植物转基因的可视化跟踪表达系统及其应用

摘要

本发明公开了植物转基因的可视化跟踪表达系统及其应用。本发明所提供的可视化跟踪表达系统为含有可视化标记基因表达盒的植物表达载体，所述可视化标记基因表达盒由花青素合成途径中的转录因子bi基因的表达盒和花青素合成途径中的转录因子cl基因的表达盒组成。本发明将颜色调控基因应用到植物遗传转化操作上，有效减轻了转化后的筛选工作，根据该基因在植株上的表现，可有选择的保留有价值的转化材料，从而大大节省筛选时间和研究经费，且实验结果的准确度和可信度大大提高，这为开展转化后分析工作奠定了很好的基础。另外，本发明利用颜色基因的瞬时表达，可更为直观地对转化效果进行可视化分析，从而避免各种影响转化因素的发生。

说明书

技术领域

本发明涉及植物转基因的可视化跟踪表达系统及其应用，特别涉及一种在植物转 基因过程中，将花青素合成途径中的两个转录因子bi和cl基因作为可视化标记基因的 植物表达载体。

背景技术

在众多的植物遗传转化报告基因中，花青素代谢调节基因是最方便的一种。将其 导入植物细胞之后，花青素经过表达后会在液泡中积累，使细胞变成红色或紫色，用 一般的解剖镜甚至肉眼即可观测，无需对植物的检测部位进行特殊处理或选择特殊仪 器进行观察，更不用进行组织化学测试而杀死植物组织。因此，将这类基因应用到植 物遗传转化的操作上，可以有效地减轻转化后筛选的复杂工作，目的性强，实验结果 的准确度和可信度都可以大为提高，为开展转化后的分析工作奠定了很好的基础。另 外在基因功能研究方面，根据该基因在植株上的表现，能够直观地反映出尤其是研究 基因共抑制、转基因沉默等转基因植株可能出现的重大问题。

已有的研究表明，不同植物中的花青素生物合成受2类基因的共同控制，一类是结 构基因，其编码生物合成途径中所需的酶；另一类是调节基因，其编码的转录因子调 控结构基因的时空表达(Holton TA，Cornish EC.Genetics and biochemistry of  anthocyanin biosynthesis.Plant Cell，1995，7(7)：1071-1083)。早在1992年，Gof等(Goff SA， Cone KC，Chandler VL.Functional analysis of the transcriptional activator encoded by the  maize B gene：evidence for a direct functional interaction between two classes of regulatory  proteins.Genes Dev.1992，6：864-875)证实了玉米中花青素生物合成途径转录因子bHLH 蛋白R与MYB蛋白Cl通过N末端相互作用调控植物组织中色素的产生；Cl基因要在b基 因的共激活下才能调节色素在糊粉层中的合成，而b位点的基因则很少影响糊粉层和幼 苗的颜色，但可调节成熟植物组织特别是叶鞘和苞叶的广谱颜色(Radicella J P，Turks D， Chandler VL.Cloning and nucle-otide sequence of a cDNA encoding B-Peru，a regulatory  protein of the anthocyanin pathway from maize.Plant MolBiol.1991，17：127-130)。Han等 (Han Y J，Kim Y M，Lee J Y，et al.Production of purple-colored creeping bentgrass using  maize transcription factor genes Pl and Lc through Agrobacterium-mediated transformation. Plant Cell Rep.2009，28(3)：397-406)在利用玉米的的花青素合成途径的转录因子调控 基因Pl和Lc分别或共同转化匍匐翦股颖也得到了类似的结果，这两个基因单独调控时， 转基因植株会在不同的部位不同程度显示紫色，Lc基因的调控作用比Pl基因更强一些， 但在共同作用的情况下，会使整个转基因植株呈现紫色。Doshi等(Doshi K M，Eudes F， Laroche A，et al.Transient embryo-specific expression of anthocyanin in wheat.In Vitro  Cell.Dev.Biol.Plant，2006，42：432-438)利用来自玉米花青素的转录调节基因Cl和 B-peru基因共同在大麦不同的组织特异性启动子驱动下调控花青素的合成，通过颜色 直观的反应出这些启动子在小麦幼胚等器官的组织特异性和驱动能力。因此，通过综 合考虑并恰当运用结构基因和调节基因，选用具有器官特异性的启动子，为植物转基 因研究以及基因功能研究提供了直观的可视化研究证据，另外，还能够为实现植物体 彩色化开辟了新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以在植物转基因过程中作为可视化标记的可视化跟 踪表达系统，具体为一种植物表达载体。

本发明所提供的植物表达载体包含可视化标记基因的表达盒。所述可视化标记基 因的表达盒可为在植物转基因中任何被用作可视化标记基因的表达盒，在本发明的实 施例中，所述可视化标记基因的表达盒具体由花青素合成途径中的转录因子bi基因的 表达盒和花青素合成途径中的转录因子cl基因的表达盒所组成。其表达产物花青素可 作为植物转基因成功与否的可视化参考标记。所述花青素合成途径中的转录因子bi基 因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述花青素合成途径中的转录 因子cl基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

所述花青素合成途径中的转录因子bi基因的编码序列如序列表中序列4的第3137 位到第4796位所示；所述花青素合成途径中的转录因子cl基因的编码序列如序列表 中序列4的第1013位到第1834位所示。

所述花青素合成途径中的转录因子bi基因的表达盒是一个含有所述bi基因及bi 基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段：启动子、被该启 动子启动的bi基因和终止子；所述花青素合成途径中的转录因子cl基因的表达盒是一 个含有所述cl基因及cl基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下 片段：启动子、被该启动子启动的cl基因和终止子。所述花青素合成途径中的转录因 子bi基因的表达盒和所述花青素合成途径中的转录因子cl基因的表达盒的启动子均可 为任何可以启动基因在植物中转录的启动子，如常用的35s启动子。

所述植物表达载体还包含筛选转基因植物所需标记基因表达盒。所述筛选转基因 植物所需标记基因表达盒为任何在植物转基因中被用作筛选转基因植物所需的标记基 因表达盒。在本发明的实施例中，所述筛选转基因植物所需标记基因表达盒具体为 EPSP基因表达盒。

所述EPSP基因表达盒是一个含有EPSP基因及EPSP基因表达所需元件的DNA 分子，从上游至下游依次含有如下片段：启动子、由该启动子启动转录的所述EPSP 基因的编码序列以及终止子(转录终止序列)；所述EPSP基因编码的蛋白质的氨基酸 序列如序列表中序列3所示；所述EPSP基因的编码序列如序列表中序列5的第1029 位到第2549位所示。所述筛选转基因植物所需标记基因的表达盒中的启动子可为任何 可以启动基因在植物中转录的启动子，如常用的35s启动子。

所述的植物表达载体为pBAC9008，pBAC9008按照如下方法构建：

1)在pGreen载体的第1648位和第2635位处分别插入如序列表中序列7所示的 loxP位点得到重组载体pBAC814，pBAC814中的两个loxP位点方向相同；2)在 pBAC814的多克隆位点前的Nde I酶切位点处插入如序列表中序列5所示的所述 EPSP基因的表达盒得到重组载体pBAC823；3)将上述pBAC823载体的用DraIII酶 切，加入如序列表中序列8所示的AgeI/PacI linker，之后将如序列表中序列4所示的 所述花青素合成途径中转录因子bi基因和转录因子cl基因的表达框插入AgeI和PacI 位点之间，得到的载体命名为pBAC9008。

所述花青素基因合成途径中的转录因子bi基因的表达盒和所述花青素基因合成 途径中转录因子cl基因的表达盒的序列如序列表中序列4所示，其中，第1位到第2112 位为所述cl表达框的基因序列，第2125位到第5074位为所述bi表达框的序列，第 1013位到第1834位为cl基因的编码序列，第3137位到第4796位为bi的编码序列。

所述EPSP基因的表达盒的序列如序列表中序列5所示，其中，第1位到第434 位为所述35S启动子的核苷酸序列，第461位到第994位为所述玉米Adh1基因的 Intron1的核苷酸序列，第1029位到第2549位为所述EPSP基因的编码序列；所述 AgeI/PacI linker的核苷酸序列如序列表中序列8所示。

所述植物表达载体在植物转基因中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供利用所述植物表达载体培育转基因植物的方法，该方 法包括如下步骤：利用所述植物表达载体构建表达外源目的DNA的重组植物表达载 体，将所述重组植物表达载体导入植物细胞中，得到表达所述花青素合成途径中转录 因子bi和cl基因的紫色细胞，由所述紫色细胞得到的植株即为候选的转基因植物；所 述植物细胞本身的颜色与紫色通过肉眼观察能相互区分。

所述可视化标记基因的表达盒和所述外源目的DNA可通过农杆菌转化法导入双 子叶植物，通过DNA直接转移法转入双子叶植物和/或单子叶植物。所述DNA的直 接转移法包括电击法(电穿孔法)、基因枪法(微弹轰击法)、激光微束穿孔法、显微 注射法、脂质体介导法、多聚物介导法，花粉管通导法等。在本发明的实施例中采用 的具体方法为基因枪法。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物，在本发明的实施例 中具体为单子叶植物小麦和玉米。

含有所述的植物表达载体的重组原核细胞或重组真菌也属于本发明的保护范围。

本发明以花青素合成途径中的两个转录因子bi和cl基因作为可视化标记基因， 运用到植物转基因中，巧妙的将颜色调控基因应用到植物遗传转化的操作上，有效地 减轻转化后筛选的复杂工作，目的性强，根据该基因在植株上的表现，有选择的保留 有价值的转化材料，会大大节省筛选时间和研究经费，最重要的，实验结果的准确度 和可信度的大大提高为开展转化后的分析工作奠定了很好的基础。另外，本发明利用 颜色基因的瞬时表达，可以更为直观地对转化效果进行可视化的分析，从而避免了各 种影响转化因素的发生，如基因枪法转化中金粉制备不好，基因枪轰击效果差，轰击 范围和轰击位置不准确等。

附图说明

图1为花青素基因表达载体pBAC9008的质粒图谱。

图2为pBAC823的质粒图谱。

图3为花青素基因瞬时表达。A、小麦叶片；B、小麦幼胚的愈伤组织。

图4为转基因玉米植株的分化及田间移栽。A、诱导愈伤组织；B、转化再生植 株；C、田间移栽；D、转化植株结实种子。

图5为pBAC9008转基因植株的PCR检测。1：2K plus marker；2：阴性对照(水)； 3：非转基因植株；5：质粒pBAC9008；6～18：转化植株。

图6为T₁代pBAC9008转基因植株田间表型。A、pBAC9008转基因植株T₁代分离 后表现为正常的植株；B、pBAC9008转基因植株T₁代分离后表现为紫色植株；C、D、E 分别为pBAC9008转基因紫色植株的雄穗、叶片和苞叶。

图7为T₁代pBAC9008转基因植株的PCR检测。1：阴性对照(水)；2：非转基因 植株；3：质粒pBAC9008；4～6：紫色转基因植株；7～8：正常颜色转基因植株。

图8为pBAC830的质粒图谱。

图9为pBAC9009的质粒图谱。

图10为pBAC9009转基因植株的PCR检测。1：2K plus marker；2～17：转化植 株；18：阴性对照(水)；19：非转基因植株；20：质粒pBAC9009。

图11为转基因玉米中Kan基因删除示意图。其中，A代表转目的基因玉米(父 本)；B代表转重组酶基因玉米(母本)；C代表转目的基因玉米(删除抗生素基因)； D代表转重组酶基因玉米；E和F均代表转目的基因玉米/转重组酶基因玉米的杂合体。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

玉米优良自交系501(杨东歌，杨凤萍，陈绪清，张立全，张晓东.外源脱水应答 转录因子CBF4基因转化玉米的获得.作物学报，2009，35(10)：1759-1763)。

T4DNA连接酶等购自Promega公司；Taq酶、氨苄青霉素、IPTG、X-gal等试剂 均购自大连宝生物工程有限公司；DNA回收试剂盒购自天根生化科技公司；限制性内 切酶购自Promega、New England Biolabs；普通生化试剂购自Sigma公司、Promega 公司或国产。基因枪型号：PDS-1000/He(BioRad)。

下面结合具体实施例，详细阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围

实施例1、玉米花青素调控基因的合成及植物表达载体的构建

考虑到基因枪转化中抗生素安全的问题，为了便于后续实验中抗生素基因的删除， 将pGreen载体进行改造，在Kan基因表达框的两侧分别插入两个同向的loxP位点， 经测序鉴定正确的载体命名为pBAC814。之后在pBAC814载体多克隆位点前的Nde I酶切位点处插入CaMV 35S启动子和玉米Adh1基因的Intron1驱动的EPSP基因 (EPSP基因表达盒)，所述EPSP基因作为筛选转基因植物的选择标记基因。经测序 鉴定正确的载体命名为pBAC823。

将上述pBAC823载体用DraIII酶切，加入AgeI/PacI linker，之后将花青素合成途 径中两个转录因子bi和cl的表达框(序列4)插入AgeI和PacI位点之间，得到的载 体命名为pBAC9008。pBAC9008载体的质粒图谱如图1所示。所得pBAC9008载体 即为用于插入外源目的DNA的含有玉米花青素调控基因的植物表达载体。

其中，上述pBAC823载体的构建步骤具体如下所述：以pGreen基础框架载体(如 序列6所示)为模板，利用PF1648(序列9)/PR1648(序列11)引物对进行PCR扩 增，产物自连，引入一个loxP位点，转化E.coli JM110。通过序列测定确定loxP位点 是否正确插入pGreen载体中。将鉴定正确的载体命名为pGreen-loxp(在pGreen的1648 位点处插入如序列表中序列7所示的loxP位点得到的重组载体)，以pGreen-loxp载体 为模板，以PF2635(序列10)/PR2635(序列12)引物对进行第二次PCR，步骤同上， 引入第二个loxP位点。测序正确的载体命名为pBAC814(在pGreen-loxp中对应pGreen 的2635位点处插入loxP位点得到的重组载体，pBAC814中的两个loxP位点方向相 同)。在pBAC814多克隆位点前的Nde I酶切位点处插入CaMV 35S启动子和玉米 Adh1基因的Intron1驱动的EPSP基因(EPSP基因表达盒)，所述EPSP基因作为筛选 转基因植物的选择标记基因。经测序鉴定正确的载体命名为pBAC823(pBAC823的 质粒图谱如图2所示)。pBAC823中CaMV 35S启动子和玉米Adh1基因的Intron1驱 动的EPSP基因(EPSP基因表达盒)的序列如序列表中序列5所示，其中第1位到第 434位为所述35S启动子的核苷酸序列，第461位到第994位为所述玉米Adh1基因的 Intron1的核苷酸序列，第1029位到第2549位为所述EPSP基因的编码序列。

实施例2、花青素基因的瞬时表达

取小麦叶片和开花后15-17天的小麦保丰104(王军卫，杨凤萍，张晓东等，Induced  expression of DREB transcriptional factor and study on its physiological effects of drought  tolerance in transgenic wheat.Acta Genetica Sinica，2006，33(5)：468～476)幼胚， 去除生长顶端部位后将盾片倒置接种在MS固体培养基上，用纯化好的浓度为1μg μL^-1的pBAC9008载体，按张晓东等(Zhang Xiaodong，Liang Rongqi，Chen Xvqing，Yang  Fengping，Zhang Liquan，Transgene inheritance and quality improvement by expressing  novel HMW glutenin subunit(HMW-GS)genes in winter wheat.Chinese Science Bulletin， 2003，48(8)：771-776.)所述方法进行基因枪微弹的制备，PDS-1000/He型基因枪轰击 盾片和叶片，48h后在莱卡体式显微镜下观察花青素基因在不同组织的瞬时表达情况。

结果显示，基因枪轰击过的小麦幼胚愈伤组织和叶片在26℃培养间经过48小时 培养后，在体式显微镜下可以观察到，在两个玉米花青素合成调控基因共同作用下， 金粉轰击到的细胞均呈现出紫颜色，如图3所示。这一结果说明这两个基因的共同作 用可以明确指示出金粉轰击的效果和具体的部位。因此，利用颜色基因的瞬时表达， 可以更为直观地对基因枪转化效果进行可视化的分析，从而避免了各种影响基因枪转 化因素的发生，如金粉制备不好，基因枪轰击效果差，轰击范围和轰击位置不准确等。

实施例3、玉米基因枪转化

诱导培养基：N6基本培养基+10mg L^-1 AgNO₃+100mg L^-1肌醇+2mg L^-1 2，4-D+30 g L^-1蔗糖+7g L^-1琼脂。

分化培养基：N6基本培养基+0.5mg L^-1 AgNO₃+100mg L^-1肌醇+1.5mg L^-1 KT+30 g L^-1蔗糖+7g L^-1琼脂+0.5mg L^-1草甘膦。

取授粉后12d左右的玉米优良自交系501的果穗，经75％乙醇表面消毒后挑取其 幼胚接种到诱导培养基上，暗培养3～5d后诱导出胚性愈伤组织。纯化好的pBAC9008 载体调整浓度为1μg μL^-1，按张晓东等(Zhang Xiaodong，Liang Rongqi，Chen Xvqing， Yang Fengping，Zhang Liquan，Transgene inheritance and quality improvement by  expressing novel HMW glutenin subunit(HMW-GS)genes in winter wheat.Chinese  Science Bulletin，2003，48(8)：771-776.)所述方法进行基因枪微弹的制备，PDS-1000/He 型基因枪轰击胚性愈伤组织，5d后将愈伤组织转移到含有草甘膦的筛选培养基(诱导 培养基中加入1mg L^-1草甘膦)上筛选20d左右。然后选取生长正常的愈伤组织转移 到分化培养基上分化，分化的幼苗进行壮苗后移栽到海南。

结果显示，基因枪轰击后的幼胚经5mg/L除草剂草甘膦筛选后进行分化，将获得 的转基因植株移栽到海南，共得到转化植株29株，有23株结实，其中7株的种子有 花青素基因的表达。图4为玉米幼胚转化并获得转基因植株的整个过程。

实施例4、转基因玉米植株的分子检测

用改良CTAB法提取转基因玉米嫩叶(紫色)的基因组DNA，根据35s启动子 序列设计上游引物为TCCACTGACGTAAGGGAT(序列4的2466-2483位)，根据an-B 基因序列设计下游引物为TGGACCAGAAGAGGGCAT(序列4的3240-3257位)，扩 增的目的片段大小为792bp。非转基因植株为阴性对照，pBAC9008为阳性对照，水为 空白对照，反应体系为：ddH₂O 17.3μL，DNA 1μL(1μg μL^-1)，10×PCR Reaction Buffer 2.5μL，dNTPs(2.5mmol L^-1)2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，Taq DNA聚合酶 (5U μL^-1)0.2μL。反应程序如下：95℃变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72 ℃延伸50s，共35个循环；最后72℃延伸10min。反应产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检 测。

结果如图5所示，所获得的部分转化植株与阳性对照质粒(泳道5)都能扩增出 了792bp的bi基因表达盒的特异片段，阴性对照(无模板DNA，泳道2)和非转化植 株(泳道3)没有扩增带，根据这一结果，我们初步判定外源的an-C和an-B基因成 功转入玉米中。另外，作为可视化标记的花青素直接反映在植株及种子上的紫色进一 步说明外源的an-C和an-B基因被转入了玉米植株中。

另外，T₁代pBAC9008的转基因植株在田间种植后表现出了后代分离的现象，部 分植株有不同程度的花青素表达，表现为紫色植株(图6B)或是在不同部位如雄穗、 叶片和玉米苞叶表现为紫色(图6C、D、E)，部分植株和非转基因植株一致，表现为 正常的植株颜色。分别提取了紫色和正常颜色的转化植株的总DNA，根据所设计an-B 基因的特异引物，进行PCR检测。结果如图7所示，所获得紫色转化植株与阳性对照 质粒(泳道5)都能扩增出了含有目标基因的特异片段，阴性对照(无模板DNA，泳 道2)和正常表现的转化植株(泳道6～8)没有扩增带，由此可以看出，外源an-C和 an-B基因在T₁代出现了分离，PCR检测与花青素基因表达一致。这一结果揭示：利 用颜色基因可以作为外源基因在转基因植株染色体上的存在以及表达部位和表达量等 外在特征的参考。

实施例5、用植物表达载体pBAC9008构建亲本载体，培育抗生素标记基因被删 除的转基因植物

在实施例1所构建的植物表达载体加入loxP位点，是为了与含有Cre酶基因的植 物表达载体(母本载体)共同作用，从而用于删除转基因植物抗生素标记基因。具体 步骤如下：

一、含有Cre酶基因的植物表达载体的构建

利用PCR方法，从水稻基因组中克隆出热激活蛋白hsp70基因启动子，根据cre 基因的序列，人工合成优化的cre酶基因，构建hsp70启动子热诱导表达的cre酶基因 的表达框。将该表达框插入pBAC823载体的DraIII酶切位点。命名为pBAC830 (pBAC830的质粒图谱如图8所示)。pBAC830中，所述hsp70启动子热诱导表达的 cre酶基因的表达框的核苷酸序列如序列表中序列13所示，其中，第1位到第687位 为所述hsp启动子的核苷酸序列，第694位到第1725位为所述Cre酶基因的编码序列。 再将花青素合成途径中bi表达框和cl表达框的插入pBAC830载体的EcoR I位点，命 名为pBAC9009。pBAC9009中所述花青素合成途径中bi表达框和cl表达框的序列如 序列表中序列4所示，其中，第1位到第2112位为所述cl表达框的基因序列，第2125 位到第5074位为所述bi表达框的序列，第1013位到第1834位为cl基因的编码序列， 第3137位到第4796位为bi基因的编码序列。

pBAC9009即为用于删除所述抗生素标记基因的含Cre酶基因的植物表达载体， 其质粒图谱如图9所示。pBAC9009为环状载体，含有两个同向loxP位点，可控启动 子，被所述可控启动子启动的Cre酶基因，抗生素标记基因的表达盒，可视化标记基 因的表达盒，和筛选转基因植物所需标记基因的表达盒。所述两个同向的loxP位点将 所述含Cre酶基因的植物表达载体划分为两段，其中一段含有编码所述抗生素标记基 因，可控启动子及被所述可控启动子启动的Cre酶基因，另一段含有所述筛选转基因 植物所需标记基因的表达盒和所述可视化标记基因的表达盒。所述的可控启动子为热 激活蛋白基因启动子。所述的抗生素标记基因表达盒含有启动卡那霉素标记基因的原 核启动子、SD序列、被该启动子启动的卡那霉素标记基因和转录终止序列。所述的可 视化标记的基因表达盒由花青素基因合成途径中的转录因子bi基因表达盒和花青素基 因合成途径中cl基因表达盒这两个表达盒组成。

二、玉米基因枪转化及转基因植株的PCR检测

按照实施例3所述方法，分别用pBAC9008和pBAC9009质粒转化玉米优良自交 系501；并按照实施例4所述方法，分别检测pBAC9008和pBAC9009转基因玉米的 外源基因。对于pBAC9008转基因植株，PCR检测的是an-B基因的表达，具体方法 完全同实施例4所述；对于pBAC9009转基因植株，PCR检测的是cre基因的表达， 其检测引物是根据cre基因设计的，具体为上游引物：TGGAAGATGCTACTGTCTGTC (序列13的第817-837位)，下游引物：CAGTGCTGACCAGAGTCTTA(序列13的 1293-1312位)，扩增的目的片段大小为495bp。

pBAC9008质粒对玉米的转化效果如实施例3所述，pBAC9008质粒转基因植株 an-B和an-C基因的表达情况如实施例4所述。

pBAC9009质粒对对玉米的转化效果：得到转化植株155株，有97株结实，其中 10株的种子有花青素基因的表达。pBAC9009质粒转基因植株中cre酶基因的表达情 况如图10所示，所获得的部分转化植株与阳性对照质粒(泳道20)都能扩增出了495bp 左右的cre基因的特异片段，阴性对照(无模板DNA，泳道18)和非转化植株(泳道 19)没有扩增带，表明外源cre酶基因已经成功转入玉米中。

三、转基因植株稳定后代杂交删除抗生素标记基因

按照步骤二所述将实施例1所得的含有抗生素标记基因的植物表达载体 (pBAC9008)和步骤一所得的含有Cre酶基因的植物表达载体(pBAC9009)分别转 化植物，经过T1代、T2代两代选择，获得Cre酶基因或外源目的基因、花青素合成 途径转录因子bi和cl基因、以及EPSP基因均稳定表达的、纯合的pBAC9009与 pBAC9008转基因植株(T2代植株的种子若为全紫色即为纯合的后代)。再通过杂交 来删除Kan抗性标记基因。下面就以转基因玉米为例来进行说明。

转重组酶基因(pBAC9009)植株(种子全为紫色)的T3代(母本)与转目的基 因(pBAC9008)植株(种子全为紫色)的T3代(父本)进行杂交，种子进行40℃热 诱导处理后种植，即可删除pBAC9008转基因植株的后代中的Kan基因及花青素转录 因子。热诱导处理后，假设删除效率为100％，当代结实的种子理论上3∶1分离，1/4 为黄色，即Kan抗性基因删除后的pBAC9008(目的基因)转基因植株的后代，有3/4 为紫色，后者其中有1/3为pBAC9009(重组酶)转基因植株的后代，2/3为同时含有 pBAC9008(目的基因)和pBAC9009(重组酶)的转基因植株的杂合体(图11)，杂 合体分离出的黄色玉米仍是Kan抗性基因删除后的pBAC9008(目的基因)转基因植 株的后代。即使是删除不完全，也只是在紫色种子中混有部分目的基因转基因植株的 后代，黄色种子中仍100％为pBAC9008(目的基因)转基因植株的后代。仅仅从种皮 的颜色以判断出转基因的效果与删除效果，因此该删除体系在转基因研究领域是一个 突破，大大节省了分子检测的成本，对于后续的育种也有着重要的意义。