用于在跨角蛋白的局部药物递送中使用表面活性蛋白的组合物、用途和方法

摘要

本发明提供了表面活性蛋白(尤其是I类和II类疏水蛋白)在局部应用的药物制剂中的用途。本发明特别涉及局部应用的药物产品，所述药物产品用于增强渗透作用，以实现预防和/或治疗有效量的活性成分(药物)向患者(包括动物和人)的透指/趾甲递送，以进入动物或人体的指/趾甲内和/或通过所述指/趾甲，从而治疗一种或多种的各种疾病或病症。还公开了本发明的相关实施方案。

说明书

发明领域

本发明提供了表面活性蛋白(尤其是高表面活性蛋白)在局部应用的 药物制剂中的用途。本发明特别涉及局部应用的药物产品，所述药物产品 用于增强进入动物或人体的指/趾甲的角质化表面内和/或通过动物或人体 的指/趾甲的角质化表面的渗透，以实现预防的和/或治疗的有效量的活性成 分(药物)向患者(包括动物和人)的透指/趾甲递送，从而治疗一种或多 种的各种疾病或病症。

发明背景

疏水蛋白是一类具有约100至150个氨基酸的表面活性蛋白。疏水蛋 白的自我装配是通过构象改变来实现的。单体I类和II类疏水蛋白富含β 折叠的结构。疏水蛋白是丝状真菌的特征，例如裂褶菌(Schizophyllum  commune)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。迄今为止，它们，除其他 外，还被描述为在表面上形成稳定的层，预期抑制渗透或作为沉积基质(将 活性成分结合至例如材料的表面，因而将其固定在例如头发等上)发挥作 用。这是已经描述过的(见例如WO 2004/000880)。还描述了化妆品组合 物也允许处理含有角蛋白的材料、粘膜和牙齿，但再一次的其声称的作用 模式仅涉及疏水蛋白与人体角质化表面，例如头发、皮肤和指/趾甲(WO 2006/136607)的高亲和力，以及它们与任何活性成分或其他成分的锚定效 应，用于增强表面上的成分的浓度，允许对角蛋白表面的靶向和在其上长 期持续的作用。着水(Moisture addition)和柔肤(skin soothing)性质或 着色是本文的前景。尚未描述或提示过任何依赖渗透的药物效应。尤其是 没有提供任何表现出增强的活性的实例——实际上，所述方法似乎是违反 直觉的，因改善的结合应该导致在需要的位置处可获得较少的游离活性成 分，尤其是如果需要在角质化层之内或之下的治疗时。US 2003/0217419 也验证了这一点，其中描述了头发上的疏水蛋白允许获得抵抗若干种香波 洗涤的化妆品沉积。

在许多情况下，改善药物(活性成分)向患者机体的角质化表面内和/ 或通过所述角质化表面的渗透将是理想的，尤其是指/趾甲，由此可以在所 需位点实现药物有效浓度。

发明概述

然而，目前令人惊讶的发现，表面活性蛋白，如疏水蛋白，实际上可 用作活性成分通过动物或人体的指/趾甲表面的渗透增强剂。

因而，在第一个实施方案中，本发明涉及表面活性蛋白作为渗透增强 剂的用途，所述渗透增强剂允许实现将预防或(尤其是)治疗有效量的至 少一种活性成分透指/趾甲递送至患者(包括动物和人)，进入所述患者的 角质化表面之内和/或通过所述角质化表面，所述用途包括(优选在于)将 所述表面活性蛋白与进一步包含一种或多种活性成分的药物制剂混合。

在第二个实施方案中，本发明涉及表面活性蛋白用于制备药物制剂的 用途，所述制剂用于在需要与活性成分直接接触的位置治疗患者的疾病， 其中表面活性蛋白作为渗透增强剂发挥作用，以允许实现将预防或(尤其 是)治疗有效量的至少一种活性成分透指/趾甲递送至患者(包括动物和 人)，进入角质化表面之内和/或通过所述角质化表面，所述角质化表面包 括所述患者的指/趾甲。

在第三个实施方案中，本发明涉及使用表面活性蛋白作为渗透增强剂 的方法，以实现将预防或(尤其是)治疗有效量的至少一种活性成分透指/ 趾甲递送至患者(包括动物和人)，尤其是需要此类治疗的患者，进入角 质化表面之内和/或通过所述角质化表面，包括所述患者的指/趾甲，所述使 用包括将所述表面活性蛋白与药物制剂，以及与一种或多种活性成分和任 选的一种或多种药学可接受的载体和/或成分一起混合。

在第四个实施方案中，本发明涉及增强至少一种活性成分向患者的角 质化表面之内和/或通过所述角质化表面渗透的方法，包括所述患者的指/ 趾甲，以实现预防或(尤其是)治疗有效量的所述至少一种活性成分的透 指/趾甲递送，所述使用包括将所述表面活性蛋白与药物制剂，以及与一种 或多种活性成分和任选的一种或多种药学可接受的载体和/或成分一起混 合，和向所述患者局部施用所获得的药物制剂。

在第五个实施方案中，本发明涉及药物制剂，所述药物制剂包含至少 一种药学活性成分和形式为表面活性蛋白的渗透增强剂，尤其用于在没有 渗透增强剂的条件下较低或不可治疗的患者中，包括将一种或多种所述活 性成分以及与至少一种其他的药学可接受的载体一起，递增的递送进入指/ 趾甲内和/或通过指/趾甲。

上文提及的第一至第五个实施方案，还有其特别的(例如，优选的) 实施方案，在本文中也涉及本发明的药物制剂或根据本发明制备或使用的 药物制剂，或者作为药物制剂，其用途或其制备。

将要被局部应用的本发明的或根据本发明制备或使用的药物制剂，包 括(a)至少(药学的)活性成分和(b)非刺激性渗透增强剂，等等。

本发明特别涉及此类局部应用的药物制剂、其用途或其制备，用于增 强的治疗有效量的活性成分跨动物或人体的角质化表面(包括指/趾甲(或 蹄))的递送；和进一步跨此类角质化表面下的膜、体腔的膜、和任选的 进入与任意前述相邻近的身体组织、器官和/或系统的递送。

在一个特定的实施方案中，本发明涉及此类局部应用的药物制剂、其 制备或其用途，用于增强的预防或(尤其是)治疗有效量的至少一种活性 成分向患者的脚趾甲和/或手指甲的患病的或感染的甲床、甲基质和/或甲板 的递送，其中所述疾病或感染是感染性疾病，尤其是真菌病，更特别的是 甲藓；或者炎症、癌症、感染或变性。

发明详述

常规的术语、符号和表达优选的具有下列定义中给出的含义，可替代 本公开文本中使用的一个、两个或多个或所有的更常规表达，以定义本发 明的具体实施方案(方面)，所述实施方案是优选实施方案的实例：

指/趾甲，源于表皮，大部分由高度二硫键连接的角蛋白组成，比角质 层厚约100倍，从而对药物递送产生更大的阻碍。然而，指/趾甲的水渗透 速率比角质层高约10倍。另一方面，指/趾甲比皮肤的角质层含有更少的 水。

甲藓是手指甲或脚指甲的甲板和甲床的真菌感染，对多达50％的指/ 趾甲病症负责。甲藓在约6-8％的成人群体中流行。在所有类型的甲藓中， 指/趾甲变得各种各样的难看和扭曲。甲藓是由3种主要类型的真菌导致的： 皮肤真菌、酵母和非皮肤真菌的霉菌，是最难治疗的真菌感染之一。指/ 趾甲生长的时间长度、甲板的硬度，和感染发生在甲床和甲板之间的位置 是干扰作用于这类组织的真菌剂根除的主要因素。甲藓的治疗通常使用局 部的抗真菌剂或口服疗法。口服疗法具有副作用，如肝脏毒性，而局部疗 法受甲板低渗透性的局限。对指/趾甲的局部药物递送可以通过软膏、乳膏、 洗液、凝胶、喷雾、膏药、贴膏、绷带等。

甲藓的靶向药物治疗是有挑战的，因为感染嵌入在指/趾甲内，由于人 指/趾甲的高度限制性屏障而难以达到。甲板作为亲水性凝胶膜发挥作用， 是局部药物渗透的主要屏障，限制了该治疗类型的有效性。为了将足够量 的药物递送至甲板中，必须增强甲板对药物的渗透性。

指/趾甲的化学组成和实验证据提示含水通路在药物向指/趾甲的渗透 中发挥了主导作用。水表现出是指/趾甲的主要增塑剂。在水合的基础上， 硬的甲板变得更软且更柔韧。指/趾甲水合作用受多种因素的影响，例如溶 液pH和某些化学品。

对局部应用的药物组合物的制剂的严重挑战确保了它与所要被应用的 组织是生物相容的，使得组织不被制剂或其组分破坏或刺激。这是特别富 于挑战的，因为许多已知是渗透增强剂的局部赋形剂也已知是皮肤和膜刺 激物。一般而言，渗透增强剂可分为两大类(参见：Current medicinal  chemistry ISSN 0929-8673：2005，第12卷，第19期，第2273-2291页)：

(i)小极性溶剂，例如，乙醇、丙二醇、二甲基亚砜，和

(ii)含有极性头和疏水链的两亲化合物，例如，脂肪酸和醇类、1- 十二烷基氮杂环庚烷-2-酮(氮酮)、2-壬基-1，3-二氧戊环(SEPA 009)， 和十二烷基-2-二甲氨基丙酸酯(DDAIP)。两亲化合物也已知吸附在角蛋 白表面，并可用于头发治疗中。

由于从作用的指/趾甲表面快速的挥发，低沸点溶剂如乙醇作为渗透剂 (penetrator)仅具有临时活性。极性溶剂也可以是刺激物，并可以破坏甲 板。此类渗透增强剂可与指/趾甲角蛋白基质的化学改性剂组合使用，如：

(a)角质层分离剂，如尿素和水杨酸常用于软化甲板。

实例包括水杨酸、尿素和盐酸胍——此类物质可破坏角蛋白中的三级 结构，以及可能破坏次级键(如氢键)，从而促进通过指/趾甲的渗透。

(b)含硫化合物，如硫醇化合物、亚硫酸盐和亚硫酸氢盐，通过破坏 角蛋白中的二硫键发挥作用；

(c)表面活性剂，主要是阴离子型的，已知能够与角蛋白相互作用。

使用改变甲板的化学或物理内环境的增强剂的缺点是因为其导致永久 性的破坏，即，所述过程是不可逆的。

关于将药物递送到皮肤内或通过皮肤递送也存在相似的问题，皮肤也 包括角质化的表面。

在本发明的范围内，可以通过喷雾或通过贴膏，以及通过软膏、乳膏、 洗液、凝胶、喷雾、膏药、绷带等，来进行含有所要求保护的表面活性蛋 白的药物制剂的局部递送，其中所述表面活性蛋白增强渗透作用(即，作 为渗透增强剂发挥作用)。

本发明涵盖的一个特定的实施方案是应用的抗炎药物制剂，及其根据 本发明的用途或制备。抗炎药物是具有止痛、退热和在高剂量的条件下抗 炎性作用的药物--所述药物降低疼痛、发热和炎症。局部的抗炎药物有 效的减轻由软组织损伤、扭伤、拉伤和外伤导致的疼痛。酮洛芬 (ketoprofen)、联苯乙酸(felbinac)、布洛芬(ibuprofen)和吡罗昔康(piroxicam) 是已证实功效的实例，以及下文提及的其他例子。

渗透增强剂还可以帮助克服皮肤或粘膜表面的屏障性质，并促进添加 到药物制剂中的活性物质的经皮吸收。渗透增强剂(penetration enhancer) 的替代名称有例如渗透增强剂(permeation enhancer)、吸收助催化剂和 促进剂。

皮肤模型常用于测试物质的皮肤刺激效应以及皮肤吸收和/或渗透作 用。使用切下的人和动物皮肤的不同的皮肤模型的比较(Schmook等，2001， Comparison of human skin or epidermis models with human and animal  skin in in-vitro percutaneous absorption，Int.J.Pharmaceutics 215，51-56) 显示，根据用于渗透研究的化合物，皮肤等价物可以提供足以研究渗透速 率及其受渗透增强剂的调控的渗透屏障。

渗透增强剂可以与角质层中的分子相互作用，修饰它的渗透性，以实 现以治疗有效速率的递送。此类渗透增强剂可以通过预处理，或与药物伴 随的或联合的应用于皮肤。然而，由于对皮肤膜健康的安全性关注，已减 缓了将渗透增强剂掺入到产品中。因此，以安全而有效的方式克服角质化 屏障仍然是透皮局部疗法，并且尤其是透指/趾甲局部疗法的瓶颈。

一些有效的渗透增强剂包括非离子型表面活性剂，一种或多种可选自 单油酸甘油酯、甘油单月桂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、三油酸甘油酯 和肉豆蔻酸异丙酯。对于早期已知的渗透剂的列表(参见“Pharmaceutical  Skin Penetration Enhancement”，Marcel Dekker，New York 1993，第 229-24页)。WO 2006/103638A2描述了非离子表面活性剂在特比萘酚的 局部制剂中作为赋形剂，US 6455592公开了名为二丙二醇二甲醚的亲水性 渗透剂，以增强抗真菌剂通过指/趾甲的渗透。

作为药物制品中使用的物质的渗透增强剂必须满足一系列的质量标 准。它们必须不是：有毒的；对皮肤刺激性、过敏性或致敏的；并且它们 在产生充分的渗透作用所需的浓度下应该是药理学惰性的；它们的效应应 该是立即的、可预见的和可逆的；它们应该易于掺入到药物制品中。大部 分所研究的化学品对于在人皮肤上的用途都是有毒的或者过于刺激的。

因而本发明进一步提供了将具有低渗透速率的药物与表面活性蛋白共 同递送和组合，以增强活性成分(药物)的渗透。

表面活性蛋白优选是具有两亲性质的蛋白质，尤其是能够在表面(特 别是疏水或亲水的表面)成层的蛋白质。在可能的蛋白质中，蛋白质诸如 来自horse sweat的latherin(见例如，J.G.Bealey等，Biochem J.1986May 1；235(3)：645-650)、磷脂酶C、淀粉状蛋白或淀粉状蛋白样蛋白质如淀 粉状蛋白-β、β-酪蛋白、抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens) KA53的生物乳化剂，称为alasan、来自天蓝色链霉菌(S.coelicolor)A3(2) 和唐德链霉菌(S.tendae)的SapB、糖脂转移蛋白(glykolipid transfer  protein)、chaplines(Claassen等，Genes Dev.1714-1726，2003；Elliot 等，Genes Dev.17，1727-1740)或在本发明的具体的实施方案中，来自通 常称为疏水蛋白的类别的蛋白质，尤其是1类和/或2类疏水蛋白。

疏水蛋白是小的真菌表面活性蛋白，在界面上自我组装成具有纳米尺 度结构的薄膜。之前尚未描述过表面活性蛋白(优选疏水蛋白)作为渗透 增强剂用于药物的局部应用中的潜在用途。

可以理解，还可以使用多种不同的根据本发明的疏水蛋白的混合物。

在本发明的上下文中，下文的术语“疏水蛋白”尤其理解为通用结构 式(I)的多肽：

X_n-C¹-X_1-50-C²-X_0-5-C³-X_1-100-C⁴-X_1-100-C⁵-X_1-50-C⁶-X_0-5-C⁷-X_1-50-C⁸-X_m(I)，

其中，X可以是20种天然存在的氨基酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、 Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、 Glu、Gly)的任一种。其中的X可以是相同的或不同的。在各种情况下， 与X相邻的指数表示氨基酸的数目，C是半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘 氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，至少4个由C表示的氨基酸(C¹-C⁸)是半胱 氨酸，指数n和m分别彼此独立的是从0至500的自然数，优选从15至 300。这些物质及其制品是已知的，例如从开始提及的文献中，例如WO 06/103230或WO 2006/136607，其(特别是关于疏水蛋白的公开内容)通 过引用包括在本文中。

标示为C¹至C⁸的氨基酸优选是半胱氨酸，但也可以被相似空间结构 的其他氨基酸替换，优选被丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或甘氨酸。 在任何事件中，位置C¹至C⁸的至少4个，优选至少5个，特别至少6个 和更特别至少7个是由半胱氨酸组成。在根据本发明的蛋白质中，半胱氨 酸可以以还原的形式存在，或者可以彼此形成二硫键。特别优选的涉及分 子内键的形成，特别是具有至少1个、优选2个、特别优选3个和更特别 优选4个分子内二硫键的那些。在上述半胱氨酸被相似空间结构的氨基酸 替换的情况下，能够彼此形成分子内二硫键的C位置有利的被成对替换。

当半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸也被用于 由X标示的位置上时，可以相应的改变通式中的各C位置的编号。

为了执行本发明，使用通式(II)的疏水蛋白是优选的

X_n-C¹-X_3-25-C²-X_0-2-C³-X_5-50-C⁴-X_2-35-C⁵-X_2-15-C⁶-X_0-2-C⁷-X_3-35-C⁸-X_m(II)，

其中，X、C和与X相邻的指数如上文定义的，指数n和m是从0至 300的数，并通过接触角的上述改变进一步区分所述蛋白质。

使用通式(III)的疏水蛋白是特别优选的

X_n-C¹-X_5-9-C²-C³-X_11-39-C⁴-X_2-23-C⁵-X_5-9-C⁶-C⁷-X_6-18-C⁸-X_m    (III)，

其中，X、C和与X相邻的指数如上文定义的，指数n和m是从0至 200的数，并通过接触角的上述改变进一步区分所述蛋白质，此外，至少6 个由C标示的氨基酸是半胱氨酸。特别优选的，所有的氨基酸C是半胱氨 酸。

残基X_n和X_m可以是肽序列，所述肽序列也是与疏水蛋白天然连接的。 然而，一个或两个所述残基也可以是不与疏水蛋白天然连接的肽序列。这 些还包括这样的残基X_n和/或X_m，其中在疏水蛋白中天然存在的肽序列被 不天然存在于疏水蛋白中的肽序列加长了。

一个实例是H＊A(与溶解度标签Yaad融合的His标记的疏水蛋白 DewA，由BASF提供；生产参见WO 2006/082251)。

此外，根据本发明使用的蛋白质还可以在它们的多肽序列中被修饰， 例如通过糖基化、酰化(例如，乙酰化)或通过化学交联，例如使用戊二 醛。

根据本发明使用的蛋白质的性质是当用所述蛋白质包被表面时，表面 性质改变。可以通过测量在表面被蛋白质包被前后的水滴的接触角，并确 定两次测量之间的差异，来实验性确定表面性质的改变。

因而，通过下述性质进一步表征根据式(I)的多肽或更多种根据本发 明的疏水蛋白，所述性质为，在室温下，在包被玻璃表面后，相比相同大 小的水滴与未包被的玻璃表面的接触角，它们使水滴的接触角产生通常至 少20°，在另一个发明实施方案中至少25°，在另一个发明实施方案中至 少30°，和在另一个发明实施方案中至少35°，例如35至65°的增加。 本领域技术人员已知进行接触角测量的过程。例如，可以在玻璃(来自 Sueddeutsche Glas，Mannheim，Germany的窗玻璃)上确定接触角，使用 浓度为100μg/ml的待测疏水蛋白，将玻璃板在80℃下孵育在50ml的 水中具有0.1％Tween 20的醋酸钠pH 4中过夜，在用蒸馏水覆盖后洗涤， 然后，在80℃下，在1％的十二烷基硫酸钠的蒸馏水溶液中孵育10分钟， 然后用蒸馏水洗涤。在空气中干燥样品，确定一滴或50μl的接触角(按 度计)。在Dataphysics Contact Angle System OA 15+，Software SCA20.2.0 (Nov.2002)上，根据生产商的说明书进行接触角测量。

用于实施本发明的合适的疏水蛋白是例如WO 06/103230或WO 2006/136607的那些，尤其关于它们对疏水蛋白的公开内容通过引用掺入到 本文中。它们还可以只是其一部分或衍生物。还可以是多种的疏水蛋白， 优选2种或3种，其中相同或不同的结构彼此连接，并与相应的合适的多 肽序列相连接，所述多肽序列不是与疏水蛋白天然结合的。重要的是，它 们至少保持了其增加水滴的接触角的性质，或者更特别的，其通过实施例 描述的方法增强通过角质化表面的渗透作用的性质。

还可以通过遗传改造方法(重组的)进行疏水蛋白的制备，其中，将 编码本发明上下文中的疏水蛋白的核酸序列，特别是DNA序列，插入到 宿主生物体中，使得通过核酸序列的基因表达生产理想的蛋白质。可以在 异源的或同源的宿主菌株中进行基因表达。此类方法原则上是本领域技术 人员已知的，并公开在例如WO 06/082251中。

这允许生产重组的疏水蛋白。

用于所述制备方法的合适的宿主生物体(生产生物体)可以是原核生 物(包括古细菌)或真核生物，特别是细菌包括盐杆菌和甲烷球菌、真菌、 昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞，特别优选的是大肠杆菌(Escherichia  coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus  megaterium)、米曲霉(Aspergillus oryzea)、构巢曲霉(Aspergillus  nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、 假单胞菌属物种(Pseudomonas spec.)、乳酸杆菌(lactobacilli)、多形 汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、 SF9(和相关的细胞)等。

可以以融合蛋白的形式直接使用所生产的蛋白质，或者在拆去和移除 融合伙伴蛋白后，以“纯的”疏水蛋白的形式使用所生产的蛋白质。

还可以通过遗传工程方法，使用恰当的宿主系统(例如真核起源的)， 以糖基化或酰化或其它的修饰形式获得疏水蛋白。

可选的或额外的，可以通过合适的方法从天然来源中分离天然存在的 疏水蛋白。参考例如等，Eur.J Cell Bio.63，122-129(1994)或WO 96/41882。

在从天然来源分离的疏水蛋白中，可提及属于I类的疏水蛋白，如 CFTH1、SC4、ABH3、EAS、或(在具体的实施方案中)来自裂褶菌 (Schizophyllum commune)的SC3、或来自里氏木霉(新名称：红褐肉 座菌(Hypocrea jecorina))的HBF II，以及属于II类的疏水蛋白，如 HFBII，里氏木霉(登录号：P79073[GenBank])；HFBI，里氏木霉(登 录号：P52754[GenBank])；SRHI，哈茨木霉(Trichoderma harzianum) (登录号：Y11841[GenBank])；QID3，哈茨木霉(登录号：P52755 [GenBank])；TRI1、TRI2和TRI3，其为TH1梭形麦角(Claviceps  fusiformis)(登录号：Q9UVI4)的三个区段；CPPHI_1、CPPH1_2、CPPH_3、 CPPH_4、CPPH_5，其是cpph1麦角(Claviceps purpurea)(登录号： AJ418045[GenBank])的五个区段；CRYPA，Cryparin栗疫病菌 (Cryphonectria parasitica)(登录号：P52753[GenBank])；CU， Cerato-ulmin榆枯萎病菌(Ophiostoma ulmi)(登录号：Q06153 [GenBank])；MAG，Magnaporin稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(登 录号：AF126872[GenBank])；HCF5，黄枝孢霉(Cladosporium fulvum) (AJ133703[GenBank])；HCF6，黄枝孢霉(登录号：CAC27408 [GenBank])(参见例如，Han A.B.：Hydrophobins：Multipurpose  Proteins，Annual Review of Microbiology，出版日：01-JAN-01；Wessels J. G.H.(1994)Annu.Rev.Phytopathol 32：413-437；H.A.B.(2001) Annu.Rev.Microbiol 55：625-646；及其中分别提及的参考文献)。关于 SC3的分离参见例如Wessels，J.G.H.(1997)Advances in Microbial  Physiology 38，1-45；H.A.B.，de Vries，O.M.H.，和Wessels，J.G. H.(1993)Plant Cell 5，1567-74；Lugones，L.G.，H.A.B.和Wessels， J.G.H.(1998)Microbiology 144(Pt 8)，2345-53。关于里氏木霉疏水蛋白 HFBII的分离参见Nakari-T.，Aro，N.，Ilmen，M.，Kalkkinen，N.和 M.1997，Differential expression of the vegetative and  spore-bound hydrophobins of Tricoderma reesei，Cloning and  characterization of the hfb2(for HFB22)gene.Eur.J.Biochem.248，第 415-423页。

可能的优选重组疏水蛋白是H＊A(与溶解度标签Yaad融合的His标 记的疏水蛋白DewA，由BASF提供；生产参见WO 2006/082251)。

“渗透增强剂允许实现(例如，透皮的、皮下的、横跨膜的、肌肉骨 骼的、透指/趾甲的(transungual)、transonychial的和/或peronychial) 递送预防或(尤其是)治疗有效量的至少一种活性成分”尤其意指在单位 时间段内，与除不含表面活性蛋白外其余相同的组合物所实现的状态比， 表面活性蛋白的存在导致角质化表面内更高浓度的活性成分，和/或更大量 的活性成分通过角质化表面。这可以通过例如下文实施例中描述的方法来 测量。

“有效的”当用于预防的和/或治疗的意义时，优选治疗活性的。

预防有效的特别意指至少一种活性成分阻止或减慢了疾病或病症的形 成，相比不存在所述至少一种活性成分的状态下。

治疗有效的特别意指至少一种活性成分消除了疾病或病症的一种或多 种或所有的症状，或者甚至导致部分或完全治愈。

患者可以是动物，如爬行动物或鸟类，或者特别是哺乳动物，如人。

作为“角质化表面”，特别可以提及指/趾甲和相邻的皮肤，更优选指 /趾甲。“指/趾甲”包括兽医预防和治疗中的蹄。

至少一种活性成分可以选自例如抗生素，如抗菌的(例如，氨基糖苷 类抗生素，如链霉素、弗氏丝菌素、卡那霉素、巴龙霉素、头孢菌素 (cefalosporine)如头孢噻啶(cafaloridin)、头孢地嗪(cefodizim)、头孢西 丁(cefoxitin)或头孢克洛(cefaclor)、氯霉素类(chloramphenicols)如 磷霉素(fosfomycin)、林可霉素(lincomycin)抗生素类如克林霉素 (clindamycin)、大环内酯抗生素类(macrolide antibiotics)如红霉素 (erythromycin)、青霉素抗生素类(penicillin antibiotics)如阿莫西林 (amoxicillin)或氨苄西林(ampicillin)、多肽抗生素类如安福霉素 (amphomyxin)、杆菌肽(bacitracin)或短杆菌素(tyrothricin)、糖 肽抗生素类(glykopeptide antibiotics)如万古霉素(vancomycin)、四环 素类(tetracyclins)如氯四环素(chlortetracycline)或脱氧土霉素 (doxycyclin)、甾族抗生素类(steroid antibiotics)如夫西地酸(fusidic  acid)，或核苷抗代谢物(nucleoside antimetabolites))、抗病毒的(例如， 干扰素类(interferones)、环胺类(cyclic amines)如amantidin、缩氨硫 脲类(thiosemicarbazones)如methisazon、双胍类(biguanides)如吗啉 双胍(moroxydin)，或核苷抗代谢物类如碘苷(idoxuridin)或齐多夫定 (zidovudin))，或(特别的，尤其是对于指/趾甲治疗)抗真菌剂(抗真菌 药(antimycotics))，例如两性霉素B(amphotericin B)、制霉菌素(nystatin)、 灰黄霉素(griseofulvin)、益康唑(econazol)、咪康唑(miconazol)、 酮康唑(ketoconazol)、三苯甲咪唑(clotrimazol)、氟康唑(fluconazol)、 托萘酯(tolnaftat)、托西拉酯(tolciclat)、阿莫罗芬(amorolfin)、氯 康唑(croconazol)、芬替康唑(fenticonazol)、双醚康唑(omoconazol)、 丝他康唑(sertaconazol)、萘替芬(naftifin)、特比萘芬(terbinafin)， 以及十一烯酸(undecylen acid)(例如，Zn盐)、水杨酸(salicylic acid)、 氰化钾(potassium cyanide)、酚类(phenols)、醛类(aldehydes)、三 苯甲烷类染料(triphenyl methane dyes)、sulful、硫磺)，例如，抗指/趾 甲的甲藓的活性剂；选自消炎药(antiphlogistics)(例如，非甾醇类消炎药 (non steroidal antiphlogistics)或糖皮质激素(glicocorticoids)或诸如此类)、 抗风湿药(anti-rheumatics)(如征候抗风湿药(symptomatic antirheumatics) 或基础治疗剂(basis therapeutics))、镇痛药(analgesics)(尤其是在治疗皮 肤或通过皮肤治疗的情况下，如外周镇痛药(peripheral analgetics)，例如 苯胺衍生物(aniline derivatives)如扑热息痛(paracetamol)、邻氨基苯甲 酸衍生物(anthranilic acid derivatives)如flufenaminic acid、mefenaminic  acid或nifluminic acid、苯基烷基酸衍生物(phenylalkyl acid derivatives) 如阿西美辛(acemetacin)、吲哚美辛(indomethacin)、布洛芬(ibuprofen)、 联苯乙酸(felbinac)、酮洛芬(ketoprofen)或萘普生(naproxen)、昔康 类(oxicames)如替诺昔康(tenoxicam)或吡罗昔康(piroxicam)、吡唑衍生 物(pyrazole derivatives)如phenazol或安乃近(metamizol)、水杨酸衍 生物(salicyclic acid derivatives)如水杨酰胺(salicyl amide)、乙酰水杨 酸(acetyl salicylic acid)或二氟尼柳(diflunisal))、退热药(antipyretics) 以及特别是在较高的剂量下的抗炎成分——其降低疼痛、发热和/或炎症； 局部抗炎药有效的缓解了由软组织损伤、扭伤、拉伤和外伤导致的疼痛； 抗银屑病药(antipsoriatics)，如糖皮质激素，如氟替卡松(fluticason)或 莫米松(mometason)、角质层分离剂(keratolytics)如水杨酸、维生素 D类似物如卡泊三醇(calcipotriol)或他卡西醇(tacalcitol)、氨甲蝶呤 (methotrexate)、维甲类(retinoids)或环孢素A(ciclosporin A)、抗 增殖剂(antiproliferative agents)如抗黑色素瘤药(antimelanoma agents)， 分别例如化疗剂或抗体、抗粉刺的治疗剂或预防剂如维甲类(retinoids)， 例如阿利维A酸(alitretinoin)、异维a酸(isotretinoin)或维甲酸 (tretinoin)、红霉素(erythromycin)、克林霉素(clindamycin)或壬 二酸(azelaic acid)、四环素类(tetrycyclins)、entiseborrhhids如抗雄 激素类(antiandrogens)，例如醋酸环丙孕酮(cyproteron acetate)或雌 激素，如美雌醇(mestranol)、抗内源性或外源性湿疹的活性剂，如变应 性或局部湿疹，例如抗组胺药(antihistaminics)、糖皮质激素类 (glucocorticoids)、苯二氮卓类(benzodiazepines)、抗过敏剂(antiallergics) 或诸如此类，或者，尤其是在眼睛的情况下，抗白内障或者尤其是结膜炎 的活性剂，如抗过敏剂(antiallergics)。

在例如指/趾甲的情况下，需要与活性成分直接接触的位置可以是指/ 趾甲本身或其直接围绕物，如脚趾甲和/或手指甲的甲床、甲基质和/或甲板， 或者在动物的情况下，患者的爪子或蹄等。

“需要治疗”(当术语治疗包括预防性或(优选)治疗性处理时)特 别意指患者预防性的(例如，考虑到预期或已知对疾病或病症的蔓延易感) 或治疗性的(在疾病或病症发作后，例如，其至少一种症状发作后)需要 处理来维持或改善他的健康状态。

根据本发明或本发明的实施方案使用或制备的药物制剂特别意指局部 制剂，例如以软膏剂、酊剂、乳膏(O/W乳剂)、富乳膏(W/O乳剂)、 洗液、泡沫、凝胶如水凝胶或脂凝胶(lipogel)、糊剂、喷雾、固体气溶 胶、香波、皂、膏药、贴膏、绷带、溶液、乳剂、悬浮液等的形式，需要 时包括用于透皮系统的应用，如面膜(mask)、敷布、药棉块(pad)。实际 上，本发明可利用任何可以局部应用的常规组合物。

在制备上述局部制品中，可以使用赋形剂和/或载体材料，包括其他的 添加剂，如防腐剂、增稠剂、香料和局部制品的药物配方领域常规的物质。 此外，可以将常规的抗氧化剂或常规抗氧化剂的混合物掺入到含上述活性 剂的局部制品中。可用于这类制品的常规抗氧化剂包括N-甲基-α-生育酚 胺(N-methyl-α-tocopherolamine)、生育酚、丁羟茴醚、丁羟甲苯、乙氧喹 等。根据本发明使用的、含有活性剂的基于乳膏的药物制剂由水性乳剂组 成，所述乳剂含有脂肪酸醇、半固体石油烃、乙二醇和乳化剂。

含有至少一种活性剂和根据本发明的表面活性蛋白的软膏制剂包含例 如半固体石油烃与活性材料的溶剂分散体的混合物。含有用于本发明中的 活性成分的乳膏组合物优选的包含由湿润剂、粘度稳定剂和水的水相，脂 肪酸醇、半固体石油烃和乳化剂的油相，以及含有分散在含水的稳定剂- 缓冲液同业中的活性剂的相所形成的乳剂。稳定剂可以添加到局部制品中。 根据本发明可以利用任何常规的稳定剂。这类脂肪酸醇组分作为稳定剂发 挥功能。这类脂肪酸醇组分源自含有至少14个碳原子的长链饱和脂肪酸的 还原。此外，根据本发明可以利用在头发的局部制品中通常使用的常规香 料和洗液。此外，当需要时，常规的乳化剂可用于本发明的局部制品中。 可选的，可利用标准凝胶载体使用凝胶。

乳膏是包含超过50％水的水包油乳剂。其中含油基(oily base)特别 使用脂肪醇，例如月桂醇、鲸蜡醇或硬脂醇；脂肪酸，例如棕榈酸或硬脂 酸；液体至固体蜡，例如肉豆蔻酸异丙酯、羊毛蜡或蜂蜡；和/或烃类，例 如凡士林(矿脂)或石蜡油。合适的乳化剂是主要具有亲水性质的表面 活性物质，如非离子型乳化剂，例如多元醇的脂肪酸酯或其环氧乙烷加合 物，如聚甘油酸脂肪酸酯或聚乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，以及还有聚氧乙烯 脂肪醇醚或脂肪酸酯，或相应的离子型乳化剂，如脂肪醇硫酸盐的碱金属 盐，例如十二烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠或十八烷基基硫酸钠，其通常 在存在脂肪醇的条件下使用，所述脂肪醇例如鲸蜡醇或硬脂醇。水相的添 加物，除其他外，还有降低乳膏干燥的活性剂，例如多元醇，如甘油、山 梨醇、丙二醇和/或聚乙二醇，以及防腐剂和香料。

糊剂是具有分泌-吸附性粉末组分的乳膏和软膏，所述组分例如金属氧 化物，如氧化钛或氧化锌，以及滑石和/或硅酸铝，其目的是结合所存在的 任何水分或分泌物。

泡沫是自喷雾剂(pressurized containers)施用的，是气溶胶形式的 液态水包油乳剂，其中用作喷射剂的是卤代烃，如氯-氟-低级烷烃，例如 二氯二氟甲烷和二氯四氟乙烷，或优选的非卤代的气态烃类，空气、N₂O 或二氧化碳。其中作为油相所使用的，除其他外，还有上文软膏和乳膏所 使用的油相，以及其中提及的添加剂。

酊剂和溶液一般具有水-乙醇基底(base)，其中当需要时，除其他外， 还向其添加了多元醇(例如甘油、乙二醇和/或聚乙二醇)作为湿润剂，用 于降低蒸发；以及储存脂类的物质——如含低分子量聚乙二醇的脂肪酸酯， 换言之即可溶于含水混合物中的亲脂性物质——作为被乙醇从皮肤中移除 的脂肪类物质的替代；以及当需要时，其他赋形剂和添加物。

湿润剂可以以例如多价的醇类而存在，特别是二元或三元醇，如戊二 醇，例如1，2-戊二醇。

此外，pH调节剂可以例如在20至25℃下，维持pH优选在4.5至 6.0的区域内，更优选从4.8至5.5。

用于根据本发明的局部施用的药物制品可如下制备：通过将上述活性 成分与此类制品中常规使用的无毒的、治疗惰性的、固体或液体载体混合。 这类制品优选包含0.1至30重量百分比，尤其是0.1至10.0重量百分比， 优选0.3至8.0重量百分比的活性成分，上述为基于组合物的总重量计。

根据本发明，表面活性蛋白优选的一般使用(添加)/存在的量是从 0.001至5％的药物制剂的重量，例如，从0.01至2％，如按重量计分别从 0.02至1％或1％至5％。已经非常低的量可以是足够的，表示根据本发明 所使用/存在的表面活性蛋白的高渗透增强活性。

其余物质可以是一种或多种药学可接受的赋形剂，例如如上所述，包 括载体材料和/或其它添加剂。

所应用的剂量取决于位置和待治疗的疾病或病症——例如，在每cm²待接触的区域上0.1至50mg的量可以应用1次或若干次，例如达一天3 次。待应用的剂量还可以根据待治疗患者的物种、大小、性别、重量和其 它特定的特征而变化。

局部药物制剂的产生(制备)包括用于获得此类局部制剂的标准方法， 例如，用于混合所述成分的。至少一种表面活性蛋白和至少一种活性成分 添加到混合物中或者如此相混合，意味着其它药物载体或赋形剂不是必需 存在的，虽然也可以添加一种或多种此类载体材料或赋形剂以获得最终的 产品。组分添加的顺序通常是重要的，有利的顺序是已知的，或者对熟练 的技术人员而言是易于推论的。

局部施用是例如施用于指/趾甲。

附图概述

图1：A，咖啡因通过体外皮肤模型的渗透的相对增强；

B，在维持基质中咖啡因回收的绝对值。

图2：渗透过指/趾甲的特比萘芬(Terbinafine)的累积平均量(实 施例1a)。

缩写：

w/w按重量比重量给出的百分比或量

v/v按体积的百分比或量

w/v按重量比体积的百分比或量(如果液相的密度为1g/ml，则与 w/w相同)

下列实施例用于示例本发明而非限制其范围。

疏水蛋白的制备

一般程序＊＊

疏水蛋白的制备_/＊＊

出于本发明的目的，使用来自裂褶菌的I类疏水蛋白(SC3)和来自 里氏木霉的II类疏水蛋白(HFBII)。从NCBI/Gene Bank获得所述疏水 蛋白的蛋白质序列：SC3：登录号P16933 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝protein&val＝1710860)；HFB II：登录号CAA72636 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1903325)。

将氨基酸序列翻译成核酸序列。在根据大肠杆菌优化密码子使用后， 合成cDNA(Sloning BioTechnology，Pucheim，Germany)。通过本领域已 知的方法，将疏水蛋白核酸序列克隆到包含T7-RNA-聚合酶的pET载体 中，并转化到表达宿主大肠杆菌BL21中(Sambrook等，Molecular Cloning： A Laboratory Manual(第2版，1989)；Maniatis等，Molecular Cloning： A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning：A Practical Approach，第I& II卷(D.Glover编著))。

使用分别存在100μg/ml氨苄西林或25μg/ml卡那霉素的ZYM-5052 培养基(25mM Na₂HPO₄，25mM KH₂PO₄，50mM NH₄Cl，5mM Na₂SO₄， 20mM MgSO₄，5g/l甘油，0.5g/l葡萄糖，2g/lα-单水合乳糖，5g/l酵 母提取物，和10g/l NZ-胺类(购自Sigma))，以10升的规模，实施用 表达载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)的发酵16小时，所述载体包含优 化的疏水蛋白cDNA。在收获生物质后，将沉淀的细胞冷冻在液氮中，并 储存在-80℃。通过超声处理沉淀细胞的解冻的等分试样后，将细胞均质 物煮沸30秒，使释放的内含体溶解，并在20℃下600rpm搅动2h。

通过离心将细胞碎片沉淀10min，将含上清液的蛋白质通过0.22μm 的滤器。在镍琼脂糖(GE Healthcare)上通过亲和层析分离滤液，在SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳上分析洗脱的级分。收集含疏水蛋白的级分，随后通 过在Slide-A-Lyzer(Pierce)中用10kDa截断(cut off)的膜对水透析(30ml 洗脱液在3升水中透析16小时)，将含疏水蛋白的溶液脱盐。

使用BCA测定(Pierce)确定蛋白质浓度。在液氮中将疏水蛋白溶液 速冻并冻干。

实施例1——指/趾甲的渗透性研究

制剂和缓冲溶液的制备

制剂含一种增强剂——里氏木霉疏水蛋白HFBII(分离参见 Nakari-T.，Aro，N.，Ilmen，M.，Kalkkinen，N.和M.1997， Differential expression of the vegetative and spore-bound hydrophobins of  Tricoderma reesei，Cloning and characterization of the hfb2 gene.Eur.J. Biochem.248，第415-423页)或H＊A(与溶解度标签Yaad融合的His 标记的疏水蛋白DewA，由BASF提供；生产参见WO 2006/082251)，作 为模式活性成分的咖啡因和水，针对在水中含20％(v/v)乙醇(而非纯水) 的相似制剂评估所述制剂。由于乙醇是难溶于水的物质的强效溶剂，且阻 止微生物生长，故希望更好或相似的渗透性。对于渗透性实验，每种增强 剂都用于含水作为溶剂的制剂中，以及含20％(v/v)乙醇的水作为溶剂的平 行制剂中。除多库酯钠盐为1％(w/v)外，增强剂的浓度都是5％(w/v 或v/v)，疏水蛋白分别为0.02和0.1％。所有的制剂都含浓度为2％(w/v) 的咖啡因作为模式活性成分。在该咖啡因浓度下，溶液几乎是饱和的。其 意图在于根据可能的最高浓度梯度实现较快的稳态。制备的磷酸缓冲盐溶 液(PBS)pH为7.4。PBS的pH和重量摩尔渗透压浓度都模拟Franz扩 散池的受体室中的血液的生理条件(全身性缓冲系统)。用于制剂和PBS 的水是新制的，经过双蒸镏和过滤。

渗透研究

用于渗透性实验的健康指/趾甲获得自德国巴塞尔大学的解剖学研究 所(Institute of Anatomy of the University of Basel)和弗莱堡大学的解剖 学研究所(Institute of Anatomy of the University of Freiburg)。使用具有 0.785cm²扩散面积的Franz扩散池(SES GmbH-Analysesysteme， Bechenheim，Germany)。指/趾甲通过浸泡在PBS中1小时完全水合，然 后用金属打孔器切断，产生16mm的直径。随后，它们以恰当的方式放置 在扩散池中。指/趾甲下方的受体室装满5ml PBS。将制剂(400μl)用于 指/趾甲上。为了保持系统中的温度恒定，用保持在32℃的水套给玻璃池 调节。用磁力搅拌器以400rpm搅拌受体室。用Parafilm(含石腊和聚乙 烯的薄膜；American National Can Company，USA)覆盖制剂的开口和用 于采样的延长部分。从每个池取400μl的样品，每天2次，并用加热至32℃ 等量的PBS替换。6天后，终止实验。用UV分光光度计测量样品的浓度。 用48小时后的值计算流出和渗透系数，因此时获得了稳态。

表1：在存在疏水蛋白的条件下进行的渗透研究的结果

¹水中的增强因子(EF)(20mg/mL咖啡因)

²20％(v/v)EtOH/水中的增强因子(EF)(20mg/mL咖啡因)

³按w/v给出百分比

＊改变了实验设置

增强因子是指相比纯水或含20％EtOH水中的对照，咖啡因通过夹住 的甲板的提高的渗透。

实施例1a——指/趾甲的渗透性研究

按实施例1相同的实验设置(但使用特比萘芬作为活性剂)进行另一 个渗透研究，并如上所述使用I类疏水蛋白(疏水蛋白C)

制剂：0.1％(w/v)疏水蛋白+10％(w/v)特比萘芬的60％(v/v) 乙醇/水的溶液；参照是10％(w/v)特比萘芬的60％(v/v)乙醇/水的溶 液。每个测试进行3个样品处理的平均。结果(图2显示)证明了在处理 2-10天后，疏水蛋白产生的明确增强作用(10天后的积累量：ca.83 mg/cm2，而只使用参照溶液的是ca 12mg/cm2)。

实施例2(比较例)——皮肤的渗透性研究

使用人表皮皮肤模型(EST-1000，Cell Systems，St.Katharinen， Germany)测量咖啡因通过皮肤的渗透。人皮肤的体外模型包括强化的多 层三维细胞培养物，所述培养物生长了14天并具有皮肤样性质。EST-1000 的细胞结构类似于天然的表皮，表现出基膜、增殖的角质形成细胞和具有 完整的屏障功能的角质层。

在具有聚碳酸酯膜的细胞培养物插入物中提供所述组织，所述聚碳酸 酯膜具有0.63cm²的表面和0.4μm孔径。细胞完全覆盖了膜，并在完全分 化后表现出暗白色的、干燥的表面。使用消毒的镊子可以方便的夹持插入 物。基于运送，通过将每个插入物放入6孔细胞培养皿的每个孔中，使皮 肤插入物平衡，所述孔含有1ml的维持培养基(由Cell Systems提供)。 在平衡4-12小时后，将测试物质应用于皮肤模型的干燥表面。通过在插入 物周围的培养基采样，并检测测试物质(在此为咖啡因)的浓度，测量用 于皮肤培养物表面的物质通过皮肤模型的渗透作用。

为了测试疏水蛋白增强咖啡因通过皮肤的渗透性的能力，选择下列实 验设置。从Sigma购买咖啡因，使用的浓度为10mg/ml(1％w/v)。SC3 是来自裂褶菌ATCC 44200的112个氨基酸的疏水蛋白，HBF II(在图中 称为HBF2)是来自里氏木霉(新名称：红褐肉座菌)ATCC 90557的86 个氨基酸的疏水蛋白。

实验设置：

对照：向未处理的皮肤模型应用50μl在50％EtOH/PBS中的1％咖 啡因。

预包被：用50μl 100μg/ml SC3或HBF II分别预处理皮肤培养物60 分钟，然后去除剩余的疏水蛋白溶液，并应用50μl在50％EtOH/PBS中 的1％咖啡因。

混合物：应用100μg/ml SC3或HBF II分别与50％EtOH/PBS中的 1％咖啡因的混合物，并应用50μl所述混合物至皮肤模型上。

在37℃和5％CO₂的细胞培养孵育箱内孵育48小时内，从每个孔以 不同的时间间隔(如表2和图1所示)取样100μl培养基，并通过HPLC 检测确定咖啡因的浓度。用100μl新鲜的培养基替代每次取样移出的培养 基。如表2所示的维持培养基的咖啡因浓度是每组两次独立的皮肤培养物 的平均值。

根据皮肤模型供应者的说明，通过MTT测定来确定测试样品对皮肤 培养物的细胞毒性。与只用PBS处理的培养物相比，皮肤模型中的细胞的 活力不受溶剂(50％乙醇，0.002％SDS)的影响。当1％咖啡因或1％咖 啡因/10μg疏水蛋白(分别是SC3或HFB II)用于皮肤培养物时，观察到 为对照培养物的活力的约50％的活力，显示出在200μg/ml的浓度下，疏 水蛋白本身是无细胞毒性的。皮肤模型的屏障功能可能不受降低的细胞活 力的显著影响，因为外层的角质形成细胞包括非活细胞。此外，通过比较 用1％咖啡因处理的皮肤培养物和用1％咖啡因加10μg疏水蛋白处理的培 养物，来确定渗透增强作用，根据在48小时后的实验末期所确定的，两者 都表现出相同的活力。

结果显示，SC3和HFB II都增强了咖啡因(1％w/v)通过人皮肤的 体外模型的渗透达21.5％(表2)。疏水蛋白与咖啡因的混合物具有比用 疏水蛋白预包被，并在应用疏水蛋白1小时后再应用咖啡因更好的渗透增 强效应，这对于混合疏水蛋白作为渗透增强剂的皮肤作用药物的潜在制剂 而言是有利的。对于渗透增强作用而言，II类疏水蛋白HFB II比I类疏水 蛋白SC3略微更有效。

表2：在存在疏水蛋白的条件下进行的皮肤渗透研究的结果

＊增强：相比不含疏水蛋白的对照，咖啡因(20mg/ml)渗透的 ％增加。

还参见显示了更多细节的图1A和图1B。