抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA设计及载体的构建方法

摘要

本发明涉及一种抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA及载体的构建方法，其特征在于根据GenBank中公布的O型口蹄疫基因组序列，选择VP

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA及载体的构建方法，特别是涉及一种利用基因工程技术，通过shRNA的设计、合成及载体构建、攻毒、RT-PCR等过程及利用RNA干扰技术进行抑制猪O型口蹄疫病毒复制，属于抑制口蹄疫病毒（FMDV）复制技术领域。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）引起的一种严重危害偶蹄动物的急性、热性和高度接触性传染病。该病在世界各国广泛流行。本病以传播迅速、发病率高、经济损失巨大而成为家畜疾病中的头号“经济病”，国际兽疫局(OIE)将其列为A类家畜传染病之首，我国农业部将其列为第一类动物疫病的第一病。对口蹄疫的防治，发展中国家主要以疫苗防治为主，但在该病的免疫防控中存在疫苗的研制落后于病毒的变异、毒力反强、灭活不彻底、活病毒逃逸生产车间等的弊端，这就要求人们探索新的抗口蹄疫病毒的策略与手段。

口蹄疫病毒有A 、O 、C 、Asia1 和南非1 、2 、3 型7个血清型，不同亚型有70多个。近年来，在我国不同地区又不断出现了很多口蹄疫病毒变异株，这给该病的防控带来了很大的困难。对口蹄疫的防治，发达国家大多采取扑杀销毁的措施，而我国主要依靠疫苗免疫接种。FMD常用疫苗包括灭活疫苗和弱毒疫苗，FMD灭活疫苗免疫原性较差，且抗原谱较窄；弱毒疫苗虽然具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要的作用，但由于口蹄疫存在毒力返祖、病毒灭活不彻底、活病毒逃逸疫苗加工厂等不安全因素限制了此类疫苗的应用。同时，由于FMDV是一种高度变异性的RNA病毒血清型，而各型间不存在交叉保护作用，通过免疫接种来预防和控制口蹄疫的流行变得越来越困难。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是最早发现于植物细胞中的一种转录后的基因沉默技术，它是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，也即通过对目的基因转录后产生的mRNA的降解而使目的基因不能表达，即所谓的基因沉默，其原理是通过导入或细胞内产生与靶mRNA序列特异互补的小分子双链RNA,这种RNA称为小分子干扰RNA（即siRNA）。siRNA产生后，通过siRNA中的一条链与靶mRNA序列互补配对，再在一系列酶的作用下将靶mRNA降解，从而使靶mRNA不能翻译、表达，使其表型沉默。

自从RNAi发现后，RNAi技术已被广泛应用于基因功能、遗传规律、生长发育、信号转导、抗肿瘤和抗病毒等领域，在抗病毒研究中充分显示出其巨大的应用潜力，有望成为防控病毒性疫病的一种新手段。因此，利用RNA干扰技术构建表达载体能抑制口蹄疫病毒复制，为下一步培育具有抗口蹄疫病毒的转基因动物提供了有力保障。

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发明内容

本发明的目的在于提供一种抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA及载体的构建方法，其采用合成法并利用基因工程技术构建质粒并将优秀的干扰片段筛选出来，此质粒具有抑制口蹄疫病毒复制的能力，且在细胞水平上能够明显抑制FMDV的复制；根据RNA干扰技术原理我们选择FMDV基因开放阅读框中的VP₁和3D基因为进行RNA干扰的靶位点。其中VP₁编码区是主要抗原区，能诱导动物产生中和抗体。3D为RNA依赖的RNA聚合酶(3Dpol)，又称病毒相关抗原(VIAA)，催化病毒RNA的合成。病毒RNA复制时首先是正链RNA在3D作用下，从其3'端合成其互补链；再以负链为模板合成子代正链RNA。3Dpol的核苷酸序列和氨基酸序列具有高度的保守性。本发明应用RNAi技术在细胞水平筛选得到能明显抑制FMDV复制的shNRA序列。

本发明的技术方案是这样实现的：一种抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA，其特征在于合成抗口蹄疫病毒带shRNA载体的方法如下：

1. 根据GenBank中公布的O型口蹄疫基因组序列，选择VP₁和3D基因中的保守区段，选取一段19bp长的核酸序列；该序列不要在5’和3’非翻译区及起始密码子后75bp，因为这些区域富含调控蛋白，可能会影响RNA干扰效果；

2. 选取19bp核酸序列时要按下列要求进行：

1）计算该19bp核酸序列的GC含量，GC含量必须在40%-60%之间。GC含量大约在45%时最佳；

2）在15-19位点中至少有3个A或T核酸残基，可以增强RNA干扰活性；

3）保证19bp核酸序列不会形成二级结构；

4）在正义链和反义链寡核苷酸序列之间加入间隔序列TTCAAGAGA，使其能形成发夹结构，在反义链的3'端加入RNA polymerase的终止序列 TTTTTT；

3. 19bp核酸序列是特异性的只针对猪口蹄疫毒病目的基因，与其他基因没有太大的相似性，根据载体特性，合成发卡结构shRNA对应的DNA序列。

所述的抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA的序列如下，其中的核苷酸序列为5'-3'；

pSIREN-FMDV- VP₁-1

正义链：

GATCCAATTACTCAGACACTTGCAGTTTCAAGAGAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTTTTTTTACGCGTG

反义链：

AATTCACGCGTAAAAAAAATTACTCAGACACTTGCAGTTCTCTTGAAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTG

pSIREN-FMDV- VP₁-2

正义链：

GATCCAAGTTAATGTGTTGGACCTGATTCAAGAGATCAGGTCCAACACATTAACTTTTTTTTACGCGTG

反义链：

AATTCACGCGTAAAAAAAAGTTAATGTGTTGGACCTGATCTCTTGAATCAGGTCCAACACATTAACTTG

pSIREN-FMDV- VP₁-3

正义链：

GATCCAACAGCTTACCACAAGGAACCTTCAAGAGAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTTTTTTTACGCGTG

反义链：

AATTCACGCGTAAAAAAAACAGCTTACCACAAGGAACCTCTCTTGAAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTG

pSIREN-FMDV- VP₁-4

正义链：

GATCCAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTTCAAGAGAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTTTTTTTACGCGTG

反义链：

AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTCTCTTGAAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTG

pSIREN-FMDV- VP₁-5

正义链：

GATCCAAGGCAACTCGTGTTACTGAATTCAAGAGATTCAGTAACACGAGTTGCCTTTTTTTTACGCGTG

反义链：

AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAACTCGTGTTACTGAATCTCTTGAATTCAGTAACACGAGTTGCCTTG

pSIREN-FMDV- VP₁-6

正义链：

GATCCAAGAGAGCCGAGACATACTGTTTCAAGAGAACAGTATGTCTCGGCTCTCTTTTTTTTACGCGTG

反义链：

AATTCACGCGTAAAAAAAAGAGAGCCGAGACATACTGTTCTCTTGAAACAGTATGTCTCGGCTCTCTTG

pSIREN-FMDV-3D-1

正义链：

GATCCATAGCGTCACCGAAGTTACTATTCAAGAGATAGTAACTTCGGTGACGCTATTTTTTTACGCGTG

反义链：

AATTCACGCGTAAAAAAATAGCGTCACCGAAGTTACTATCTCTTGAATAGTAACTTCGGTGACGCTATG

pSIREN-FMDV-3D-2

正义链：

GATCCAAGACTCTAGTGAACACGGAGTTCAAGAGACTCCGTGTTCACTAGAGTCTTTTTTTTACGCGTG

反义链：

AATTCACGCGTAAAAAAAAGACTCTAGTGAACACGGAGTCTCTTGAACTCCGTGTTCACTAGAGTCTTG

pSIREN-FMDV-3D-3

正义链：

GATCCAAGTGACTACGACCTGGACTTTTCAAGAGAAAGTCCAGGTCGTAGTCACTTTTTTTTACGCGTG

反义链：

AATTCACGCGTAAAAAAAAGTGACTACGACCTGGACTTTCTCTTGAAAAGTCCAGGTCGTAGTCACTTG

pSIREN-FMDV-3D-4

正义链：

GATCCAAGGCCTCTTCGAGATTCCAATTCAAGAGATTGGAATCTCGAAGAGGCCTTTTTTTTACGCGTG

反义链：

AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCCTCTTCGAGATTCCAATCTCTTGAATTGGAATCTCGAAGAGGCCTTG

pSIREN-FMDV-3D-5

正义链：

GATCCAAGCTACAGATCACTTTACCTTTCAAGAGAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTTTTTTTACGCGTG

反义链：

AATTCACGCGTAAAAAAAAGCTACAGATCACTTTACCTTCTCTTGAAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTG

pSIREN-FMDV-3D-6

正义链：

GATCCAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTTCAAGAGAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTTTTTTTTACGCGTG

反义链：

AATTCACGCGTAAAAAAAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTCTCTTGAAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTTG

将上述shRNA连接到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector（购自clontech公司）上，然后将干扰载体大提质粒、线性化、乙醇沉淀、转染BHK-21细胞内，再对转染的细胞感染O型口蹄疫病毒，然后收毒，并提取毒液RNA，最后通过Real-time PCR筛选出高效抑制口蹄疫病毒复制的表达载体，这些载体就具有抗O型口蹄疫病毒病的能力。

所述的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector作为RNA干扰载体，首先将上述人工合成的shRNA序列合链，合链的条件是95℃ 30s，72℃ 2min，37℃ 2min，25℃ 2min，这些双链具有粘性末端，可以直接连接到干扰载体上，本发明所筛选的RNA干扰载体含有很好抑制口蹄疫病毒复制的shRNA。

本发明的积极效果是通过设计shRNA，然后将人工合成的DNA合链，克隆到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector上，最后将载体线性化后转染BHK-21细胞，利用表达的shRNA来抑制口蹄疫病毒的复制，从而起到预防的作用；近年来，在我国不同地区又不断出现了很多口蹄疫病毒变异株，又因为口蹄疫病毒存在毒力返祖、病毒灭活不彻底、活病毒逃逸疫苗加工厂等不安全因素，所以通过免疫接种来预防和控制口蹄疫的流行变得越来越困难，而本发明能通过RNA干扰来预防口蹄疫病毒，这将会对养猪业的发展产生深远影响，为人类带来更大的利益。

附图说明

图1是载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 及连入干扰片段结构图。

图2 是 shRNA合链结果琼脂糖凝胶电泳图。

图3 是 表达质粒转染BHK-21细胞22h时的荧光图。

图4 是 接毒不同时间段后BHK-21细胞病变图。

图5 是 攻毒后细胞总RNA的提取结果琼脂糖凝胶电泳图。

图6 是 内参标准曲线和样品标准曲线绘制结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。这些实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

实施例1 ，抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA的设计，如图1所示：

（1）根据GenBank中公布的O型口蹄疫基因组序列，选择VP₁和3D基因中的保守区段，选取一段19bp长的核酸序列。设计分别包含目的基因siRNA序列的正义链和反义链寡核苷酸序列，该核苷酸序列的GC含量为40%-60%；在15-19位点中至少有3个A或T核酸残基，可以增强RNA干扰活性；保证19bp核酸序列不会形成二级结构。

（2）在正义链和反义链寡核苷酸序列之间加入间隔序列TTCAAGAGA，使其能形成发夹结构，在反义链的3'端加入RNA polymerase的终止序列 TTTTTT,后再加上ECORI和BamHI酶切位点适配序列；委托上海生工生物有限公司进行单链DNA的人工合成，共120对，其中包括两个乱序干扰片段。

（3）19bp核酸序列是特异性的只针对猪口蹄疫毒病目的基因，与其他基因没有太大的相似性，根据载体特性，合成发卡结构shRNA对应的DNA序列。

实施例2    抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA的合成

将人工合成的正、反义链DNA片段，以去离子水溶解，终浓度为100μMol/L，各取10μl后PCR仪上合成双链：95℃ 30s，72℃ 2min，37℃ 2min，25℃ 2min，冰上放置后-20℃储存备用。部分合链结果如图2所示。

实施例3    设计和合成的抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA

pSIREN-FMDV- VP₁-1

5'-GATCCAAATTACTCAGACACTTGCAGTTTCAAGAGAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTTTTTTTACGCGTG-3'

5'-AATTCACGCGTAAAAAAAATTACTCAGACACTTGCAGTTCTCTTGAAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTG-3'

pSIREN-FMDV- VP₁-2

5'-GATCCAAAGTTAATGTGTTGGACCTGATTCAAGAGATCAGGTCCAACACATTAACTTTTTTTTACGCGTG-3'

5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGTTAATGTGTTGGACCTGATCTCTTGAATCAGGTCCAACACATTAACTTG-3'

pSIREN-FMDV- VP₁-3

5'-GATCCAAACAGCTTACCACAAGGAACCTTCAAGAGAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTTTTTTTACGCGTG-3'

5'-AATTCACGCGTAAAAAAAACAGCTTACCACAAGGAACCTCTCTTGAAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTG-3'

pSIREN-FMDV- VP₁-4

5'-GATCCAAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTTCAAGAGAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTTTTTTTACGCGTG-3'

5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTCTCTTGAAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTG-3'

pSIREN-FMDV- VP₁-5

5'-GATCCAAAGGCAACTCGTGTTACTGAATTCAAGAGATTCAGTAACACGAGTTGCCTTTTTTTTACGCGTG-3'

5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAACTCGTGTTACTGAATCTCTTGAATTCAGTAACACGAGTTGCCTTG-3'

pSIREN-FMDV- VP₁-6

5'-GATCCAAAGAGAGCCGAGACATACTGTTTCAAGAGAACAGTATGTCTCGGCTCTCTTTTTTTTACGCGTG-3'

5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGAGAGCCGAGACATACTGTTCTCTTGAAACAGTATGTCTCGGCTCTCTTG-3'

pSIREN-FMDV-3D-1

5'-GATCCAATAGCGTCACCGAAGTTACTATTCAAGAGATAGTAACTTCGGTGACGCTATTTTTTTACGCGTG-3'

5'-AATTCACGCGTAAAAAAATAGCGTCACCGAAGTTACTATCTCTTGAATAGTAACTTCGGTGACGCTATG-3'

pSIREN-FMDV-3D-2

5'-GATCCAAAGACTCTAGTGAACACGGAGTTCAAGAGACTCCGTGTTCACTAGAGTCTTTTTTTTACGCGTG-3'

5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGACTCTAGTGAACACGGAGTCTCTTGAACTCCGTGTTCACTAGAGTCTTG-3'

pSIREN-FMDV-3D-3

5'-GATCCAAAGTGACTACGACCTGGACTTTTCAAGAGAAAGTCCAGGTCGTAGTCACTTTTTTTTACGCGTG-3'

5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGTGACTACGACCTGGACTTTCTCTTGAAAAGTCCAGGTCGTAGTCACTTG-3'

pSIREN-FMDV-3D-4

5'-GATCCAAAGGCCTCTTCGAGATTCCAATTCAAGAGATTGGAATCTCGAAGAGGCCTTTTTTTTACGCGTG-3'

5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCCTCTTCGAGATTCCAATCTCTTGAATTGGAATCTCGAAGAGGCCTTG-3'

pSIREN-FMDV-3D-5

5'-GATCCAAAGCTACAGATCACTTTACCTTTCAAGAGAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTTTTTTTACGCGTG-3'

5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGCTACAGATCACTTTACCTTCTCTTGAAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTG-3'

pSIREN-FMDV-3D-6

5'-GATCCAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTTCAAGAGAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTTTTTTTTACGCGTG-3'

5'-AATTCACGCGTAAAAAAAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTCTCTTGAAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTTG-3'

实施例4   抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA连接到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体及其鉴定

将退火双链shRNA与载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen混合连接。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，涂板后挑取单克隆在LB培养液中过夜，然后提取菌液质粒，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，鉴定序列是否成功连接到载体并鉴定shRNA是否正确。

实施例5   口蹄疫病毒TCID₅₀的测定

小仓鼠肾细胞系（BHK-21）细胞复苏后，用含有10％小牛血清不含抗生素的DMEM营养液传代，放置37℃、5％、CO₂培养箱中培养待用。O型口蹄疫病毒毒株OS-99的生长和滴定都通过BHK-21细胞进行。滴定由以下方法进行，BHK-21细胞在感染前一天被植入96孔板，将原毒液在灭菌小试管内作连续的10倍稀释，吸取每一稀释度的病毒液0.1ml，加入于96孔已长成单层的敏感BHK-21细胞中，每个稀释度的病毒液接种8个孔。于37℃静止培养，逐日观察（一般需7-10d左右），直至终点，也就是看到能够引起病毒增值的病毒最高稀释度。 用Reed-Muench公式及原理测原病毒的TCID₅₀应是0.1ml10^-3.95稀释的病毒液。查反对数，得8913，即该病毒8913倍稀释液0.1ml等于1个TCID₅₀。

实施例6   抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA转染BHK-21细胞及攻毒实验

将构建好的表达载体扩大培养，大剂量提取质粒，线性化后乙醇沉淀，然后在24孔板上设转染表达质粒组、阴性对照组、不转染组和空白正常细胞组如图3所示。用含有10％小牛血清不含抗生素的DMEM营养液传代BHK-21细胞于24孔培养板，每孔5.0×10⁴细胞/500μl个，37℃、5％ 、CO₂培养箱中培养20-24 h，使细胞贴壁生长满度达到90-95％，按照Transfectamine2000^TM Reagent试剂说明书操作步骤进行转染。转染表达质粒的BHK-21细胞培养20-24 h后，以2×10³TCID₅₀/孔的FMDV感染，继续培养，分别于接毒10、20、40、80 h后观察CPE的变化如图4所示并收集不同时间段的细胞毒液-80℃储存备用。

实施例7   攻毒细胞RNA的提取及Real-time PCR

从-80℃取出攻过毒的BHK-21细胞，用TRIZOL试剂提取细胞RNA如图5所示。取5 μl DNaseⅠ处理的RNA，用试剂盒进行常规的反转录反应使RNA逆转录成为cDNA。设计VP₁、3D、β-actin基因序列（表1），以克隆正确的VP₁、3D和β-actin质粒为模板，各建立6个10倍梯度稀释，绘制目标基因和内参基因标准曲线如图6所示 。结果显示目标基因和内参基因相关系数均为0.998，说明6个点都在一条直线上，线性关系好，准确性比较高。

实施例8   抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA活性检测结果

将目标基因和内参基因样品各做三次重复，取Ct值的平均数，将样品Ct值的平均值带入样品标准曲线的结果除以β-actin Ct值的平均数带入β-actin标准曲线的结果，得出样品的表达量，值越大病毒的表达量就越少，说明shRNA抗病毒能力强，通过计算结果与阴性对照相比，干扰质粒组基因表达抑制率在63%至96.8%之间，其中pSIREN-FMDV-Green- VP₁-4和pSIREN-FMDV-Green-3D-2两个表达质粒抑制效率最好分别为96.8%和87%。

VP1-1正义链：5'-gatccAATTACTCAGACACTTGCAGTTTCAAGAGAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTTTTTTTACGCGTg-----3'

VP1-1反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAAATTACTCAGACACTTGCAGTTCTCTTGAAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTg-----3'

 

VP1-2正义链：5'-gatccAAGTTAATGTGTTGGACCTGATTCAAGAGATCAGGTCCAACACATTAACTTTTTTTTACGCGTg-----3'

VP1-2反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAAAGTTAATGTGTTGGACCTGATCTCTTGAATCAGGTCCAACACATTAACTTg-----3'

      

VP1-3正义链：5'-gatccAACAGCTTACCACAAGGAACCTTCAAGAGAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTTTTTTTACGCGTg-----3'

VP1-3反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAAACAGCTTACCACAAGGAACCTCTCTTGAAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTg-----3'

      

VP1-4正义链：5'-gatccAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTTCAAGAGAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTTTTTTTACGCGTg-----3'

VP1-4反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTCTCTTGAAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTg-----3'

      

VP1-5正义链：5'-gatccAAGGCAACTCGTGTTACTGAATTCAAGAGATTCAGTAACACGAGTTGCCTTTTTTTTACGCGTg-----3'

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VP1-6正义链：5'-gatccAAGAGAGCCGAGACATACTGTTTCAAGAGAACAGTATGTCTCGGCTCTCTTTTTTTTACGCGTg-----3'

VP1-6反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAAAGAGAGCCGAGACATACTGTTCTCTTGAAACAGTATGTCTCGGCTCTCTTg-----3'

      

  

3D-1正义链：5'-gatccATAGCGTCACCGAAGTTACTATTCAAGAGATAGTAACTTCGGTGACGCTATTTTTTTACGCGTg-----3'

3D-1反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAATAGCGTCACCGAAGTTACTATCTCTTGAATAGTAACTTCGGTGACGCTATg-----3'

 

3D-2正义链：5'-gatccAAGACTCTAGTGAACACGGAGTTCAAGAGACTCCGTGTTCACTAGAGTCTTTTTTTTACGCGTg-----3'

3D-2反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAAAGACTCTAGTGAACACGGAGTCTCTTGAACTCCGTGTTCACTAGAGTCTTg-----3'

      

3D-3正义链：5'-gatccAAGTGACTACGACCTGGACTTTTCAAGAGAAAGTCCAGGTCGTAGTCACTTTTTTTTACGCGTg-----3'

3D-3反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAAAGTGACTACGACCTGGACTTTCTCTTGAAAAGTCCAGGTCGTAGTCACTTg-----3'

      

3D-4正义链：5'-gatccAAGGCCTCTTCGAGATTCCAATTCAAGAGATTGGAATCTCGAAGAGGCCTTTTTTTTACGCGTg-----3'

3D-4反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAAAGGCCTCTTCGAGATTCCAATCTCTTGAATTGGAATCTCGAAGAGGCCTTg-----3'

      

3D-5正义链：5'-gatccAAGCTACAGATCACTTTACCTTTCAAGAGAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTTTTTTTACGCGTg-----3'

3D-5反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAAAGCTACAGATCACTTTACCTTCTCTTGAAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTg-----3'

      

3D-6正义链：5'-gatccAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTTCAAGAGAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTTTTTTTTACGCGTg-----3'

3D-6反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTCTCTTGAAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTTg-----3'