特异性T淋巴细胞产生应答。不负载任何肽段或者负载一个非P28-3(H_192-204)的肽段H_88-100均不能刺激P28-3(H_192-204)特异性T淋巴细胞产生应答。且HLA-DRB1*1602基因型的BLCL(5248)在负载了肽段P28-3(H_192-204)后也不能刺激P28-3(H_192-204)特异性T淋巴细胞产生应答。这证明免疫显性肽P28-3(H_192-204)的HLA限制性是HLA-DRB1*0406。 

实施例7：验证该免疫显性表位能够被抗原递呈细胞自然加工和递呈 

7.1树突状细胞的制备 

复苏一管5750患者PBMC，用免疫磁珠阳性选择的方法(Miltenyi Biotec公司的试剂盒)分离PBMC中CD14+单核细胞，操作按照试剂盒说明书进行。分离后的CD14+单核细胞用APC标记的抗人CD14单抗染色，流式细胞计数鉴定纯度大于95％。用RPMI-1640完全培养基重悬细胞至密度5×10⁵/mL，加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和重组人白介素4(IL-4)，使其终浓度均为20ng/mL。24孔板中加入2mL细胞悬液，37℃、5％CO₂细胞培养孵箱培养。培养到第6天收集细胞，负载抗原。 

7.2幽门螺杆菌全蛋白超声上清的制备 

混配11637菌株接种到脑心浸液血琼脂平板，通过抽气换气建立微需氧环境(10％CO₂、5％O₂和85％N₂)37℃培养2天，从平板上刮取菌苔，混悬于无菌生理盐水，以麦氏标准比浊管第一管为标准配成浓度为3×10⁸个/mL的菌悬液，迅速取2mL接种于200mL无菌幽门螺杆菌培养肉汤，微需氧环境及37℃震荡(120转/分钟)培养，培养24小时后，取出培养液，沉淀细菌，用无菌PBS洗涤3遍后用无菌PBS重悬细菌，超声破菌2个循环(功率200W，破碎时间30s，间歇30s)。4℃，10000g离心20分钟去除未破碎的细菌和大块碎片。所得到的上清中包含幽门螺杆菌的细胞膜和胞质成分蛋白。用BCA法测量蛋白浓度，分装-20℃保存。 

7.3抗原递呈细胞的抗原负载及表型分析 

树突状细胞培养到第六天，收获细胞用含GM-CSF和IL-4(20ng/mL)的新鲜RPMI-1640培养基调整细胞细胞密度至1×10⁵个/mL，96孔U型板中加入100μL上述培养基，再加入合适体积幽门螺杆菌全蛋白超声上清或者重组表达的HpaA蛋白，使蛋白终浓度为50μg/mL。再加入细胞悬液100μL。37℃、5％CO₂细胞培养孵箱培养过夜。在负载抗原之前和之后取少许细胞进行表型分析：用PE标记的抗人CD86单抗、APC标记的抗人HLA-DR单抗以及FITC标记的抗人CD80单抗进行染色和流式分析。除了树突状细胞，BLCL也被用作抗原递呈细胞以检验该免疫显性表位是否能被其自然加工和递呈。因此，BLCL也按照DC负载抗原的方法负载了抗原。 

7.4混合淋巴细胞反应 

离心抗原递呈细胞去除没有被负载的游离蛋白抗原，用RPMI-1640不完全培养基洗涤2遍，用100μL RPMI-1640完全培养基重悬细胞，以0.15μL/孔加入GolgiStop，再加入P28-3(H_192-204)特异性T淋巴细胞100μL，37℃、5％CO₂细胞培养孵箱培养5小时后按照1.3所描述的方法染色及流式检测。 

结果：如图6，负载了HpaA蛋白的DC5750能够刺激P28-3(H_192-204)特异性T淋巴细胞产生强烈的免疫应答，负载幽门螺杆菌全蛋白超声上清的DC5750刺激的应答虽不如负载HpaA的强烈，但明显强于没负载任何抗原的DC5750刺激的应答。这证明P28-3(H_192-204)是能够通过树突状细胞自然加工递呈产生的。以BLCL作为抗原递呈细胞同样证明了这一点。且这种自然加工递呈是受HLA-DRB1*0406限制性的，因为含有HLA-DRB1*0406等位基因的DC5250能够自然加工递呈该表位，而不含有HLA-DRB1*0406等位基因的DC5751却不能够自然加工递呈该表位。这进一步说明了免疫显性表位P28-3(H_192-204)被自然加工递呈的特异性。 

实施例8：系统方法与生物信息学软件预测法筛选免疫显性表位的比较 

8.1生物信息学软件预测法筛选HpaA表位 

首先，按照实施例1.1获得HpaA蛋白序列，剔除信号肽部分H1-27，将H28-260序列输入IEDB Analysis Resource对MHC-II类T细胞表位进行预测。计算方法采用通用算法(consensus method)，用通用百分率(Consensus Percentile Rank)来表示肽段与MHC分子的亲和力大小，值越小表示亲和力越大。越有可能成为免疫显性表位。 

IEDB Analysis Resource预测网址为： 

http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html

8.2系统方法与生物信息学软件预测法筛选免疫显性表位的比较 

以软件预测的通用百分率值为纵坐标，37条15-mer短肽为横坐标做直方图；在以系统方法37条18-mer短肽刺激HpaA抗原特异性T细胞的应答频率为纵坐标，37条短肽为横坐标做直方图。两图叠加在一起对两种方法进行比较。软件 预测的通用百分率越小，肽段与MHC分子的亲和力越大，越可能是免疫显性表位；而系统法肽段刺激HpaA抗原特异性T细胞的应答频率越高表示该表位越显性。 

结果：如图7，HpaA58-72和HpaA190-204的通用百分率值相对偏低，系统方法该两段短肽也能刺激HpaA抗原特异性T细胞产生明显的应答。这说明表位预测软件能预测出来的表位通过系统方法能够证实。但是，表位预测的方法并不能区分这两段短肽那个更为显性。因为他们的通用百分率值没有明显区别(HpaA58-72：12.99；HpaA190-204：11.1)。另外，HpaA64-78的通用百分率值明显低于HpaA58-72，但是经系统方法证实HpaA64-78刺激HpaA抗原特异性T细胞产生的应答并不比HpaA58-72强烈(HpaA58-72：12.99；HpaA64-78：6.47)。更有甚者，HpaA76-90的通用百分率值在37条短肽中是最低的(3.57)，却根本不能刺激HpaA抗原特异性T细胞产生明显的应答。相反，HpaA142-159的通用百分率值较高(29.82)却被证实为一个亚显性表位。 

实施例9：免疫显性表位的进一步验证 

按照相同的方法，利用另外一个含有HLA-DRB1*0406等位基因的幽门螺杆菌感染阳性者(5250)的PBMC对HpaA的免疫显性表位进行系统筛选。按照1.3方法建立了5250来源的HpaA特异性T细胞并按照实施例1.4方法检测其免疫显性肽段P28-3(H192-204)、亚显性肽段P6(H58-75)和P20(H142-159)以及阴性对照肽段P11(H88-105)的应答反应。 

结果：如图8，利用5250来源的HpaA特异性T细胞验证得到的免疫显性肽段仍然是P28(H190-207)。这进一步说明了P28(H190-207)是一个免疫显性表位。