细胞培养方法、细胞培养装置、容器内的计数对象物的计数方法及计数用装置

摘要

通过进行培养容器内的细胞凝聚块的形成控制、凝聚块的分解控制，使细胞的增殖效率进一步提高。另外，可以在无需开放培养体系且不受细胞密度的限制的情况下计测培养容器内的细胞数。通过对培养容器施加外力，对培养容器内的细胞凝聚块的形成控制和凝聚块的分解控制的至少一方进行控制，由此进行细胞的培养。对培养容器施加外力通过从平置的培养容器的上面以规定的压入量按压搅拌构件、并使其以规定的速度沿水平方向移动来进行，由此对培养容器内的细胞凝聚块的形成和分解的至少一方进行控制。另外，提供一种计测密封容器内的液体中的计数对象物的个数的方法，其中，调节容器的至少一部分的厚度，以被调节的范围的至少一部分为测定对象范围，计测该测定对象范围内的计数对象物的个数。

说明书

技术领域

本发明涉及用于培养细胞、组织、微生物等的细胞的细胞培养方法、细胞 培养装置以及容器内的计数对象物的计数方法、计数用装置。

背景技术

近年来，在医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中，要 求在人工的环境下高效、大量地培养细胞、组织、微生物等。

在这种细胞的大量培养中，特别是在培养悬浮细胞时，通常使用具备搅拌 翼的培养槽的搅拌培养是较为普遍的。但是，特别是在容易受到外力损伤的细 胞或者边形成凝聚块边增殖的细胞的情况下，广泛应用不使用搅拌翼而将细胞 封入培养容器中，静置(细胞沉到底面的状态下)，进行培养，随着细胞的增 殖，转移到底面积较大的容器中或者增加容器个数的方法。但是，在该静置培 养中，存在当细胞凝聚块随着细胞的增殖而增大时，对各细胞的氧气和营养成 分的供给逐渐变得不足，增殖效率下降的问题。

另外，在转移容器时，虽然会先搅拌培养液而使氧气和营养成分的不均消 除，但是，存在因每次转移操作时对细胞产生的损伤而使增殖效率下降的问题。

另一方面，也广泛进行时常对培养容器进行搅拌的振荡培养。

例如，根据专利文献1中所述的细胞培养装置，能够以旋转、振荡等各种模 式使装载培养容器的台运动，从而能够对培养容器内的培养液进行搅拌。

另外，专利文献2和专利文献3中所述的细胞培养装置采用如下机制：使培 养容器内的液体培养基以不产生气泡的方式进行振荡，通过波动供给氧以使细 胞不产生损伤。

通过这些细胞培养装置的振荡方法，整个培养基被剧烈地搅拌，因此细胞 各自零散地分离，氧气和营养成分扩散到整体，能够充分地供给到各细胞。

另外，在这样的细胞培养中，需要配合细胞的增殖将培养液中的细胞的密 度维持在适当的范围内。

即，培养液中的细胞密度过大时，不能供给各细胞充分的氧气和营养，细 胞增殖效率下降。另外，培养液中的细胞密度过小也得不到充分的增殖效率。

因此，在细胞培养时，为了在培养中把握细胞密度，需要适当计测培养容 器内的培养液中的细胞数。

例如，专利文献4中公开了能够配合细胞的增殖适当维持培养液中的细胞密 度的细胞培养装置。

在使用这样的细胞培养装置进行细胞数的计测时，以往采用如下方法：从 与培养容器内相连的取样用口中采集含有培养细胞的培养液，加入规定的缓冲 液调节至适于测定培养液中的细胞的密度后，注入计数板中，通过人工或机械 读取其数量，从而计算细胞密度。

另外，专利文献5中公开了具备拍摄单元的培养装置。根据该培养装置，能 够定期获取细胞图像并保存。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第5057429号公报

专利文献2：国际公开2000/66706号小册子

专利文献3：日本特表2007-511231号公报

专利文献4：国际公开2008/136371号小册子

专利文献5：国际公开2007/052718号小册子

发明内容

但是，根据细胞种类的不同，细胞的增殖有时在细胞单个分散的状态下难 以进行，当各个细胞发生粘附而形成适当尺寸的凝聚块时，增殖效率提高。具 体而言，除了神经干细胞、胚胎干细胞、肝细胞、角膜干细胞、胰岛细胞等贴 壁细胞之外，还可以举出血细胞等悬浮细胞。

在这样的细胞的情况下，在以往的静置培养中，每次转移时会剧烈地搅拌 培养容器，因此，此时细胞单个分散，存在所谓细胞的增殖效率下降的问题。

另外，在利用专利文献1～3中所述的细胞培养装置等进行振荡培养的情况 下，也同样对培养基整体进行剧烈的搅拌，成为细胞在培养基中分散悬浮的状 态，因此，细胞难以形成适当尺寸的凝聚块，存在难以使细胞的增殖效率最佳 化的问题。

另外，在使用专利文献4中所述的细胞培养装置来计数培养液中的细胞的情 况下，需要从培养容器内采集培养液，从而使培养体系开放，因此，存在混入 杂菌等污染的风险。

另外，根据专利文献5中所述的培养装置，虽然可以获取细胞图像，但是难 以根据该图像准确地计测细胞数并得到细胞密度。

即，利用专利文献5中所述的拍摄单元对培养容器内的细胞进行拍摄时，通 过计测细胞图像的细胞数并用该细胞数除以该拍摄单元的视野内的培养液的容 积，可以计算细胞密度。

但是，在这样直接观察细胞容器内的细胞的情况下，如图24所示，当细胞 的密度大而细胞重叠时，不能准确地计测细胞数。另外，当细胞的密度过小时， 难以预测整体的密度，存在计算出的细胞密度的精度降低的问题。

在像这样使用拍摄单元直接计测培养容器内的细胞的情况下，与使用现有 的计数板进行实际测量的情况相比，计数板的厚度通常为0.1mm左右，与此相对 培养容器的厚度为1～2cm左右，其厚度达到100～200倍。

因此，自拍摄单元观察到的细胞数，即使是相同的体积密度也达到使用计 数板实际测量时的100～200倍。因此，培养容器内的细胞多相互重叠，通过直 接观测培养容器内的细胞来计测细胞数是很困难的。

因此，本发明人等进行了深入研究，结果，调节培养容器的厚度，使自拍 摄单元观察到的细胞数达到可计测的数量后，通过直接观测来计测培养容器内 的细胞数，由此成功地得到了与实测值接近的细胞密度。

本发明是鉴于上述情况而完成的发明，其目的在于，提供通过进行培养容 器内的细胞凝聚块的形成控制、凝聚块的分解控制而将凝聚块调节为适当的尺 寸，从而能够提高细胞的增殖效率的细胞培养装置及细胞培养方法。

另外，本发明的目的在于，提供能够在无需开放培养体系且不受增殖的细 胞密度的限制的情况下在培养环境下的任何密度范围内计测细胞数的容器内的 计数对象物的计数方法及计数用装置。

为了实现上述目的，本发明提供一种细胞培养方法，使用培养容器进行， 其特征在于，通过对培养容器施加外力，进行培养容器内的细胞凝聚块的形成 控制和凝聚块的分解控制的至少一方的控制，由此进行细胞的培养。

另外，本发明的细胞培养装置，为使用培养容器培养细胞的细胞培养装置， 其具有载置培养容器的装载台和以规定的压入量按压培养容器并能够以规定的 速度沿水平方向移动的搅拌构件，使搅拌构件移动而对培养容器施加外力，由 此对培养容器内的细胞凝聚块的形成和分解的至少一方进行控制。

另外，本发明的容器内的计数对象物的计数方法，用于计测密封容器内的 液体中的计数对象物的个数，其中，调节容器的至少一部分的厚度，以被调节 的范围的至少一部分作为测定对象范围，计测该测定对象范围内的计数对象物 的个数。

另外，本发明的容器内的计数对象物的计数方法中，搅拌容器的液体，使 液体中的计数对象物均等化后，对容器的至少一部分的厚度进行调节。

另外，本发明的计数用装置，为用于对密封容器内的液体中的计数对象物 的个数进行计测的计数用装置，其具有装载容器的装载台和将容器的包含测定 对象范围的至少一部分调节至规定厚度的调节构件。

另外，本发明的计数用装置还可以进一步具有如下构成：具备在利用调节 构件调节容器的厚度之前对容器内的液体进行搅拌的搅拌构件。

另外，本发明的计数用装置还可以进一步具有如下构成：具备：拍摄单元， 其对容器内的计数对象物进行拍摄；计数单元，其对拍摄到的图像内的计数对 象物的个数进行计测；和驱动装置，其当计数单元的计测结果为计数对象物的 个数不在规定的范围内时，驱动调节构件，将容器的至少一部分调节至规定的 厚度，以使图像内的计数对象物的个数达到规定的范围内。

发明的效果

根据本发明，在进行细胞、组织、微生物等的细胞培养时，能够将凝聚块 调节至适当的尺寸，从而能够提高细胞的增殖效率。

另外，根据本发明，能够在不开放培养体系且不受增殖的细胞密度的限制 的情况下计测细胞数。

附图说明

图1是表示本发明的第一实施方式的细胞培养装置的构成的图。

图2是表示本发明的第一实施方式的细胞培养装置中的驱动装置的构成的 图。

图3是本发明的第一实施方式的细胞培养装置的概略侧视图。

图4是表示本发明中的细胞凝聚块的形成和细胞凝聚块的分解的图。

图5是表示本发明的第二实施方式的细胞培养装置的构成的图。

图6是表示本发明的第三实施方式的细胞培养装置的构成的图。

图7是表示本发明的容器内的计数对象物的计数方法的原理的图。

图8是表示本发明的第四实施方式的计数用装置的构成的图。

图9是表示利用本发明的第四实施方式的计数用装置的容器的厚度调节方 法(减小厚度的情况下)的图。

图10是表示利用本发明的第四实施方式的计数用装置的容器的厚度调节方 法(增加厚度的情况下)的图。

图11是表示本发明的第五实施方式的计数用装置的构成的图。

图12是表示本发明的第六实施方式的计数用装置的基本位置的图。

图13是表示本发明的第六实施方式的计数用装置的搅拌状态的图。

图14是表示本发明的第六实施方式的计数用装置的厚度调节和等待沉淀的 状态(减小厚度的情况下)的图。

图15是表示本发明的第六实施方式的计数用装置的显微镜观察状态的图。

图16是表示本发明的第六实施方式的计数用装置的厚度调节和等待沉淀的 状态(增加厚度的情况下)的图。

图17是表示使用本发明的第一实施方式的细胞培养装置进行的搅拌条件的 种类的图。

图18是使用本发明的第一实施方式的细胞培养装置进行的各搅拌条件下的 细胞状态的结果的归纳图。

图19是表示本发明的实施例1-5和比较例1中使用的培养容器的图。

图20是表示本发明的实施例1和比较例1中的细胞的图像的图。

图21是表示本发明的实施例1和比较例1的结果的图。

图22是表示本发明的实施例2～5中的细胞的图像的图。

图23是表示本发明的实施例2～5的结果的图。

图24是表示现有的容器内的计数对象物的计数方法的图。

具体实施方式

以下，参考附图对本发明的细胞培养方法和细胞培养装置的优选实施方式 进行说明。

[第一实施方式]

首先，参考图1～图4对本发明的第一实施方式进行说明。图1是表示本实施 方式的细胞培养装置的构成的图。图2是表示本实施方式的细胞培养装置中的驱 动装置的构成的图。图3是本实施方式的细胞培养装置的概略侧视图。图4是表 示本发明中的细胞凝聚块的形成和细胞凝聚块的分解的图。

[细胞培养装置10]

如图1所示，本实施方式的细胞培养装置10具有培养容器11、装载台13、搅 拌构件14，培养容器11的收容部11-1中封入有培养液(培养基)和细胞，并连接 有管12。

培养容器11是以软包装材料作为材料而形成为袋状的容器。这样，通过使 用软包装材料作为培养容器11的材料，可以对培养容器11赋予挠性、柔软性。 作为软包装材料，例如，可以使用日本特开2002-255277号公报(使用软包装材 料薄膜片材的食品包装体和食品的取出方法)、日本特开2004-323077号公报(加 压提取型的袋状容器)中记载的软包装材料等。

另外，培养容器11具有细胞培养所需的透气性，并且为了能够确认内容物， 一部分或全部具有透明性。作为满足这样的条件的培养容器的材料，可以列举 例如：聚烯烃、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、苯乙烯类弹性体、聚酯类热塑性弹性 体、硅酮类热塑性弹性体、硅酮橡胶等。

管12用于将培养容器11内的培养液和细胞从外部注入或者回收到外部，培 养容器11四面的各边进行了密封，但连接有至少2根以上的管12。其中1根用于 从外部向培养容器11内注入培养细胞、培养基的注入用途，另外1根用于从培养 容器11中回收培养细胞、培养基的回收用途。另外，如图1所示，安装有3根管 12时，第3根可以用于从培养容器11中将培养细胞、培养基作为样品取出的取样 用途。

作为该管12的材质，根据使用环境适当选择即可。例如可以使用硅酮橡胶、 软质氯乙烯树脂、聚丁二烯树脂、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚氯乙烯树脂、聚 氨酯类热塑性弹性体、聚酯类热塑性弹性体、硅酮类热塑性弹性体、苯乙烯类 弹性体、例如SBS(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯)、SIS(苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯)、 SEBS(苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯)、SEPS(苯乙烯-乙烯-丙烯-苯乙烯)、聚烯 烃树脂、含氟树脂等。

装载台13是用于在其上面载置培养容器11、再在该培养容器11的上面配设 搅拌构件14的平面的台。

在该装载台13的上面中，在载置培养容器11的部分的四角处竖立设置有固 定构件13-1。另一方面，在培养容器11的四角，穿设有嵌入(係入)固定构件13-1 的孔11-2。

通过使各固定构件13-1在培养容器11的各孔11-2中通过，可以将培养容器11 固定设置在装载台13的上面。另外，可以防止培养容器11随着搅拌构件14的移 动而偏移。

需要说明的是，固定构件不必限定于上述构件，只要具有可防止培养容器 11偏移的机构则可以使用各种构件。

搅拌构件14通过对培养容器11施加外力来控制培养容器11内的细胞凝聚块 的形成和细胞凝聚块的分解。

本实施方式的细胞培养方法中，如图3所示，在利用搅拌构件14以规定的压 入量按压培养容器11的同时，使该搅拌构件14以规定的速度与装载台13平行地 移动。该移动以规定的循环重复实行。作为该搅拌构件14，例如可以使用辊。

这样，根据本实施方式，通过使用搅拌构件14对培养容器施加外力，可以 对培养容器11内的搅拌进行微调节，从而能够进行适于细胞凝聚块形成的搅拌 和适于细胞凝聚块分解的搅拌。

如图1所示，支承台15由轴承部和连结这些轴承部的连结部形成，所述轴承 部在装载台13两侧的各一个部位朝向上方竖直设置，以可自由旋转的方式对搅 拌构件14的两端进行支承。

如图2所示，该支承台15通过安装于连接部下方的杆型电动气缸17(垂直方 向运动作用致动器)可上下移动，能够以0.1毫米级精细地调节在支承台15上安 装的搅拌构件14对培养容器11的压入量。

另外，杆型电动气缸17安装在滑动型电动气缸21(水平方向运动作用致动 器)上的移动台16上，相对于装载台13沿水平方向移动。另外，通过控制移动 台16的沿水平方向的移动速度来调节在支承台15上安装的搅拌构件14的移动速 度。

本实施方式的细胞培养装置10中的驱动装置，具有支承台15、移动台16、 杆型电动气缸17、滑动型电动气缸21等。

这样，根据本实施方式的细胞培养装置10，通过使用杆型电动气缸17和滑 动型电动气缸21来调节搅拌构件14对培养容器11的压入量、搅拌构件14的移动 速度，由此可以控制培养容器11内的培养液的搅拌，从而能够将细胞凝聚块的 尺寸调节至最佳尺寸。

需要说明的是，对于搅拌构件的操作控制，除了使用杆型电动气缸17、滑 动型电动气缸21这样的电动致动器外，还可以使用利用空气压、油压、电磁力 的致动器或者采用使用电动机、凸轮的构成。

<细胞凝聚块的形成>

这里，如图4所示，细胞培养时，根据细胞种类的不同，存在适于培养的细 胞凝聚块的尺寸。

即，培养细胞具有如下性质：单个细胞的分裂速度低，相互粘附形成一定 的凝聚块后才开始充分的分裂。

通常的静置培养中，在培养初期的细胞密度低的状态下，细胞通过扩散而 粘附逐渐形成凝聚块，但其速度比较慢。

因此，以往在培养初期，例如使用微孔板强制性地使细胞在一个部位高密 度地聚集而使细胞易于粘附，或者使用小容量的容器并随着细胞的增殖而使用 更大的容器，由此在防止细胞密度下降的同时进行培养。

与此相对，在本实施方式中，通过搅拌使漂浮于培养容器11内的底面的细 胞积极地移动，由此提高细胞之间发生粘附的概率，从而能够更快地形成适当 尺寸的凝聚块。

由此，根据使用本实施方式的细胞培养装置10的细胞培养方法，能够在细 胞培养开始时，在细胞单个分散的状态时，使细胞接触而促进适当尺寸的凝聚 块的形成，从而能够提高细胞增殖效率。

另外，这样的细胞凝聚块的形成控制并不限于培养的初期(接种时)，例 如在细胞的培养中对培养容器11施加过度的外力、结果导致凝聚块崩解、细胞 单个分散的情况下等也适合进行，能够提高细胞增殖效率。

<细胞凝聚块的分解>

另一方面，当细胞凝聚块过大时，凝聚块内部的氧气和营养不足，增殖效 率下降。

因此，当凝聚块巨大化时，优选在培养液中产生强流动(湍流)以使凝聚 块分解。

根据使用本实施方式的细胞培养装置10的培养方法，当凝聚块巨大化时， 通过调节搅拌构件14的压入量和移动速度，以使培养液中产生强流动的方式控 制搅拌，能够使凝聚块分解为适当的尺寸。

如以上所说明，根据本实施方式的细胞培养装置10和使用了该装置的细胞 培养方法，能够在利用搅拌构件14以规定的压入量按压培养容器11的同时，使 该搅拌构件14以规定的速度与装载台13平行地移动，从而能够适当地控制施加 在培养容器上的外力的强度。

因此，能够对培养容器11内的搅拌进行微调节从而进行适于细胞凝聚块形 成的搅拌，并且也能够以不使细胞单个分散的方式使凝聚块分解，从而能够将 细胞凝聚块调节至适于增殖的尺寸。

[第二实施方式]

下面，参考图5对本发明的第二实施方式进行说明。该图5是表示本实施方 式的细胞培养装置的构成的图。

本实施方式在以下方面与第一实施方式不同：在使用分隔构件将培养容器 11分割为培养部和可扩张部且可根据细胞的增殖将培养基容积调节至适当大小 的细胞培养装置10中，利用搅拌构件(搅拌辊)14可对培养部进行搅拌。另外， 本实施方式中，培养容器11的两端用夹子构件23固定。其他方面与第一实施 方式相同。

即，如图5所示，本实施方式的细胞培养装置10，使用分隔辊(分隔构件) 22对培养容器11进行分割，设有封入培养液和细胞的培养部以及用于使分隔辊 22移动以扩张培养部的容积的可扩张部。该分隔辊22与搅拌构件(搅拌辊)14 平行地设置，并能够与装载台13平行地移动。

通过使用这样的分隔辊22，可以使培养部的容积连续地变化，通过使分隔 辊22随着细胞增殖而移动使培养部的容积增加，可以将细胞密度维持在适当的 范围内。

在该图5的例中，采用了使用两个分隔辊22从上下方向夹住培养容器11而进 行分隔的构成，但并不限定于此，也可以采用通过一个分隔辊22从上方相对于 装载台13按压培养容器11而将培养容器11分隔为培养部和可扩张部的构成。

需要说明的是，使用这样的分隔构件控制培养容积以提高培养效率的技术， 详细地记载在由本申请人申请的国际公开2008/136371号小册子和国际公开 2008/136339号小册子中。

根据本实施方式的细胞培养装置10和使用了该装置的细胞培养方法，可以 使用分隔辊22控制培养容积的大小以获得高细胞增殖效率，并且可以调节培养 部中的细胞凝聚块的尺寸以获得高细胞增殖效率。

因此，能够进一步提高细胞的增殖效率。

[第三实施方式]

下面，参考图6对本发明的第三实施方式进行说明。该图6是表示本实施方 式的细胞培养装置10的构成的图。

本实施方式在以下方面与第一实施方式不同：拍摄培养容器11内的细胞并 自动判定凝聚块的尺寸是否在规定的范围内，基于该判定结果将凝聚块调节为 适当的尺寸。其他方面与第一实施方式相同。

即，本实施方式的细胞培养装置10，如图6所示，除第一实施方式的构成以 外，还具有拍摄装置30和控制装置40。

拍摄装置30从控制装置40接收到拍摄的指示信息时，对培养容器11内的细 胞进行拍摄，并将所得的图像发送到控制装置40。基于拍摄装置30的拍摄的指 示信息可以在规定的时机由控制装置40自动发送。

作为该拍摄装置30，例如可以在相位差显微镜的镜筒上安装CCD摄像头来 使用。

控制装置40是对细胞培养装置10中用于使搅拌构件14移动的驱动装置和拍 摄装置30进行控制的信息处理装置。如图6所示，控制装置40具有：拍摄装置控 制部41、凝聚块尺寸判定部42和驱动装置控制部43。

拍摄装置控制部41在规定的时机对拍摄装置30发送用于进行拍摄的指示信 息，并从拍摄装置30接收拍摄到的图像。

凝聚块尺寸判定部42在拍摄装置控制部41接收到图像时，判定该图像信息 中的细胞凝聚块的尺寸是否在规定的范围内。作为该规定的范围，例如可以设 定为100μm～600μm。作为该凝聚块的尺寸，可以使用拍摄到的凝聚块的平均值 等。

然后，判定的结果是，在细胞凝聚块的尺寸小于或大于规定范围的情况下， 将该判定结果输出到驱动装置控制部43。

驱动装置控制部43基于从凝聚块尺寸判定部42输入的判定结果，决定搅拌 构件14的压入量、移动速度和移动的循环，根据这些驱动条件对杆型电动气缸 17和滑动型电动气缸21进行控制。

由此，在细胞凝聚块的尺寸小于规定范围的情况下，使培养容器11内的细 胞凝聚块形成至适当的尺寸，在细胞凝聚块的尺寸大于规定范围的情况下，使 细胞凝聚块分解至适当的尺寸，由此可以调节至最适于增殖的尺寸。

需要说明的是，为了进行这样的处理，优选控制装置40或驱动装置控制部 43具有对应地存储各种凝聚块的尺寸和适于各情况的搅拌构件14的压入量、移 动速度和移动的循环的表格(table)等。

如以上所说明的那样，根据本实施方式的细胞培养装置10和使用了该装置 的细胞培养方法，能够自动地调节培养容器11的凝聚块的尺寸，从而能够稳定 地提高细胞增殖效率。

下面，参考图7对本发明的容器内的计数对象物的计数方法的原理进行说 明。

该图7是表示使用显微镜直接观察培养容器内的细胞并计测其数量的状态 的图，图7(A)表示以往那样不调节容器的厚度而进行观测的情况。需要说明 的是，通过使用比重小于细胞比重的培养液，能够使细胞沉到容器的底部而适 于显微镜观察。另外，相反地，也可以使用比重大的培养液使细胞聚集于容器 的上部来进行观察。

在图7(A)的情况下，随着容器内的细胞数的增加，当悬浮后静置时，会 逐渐发生重叠。因此，用该方法大量培养细胞时，难以准确地计测细胞数。

因此，本发明中，在细胞数过多而无法准确计测的情况下，如图7(B)所 示，通过减小容器的厚度，使观测范围(测定对象范围)内的细胞数减少，从 而调节至适于计测的细胞数。

由此，即使在利用培养容器大量培养细胞的情况下，也可以通过直接观察 培养容器内的细胞而无需开放培养体系来计测细胞数。

另外，在培养容器内的细胞数少、难以预测培养容器整体的密度的情况下， 也可以通过增大容器的厚度，使观测范围内的细胞数增加，从而调节至适于计 测的细胞数。

[第四实施方式]

下面，参考图8对本发明的第四实施方式的容器内的计数对象物的计数方法 和计数用装置进行说明。该图8是表示本实施方式的计数用装置的构成的图。

本实施方式的计数用装置50，如该图8所示，具有：厚度调节构件51、装载 台13、拍摄单元52、驱动装置53、驱动装置54和照明55，将培养容器11配置在 装载台13上，对培养容器11内的培养细胞数进行计测。

厚度调节构件51用于调节装载台13上的培养容器11的厚度。在该图8的例 中，厚度调节构件51由具有用于按压培养容器11的平面部分的按压板构成，通 过从上方按压由软包装材料制成的培养容器11的一部分，可以减小其厚度。

另外，厚度调节构件51中至少培养容器11的测定对象范围的上方部分由透 明的材料形成，通过照明55从上方照亮该部分，并通过由显微镜和CCD摄像头 构成的拍摄单元52从下方进行观察。

需要说明的是，厚度调节构件51并不限于图8所示的通过平面部分对培养容 器11进行按压的按压板，也可以使用辊、牵拉构件而构成。

例如，利用辊从上下两方或一方夹住培养容器11并移动，使培养容器11的 水平面积减少，由此可以增加培养容器11的厚度。相反地，通过增加培养容器 11的水平面积也可以减小培养容器11的厚度。另外，通过使用牵拉构件沿水平 方向拉伸培养容器11，也可以减小培养容器11的厚度。

装载台13是用于载置培养容器11的平面的台，与厚度调节构件51一起构成 计数用的装载装置。

该装载台13的测定对象范围的下方部分由玻璃板56等透明的构件构成，通 过拍摄单元52可以从下方观测培养容器11。

驱动装置53如图8所示，通过球头螺钉使厚度调节构件51上下移动。由此， 将厚度调节构件51向装载台13上的培养容器11按压，从而能够调节培养容器11 的厚度。

该驱动装置53例如可以使用杆型电动气缸(垂直方向运动作用致动器)， 由此，能够以0.01毫米级精细地调节培养容器11的厚度。

另外，驱动装置54如图8所示，通过球头螺钉使拍摄单元52相对于装载台13 沿水平方向移动。通过该驱动装置54，在对培养容器11内的细胞进行拍摄时以 外，使拍摄单元52配置于装载台13的外侧，在拍摄时可以使拍摄单元52移动到 培养容器11的测定对象范围的下方。

需要说明的是，驱动装置53、驱动装置54除电动致动器以外，可以使用利 用空气压、油压、电磁力的致动器而构成，或者也可以使用电动机、凸轮而构 成。

照明55透过厚度调节构件51照亮培养容器11中的测定对象范围，提供拍摄 单元52拍摄细胞所需的亮度。另外，此时光的透射量根据调节后的培养液的厚 度而不同，拍摄的图像会产生明暗差，因此，优选根据培养液的厚度进行光量 的调节。

培养容器11可以使用与第一实施方式同样的培养容器。

下面，参考图9和图10对利用本实施方式的计数用装置调节培养容器11的厚 度的例子进行说明。图9表示减小容器厚度的情况，图10表示增加容器厚度的情 况。

在减小培养容器11的厚度的情况下，容器的厚度调节除图8所示的方式以 外，例如，如图9(a)所示，可以通过从培养容器11的下方按压厚度调节构件 51来进行。需要说明的是，虽未进行图示，此时优选用玻璃板等将培养容器11 的上面的位置固定。

另外，在培养容器11由可水平拉伸的材料制成的情况下，如图9(b)所示， 也可以使用可覆盖培养容器11的整个面的厚度调节构件51按压培养容器11来减 小培养容器11的厚度。另外，如图9(c)所示，也可以利用厚度调节构件51拉 伸培养容器11来减小其厚度。在该情况下，可以采用将培养容器11的边缘的一 端固定同时利用由牵拉构件构成的厚度调节构件51牵拉水平方向相反侧的边缘 的构成，或者也可以采用通过使用两个厚度调节构件51牵拉培养容器11的水平 方向的两端来拉伸培养容器11的构成。作为这样的柔软的培养容器11的材料， 例如可以使用硅酮橡胶等。

另外，如图9(d)所示，也可以使用辊等作为厚度调节构件51，通过使其 移动，使培养容器11的水平面积增加，从而减小培养容器11的厚度。

另一方面，在增加培养容器11的厚度的情况下，例如，如图10(e)所示， 可以利用厚度调节构件51按压培养容器11的上面的一部分，使培养容器11的被 按压部分以外的部分的厚度增加。

另外，如图10(f)所示，也可以使用辊等作为厚度调节构件51，通过使其 移动，使培养容器11的水平面积减小，从而增加培养容器11的厚度。

下面，参考图8更详细地说明本实施方式的容器内的计数对象物的计数方 法。

首先，在计测培养容器11内的细胞数的步骤之前，优选对培养容器11内的 培养液进行搅拌。需要说明的是，关于培养液的搅拌单元，在第五实施方式中 详细说明。

然后，使用驱动装置54，使拍摄单元52移动到培养容器11的测定对象范围 的下方。

然后，使用驱动装置53，使厚度调节构件51下降，将培养容器11的厚度调 节至规定的厚度。

此时，规定的厚度可以通过细胞的种类、培养容器的尺寸、测定对象范围 的面积和培养时间等获得各种值。

然后，利用照明55照亮测定对象范围，并利用拍摄单元52进行拍摄。然后， 计数拍摄到的图像上的细胞。此时，从拍摄单元52向计数单元发送拍摄到的图 像，由该计数单元可以自动计测细胞数。作为这样的计数单元，可以使用公知 的细胞计数分析装置、细胞数计测装置等。

这里，本实施方式中，通过使用比重小于培养细胞的培养液，使培养细胞 沉淀到培养容器11的底部，通过使拍摄单元的焦点对准沉淀的细胞可以对它们 进行拍摄。但是，在细胞密度大、测定对象范围内的细胞重叠的情况下，无法 准确地计数细胞数。

因此，本实施方式的容器内的计数对象物的计数方法中，在像这样测定对 象范围内的细胞重叠的情况下，通过使厚度调节构件51移动而减小培养容器11 的厚度，从而减少计测对象的细胞数，可以计测细胞。

需要说明的是，可以认为测定对象范围中不重叠而能够观测的最大细胞数 约为小于用测定对象范围的面积除以培养细胞的平均水平面积而得到的数。因 此，在细胞计数的结果是细胞数计算为该最大细胞数以上的情况下，优选进一 步减小培养容器11的厚度再次进行计数。另外，也可以更准确地推断出细胞在 测定对象范围内紧密排列时的数量，使用该推定值作为最大细胞数等，将其他 值用于判断是否进行培养容器11的厚度调节。

另外，在细胞计数的结果为细胞数小于一定值的情况下，由于所得的细胞 密度的精度降低，因此，优选增加培养容器11的厚度后再次进行计数。关于这 样的使培养容器11的厚度增加的计测用装置，在第六实施方式中详细说明。

如此计测测定对象范围内的细胞数时，通过用该细胞数除以测定对象范围 的容积，可以计算细胞密度。进而，通过用所得的细胞密度乘以培养容器11的 容积，可以计算培养容器11整体的细胞数。

这样的细胞密度和培养容器11整体的细胞数也可以由计数单元自动地计 算。

这样，根据本实施方式，即使在培养容器11内的细胞数多、直接观测培养 容器11时无法准确地计测细胞数的情况下，也可以通过减小培养容器的厚度来 计测细胞数，从而能够计算培养容器11内的细胞密度。

[第五实施方式]

下面，参考图11和图2对本发明的第五实施方式的容器内的计数对象物的计 数方法和计数用装置进行说明。图11是表示本实施方式的计数用装置的构成的 图。图2是表示第一实施方式的细胞培养装置中的驱动装置(搅拌构件用)的构 成的图，本实施方式中也可以使用同样的驱动装置。

本实施方式的计数用装置，除了第四实施方式的计数用装置的构成以外， 还具备搅拌构件。本实施方式中，通过使用该搅拌构件搅拌培养容器11内的培 养液，可以使细胞以易于观测的方式分散。其他方面可以与第四实施方式同样。

搅拌构件14通过在向培养容器11按压的同时进行移动，对培养容器11内的 培养液进行搅拌，从而使培养液中的培养细胞分散。作为该搅拌构件14，例如 如图11所示可以使用辊。

在该图11的例中，采用以下构成：通过利用搅拌构件14以规定的压入量按 压培养容器11，同时使该搅拌构件14以规定的速度和规定的循环与装载台13平 行地反复移动，对培养液进行搅拌。

如图11所示，支承台15由在装载台13两侧的各一个部位朝向上方竖直设置 的、可自由旋转地支承搅拌构件14的两端的轴承部和连结这些轴承部的连结部 形成。

另外，如图2所示，该支承台15通过安装于连接部下方的杆型电动气缸17(垂 直方向运动作用致动器)可上下移动，能够以0.1毫米级精细地调节安装于支承 台15上的搅拌构件14对培养容器11的压入量。

另外，杆型电动气缸17安装在滑动型电动气缸21(水平方向运动作用致动 器)上的移动台16上，相对于装载台13沿水平方向移动。另外，通过控制移动 台16的沿水平方向的移动速度来调节安装于支承台15上的搅拌构件14的移动速 度。

需要说明的是，对于搅拌构件14的操作控制，除了使用杆型电动气缸17、 滑动型电动气缸21这样的电动致动器外，还可以使用利用空气压、油压、电磁 力的致动器或者采用使用电动机、凸轮的构成。

根据本实施方式的容器内的计数对象物的计数方法和计数用装置，可以在 计测培养容器11内的细胞数之前，在以规定的压入量向培养容器11按压搅拌构 件14的状态下，使搅拌构件14沿水平方向进行一定时间的往返运动。

由此，可以对培养容器11内的培养液进行搅拌，从而能够使培养容器11内 的培养细胞以易于计数的方式分散。

[第六实施方式]

下面，参考图12～图16对本发明的第六实施方式的容器内的计数对象物的 计数方法和计数用装置进行说明。这些图是分别表示本实施方式的容器内的计 数对象物的计数方法中的计数用装置的基本位置(图12)、搅拌状态(图13)、 厚度调节和等待沉淀的状态(要减少所计数的细胞的情况下、图14)、显微镜 观察状态(图15)、厚度调节和等待沉淀的状态(要增加所计数的细胞的情况 下、图16)的示意图。

本实施方式的计数用装置，除了第五实施方式的计数用装置的构成以外。 还具备用于使培养容器11的厚度增加的厚度调节构件。其他方面可以与第五实 施方式同样。

以下，对于本实施方式的容器内的计数对象物的计数方法中的计数用装置 的操作顺序，将使培养容器11的厚度增加的操作和使培养容器11的厚度减少的 操作包括在内进行说明。

(1)基本位置

首先，参考图12对本实施方式的计数用装置的构成要素的基本位置进行说 明。

该图12中，在装载台13上设有显微镜观察用的观测孔，该观测孔的上部镶 嵌有构成装载台13的上面的一部分的玻璃板56。

培养容器11配置在装载台13上，该装载台13的观测孔的上方配置有厚度调 节构件51-1(按压板)。该厚度调节构件51-1向下方移动，按压培养容器11，使 其厚度减小。

另外，培养容器11的边缘的一端配置有厚度调节构件51-2(辊)，通过使其 移动，能够减小培养容器11的水平面积，从而增加厚度。

另外，培养容器11的上方配置有搅拌构件14(辊)，通过使该搅拌构件14 在向下方移动而按压到培养容器11上的状态下沿水平方向移动，可以对培养容 器11内的培养液进行搅拌。

另外，在基本位置时，装载台13的外侧配置有构成用于拍摄细胞的拍摄单 元52的显微镜52-1和CCD摄像头52-2以及照明55。

(2)搅拌状态

下面，参考图13对于在进行容器内的计数对象物的个数的计数之前对培养 容器11内的培养液进行搅拌的顺序进行说明。

首先，使搅拌构件14从图12的基本位置向下方移动，以规定的压入量按压 培养容器11。然后，使该搅拌构件14以规定的速度和规定的循环与装载台13平 行地反复移动。

由此，能够对培养容器11内的培养液进行搅拌，从而使培养液中的细胞均 等化。

(3)厚度调节和等待沉淀的状态(在减小厚度的情况下)

下面，参考图14对于使培养容器11的厚度减小从而使计数的细胞减少的顺 序进行说明。

首先，使搅拌构件14向上方移动而返回到图12的基本位置，并使厚度调节 构件51-1向下方移动，使培养容器的厚度减小。此时，通过厚度调节构件51-1对 包含装载台13的观测孔上的区域的培养容器11的一部分进行按压，将培养容器 11的测定对象范围的厚度调节至规定的尺寸。此时，在培养环境下，培养容器 11的厚度越小，越能够减少计数的细胞。

使培养容器11的厚度减小后，静置至培养容器11内的细胞进行沉淀。

(4)显微镜观察状态

下面，参考图15对进行细胞计数的顺序进行说明。

在使培养容器11的厚度减小的状态下培养容器11内的细胞进行了沉淀后， 如图15所示，使由显微镜52-1和CCD摄像头52-2构成的拍摄单元52以及照明55 从图12的基本位置沿水平方向移动，使拍摄单元52配置于观测孔的正下方，使 照明55配置于观测孔的上方。然后，通过CCD摄像头52-2对培养容器11内沉淀的 细胞进行拍摄。

将这样得到的图像输入到未图示的计数装置中，通过该计数装置测定图像 内的细胞数，用所得的细胞数除以测定对象范围(由CCD摄像头52-2观测到的培 养容器11的区域)的容积，由此可以计算培养容器11内的细胞密度。

由此，即使在培养容器11内的细胞增殖，在原来的厚度下沉淀时，发生重 叠而无法准确地计数的情况下，也能够通过调节培养容器11的厚度来进行计数， 从而能够在无需开放培养体系的情况下计算培养容器11内的细胞密度。

(5)厚度调节和等待沉淀的状态(在增加厚度的情况下)

另一方面，在培养的初期阶段等中，由于细胞数少，因此虽然可以计数， 但有时所得的细胞密度的精度降低。

因此，在观测到的细胞数少的情况下，如图16所示，使培养容器11的厚度 增加，使测定对象范围内的细胞数增加后，进行(4)中说明的显微镜观察。

即，在(2)的搅拌后，使搅拌构件14向上方移动而返回到图12的基本位置， 使由辊构成的厚度调节构件51-2沿测定对象范围方向移动而对培养容器11进行 按压，使培养容器11的厚度增加。此时，为了使培养容器11中的测定对象范围 的厚度保持一定，使厚度调节构件51-1移动至测定对象范围上与培养容器11的上 面接触的位置。然后，静置至培养容器11内的细胞进行沉淀。

由此，能够使测定对象范围内的细胞数增加，在培养容器11内的细胞数少 的情况下，能够更准确地计算细胞密度。

培养容器11内的细胞数少时的具体的细胞数，根据细胞的种类、测定对象 范围的面积等适当决定，例如可以设定为0或小于10等数。

需要说明的是，按照上述(1)～(5)的顺序调节了培养容器11的厚度后， 在测定对象范围内观察到细胞的重叠、或者未观察到细胞或几乎观察不到细胞 的情况下，再次按照(1)～(5)的顺序调节培养容器11的厚度，再进行细胞 数的计数。

由此，根据本实施方式，在培养容器11内的细胞数少、直接观测培养容器 11时可能得不到准确的细胞密度的情况下，通过使培养容器的厚度增加，能够 更准确地计算培养容器11内的细胞密度。

实施例

下面，对使用第一实施方式的细胞培养装置10进行细胞培养的实施例进行 说明。首先，参考图17和图18对各种培养条件和各情况下的搅拌的程度进行说 明。图17是表示使用本实施方式的细胞培养装置10进行的搅拌条件的种类的图， 图18是各搅拌条件下的细胞状态的结果的归纳图。

本发明的培养方法中，如图17所示，使用搅拌构件14从上方按压培养容器 11，使该搅拌构件14相对于装载台13平行地移动，由此对培养容器11内的培养 基进行搅拌。

将该搅拌构件14向培养容器11按压时的压入量，可以取各种值，但例如如 该图17所示，在培养容器11的厚度为10.5mm的情况下，可以取2mm、4mm、6mm、 8mm等值。

然后，根据各压入量分别调节搅拌构件14的移动速度，由此将培养容器11 内的培养液的搅拌控制为适于细胞凝聚块的形成的搅拌或适于细胞凝聚块的分 解的搅拌。

作为搅拌构件14的移动速度，例如如该图17所示，可以取2.5mm/秒、12.5mm/ 秒、50mm/秒等值。

需要说明的是，对搅拌构件14的直径没有特别限定，但为了准确地控制搅 拌，优选相对于培养容器11的厚度设定为0.5倍～3.0倍。

图18表示在上述的搅拌条件下进行搅拌时，培养容器11内的培养液分别被 搅拌至何种程度。

如该图18所示，压入量为2mm且移动速度为2.5mm/秒、12.5mm/秒时和压入 量为4mm且移动速度为2.5mm/秒时，培养容器11内的细胞全部为沉淀状态。

本说明书中，将这样的搅拌称为“弱搅拌”。通过进行这样的“弱搅拌” 的搅拌，可以促进细胞凝聚块的形成。

另外，图18中，当压入量为2mm且移动速度为50mm/秒时、压入量为4mm 且移动速度为12.5mm/秒、50mm/秒时、压入量为6mm且移动速度为2.5mm/秒、 12.5mm/秒时以及压入量为8mm且移动速度为2.5mm/秒时，培养容器11内的培养 液被搅拌至一定程度，但细胞几乎为沉淀状态。另外，当压入量为6mm且移动 速度为50mm/秒时和压入量为8mm且移动速度为12.5mm/秒时，培养容器11内的 培养液被搅拌至一定程度，但细胞基本都上浮。

本说明书中，将这样的细胞为基本沉淀的状态和基本上浮的状态的边界附 近的搅拌条件下的搅拌称为“中搅拌”。通过进行这样的“中搅拌”的搅拌， 可以使细胞凝聚块不过度分解而调节为适当的尺寸。

另一方面，在图18中，当压入量为8mm且移动速度为50mm/秒时，培养容器 11内的培养液被剧烈地搅拌，细胞全部上浮。本说明书中，将这样的细胞全部 上浮的搅拌称为“强搅拌”。这样的“强搅拌”时，细胞凝聚块分散地分解为 单个的细胞，通过反复进行“强搅拌”，细胞成为悬浮状态，但细胞成为单个 分散的状态时增殖效率反而下降。

以往的细胞培养中的搅拌，通常是对培养容器进行剧烈的搅拌，结果相当 于进行了“强搅拌”，存在导致增殖效率下降的问题，但通过本发明可以消除 这样的问题。

下面，对通过本发明的容器内的计数对象物的计数方法和计数用装置调节 培养容器11的厚度后计测细胞数的实施例、和不调节培养容器11的厚度而计测 细胞数的比较例进行说明。

(实施例1)

作为培养容器11，使用了LDPE(线性低密度聚乙烯)制、膜厚0.15mm的袋。 培养容器11如图19所示，通过用分隔构件(橡胶辊)进行分隔，使进行培养的 区域即培养部的长边为250mm、短边为210mm，在该培养部中加入培养液640ml 进行使用。需要说明的是，此时的培养容器11平置时，尽管容器上面不是完全 的水平面，但容器厚度约为16mm。观察范围(测定对象范围)的水平面的尺寸 为边长0.5mm的正方形。

使用细胞科学研究所的AlyS505N-0培养基作为培养液，并且使用在细胞培 养用皿(dish)中增殖为所需量的人白血病T淋巴瘤的Jurkat E6.1株作为培养细胞。

使用直径12mm的辊作为搅拌构件14，在压入量13mm、速度50mm/秒、往 返次数10次的搅拌条件下进行搅拌。

搅拌后，立即使由宽度50mm、厚度3mm、长度大于培养容器11的长边的丙 烯酸树脂板构成的厚度调节构件下降，将袋的厚度调节为3.1mm。然后，静置12 分钟后，对观测范围进行拍摄，进行细胞数的计数。另外，根据该细胞数和观 测范围的容积计算细胞密度。拍摄的照片示于图20，观测范围内细胞数、细胞 密度、实测密度和实测值比示于图21。

需要说明的是，实测密度通过利用现有方法，使用计数板(OneCell Counter (OneCell公司制))计测从袋中回收的培养液中的细胞数，用该细胞数除以观 测范围的容积而得到。

(比较例1)

使用与实施例1相同的培养容器11和培养液，在相同的搅拌条件下进行了搅 拌。

然后，不调节袋的厚度，静置60分钟后，对观测范围进行拍摄。由于未对 袋的上面进行按压，因此产生波状的凹凸，袋的厚度约为16mm。

在该情况下，可观察到细胞的重叠，无法进行细胞数的计数，也无法进行 密度的计算。其结果示于图20、图21。

(实施例2)

使用细胞密度与实施例1不同的培养液，并且计测细胞数时将袋的厚度设定 为11.0mm、将之后的静置时间设定为45分钟，除此以外，与实施例1同样地进行 实验。培养液和培养细胞的种类与实施例1相同，但在本实施例中使用培养细胞 数比实施例1少的培养液。其结果示于图22和图23。

(实施例3)

除了在计测细胞数时将袋的厚度设定为7.0mm、将之后的静置时间设定为30 分钟以外，与实施例2同样地进行实验。其结果示于图22和图23。

(实施例4)

除了在计测细胞数时将袋的厚度设定为4.0mm、将之后的静置时间设定为12 分钟以外，与实施例2同样地进行实验。其结果示于图22和图23。

(实施例5)

除了在计测细胞数时将袋的厚度设定为3.1mm、将之后的静置时间设定为12 分钟以外，与实施例2同样地进行实验。其结果示于图22和图23。

如图20和图21所示，在未调节袋厚度的比较例1中，细胞发生重叠，无法准 确地计数。需要说明的是，不能计数可以是实际上无法计算的情况以及计数结 果为规定值(在观测范围内能辨认的最大细胞数)以上的情况。

与此相对，在实施例1中，通过减小袋的厚度，可以计测细胞数，从而可以 计算培养容器11内的细胞密度。

另外，如图22和图23所示，在实施例2～5中，可知随着袋厚度的减小，所 计测的细胞数减少。另外，计算得到的细胞的密度均为与实测密度相比无显著 差异的密度。

因此可知，在细胞数多、无法计数的情况下，细胞密度越大时，则越多地 减少袋的厚度，由此能够对细胞进行计测。

由这些实验结果可知，根据使用本发明的计数用装置的容器内的计数对象 物的计数方法，可以在无需开放培养体系且不受细胞密度的限制的情况下计测 培养容器内的细胞数，可以计算细胞密度。

本发明不限于以上的实施方式，可以在本发明的范围内进行各种变形实施 是不言而喻的。

例如，可以进行以下适当变更：将培养容器11构成为以不产生角部分的方 式使角变圆的形状、或者使搅拌构件14不为圆柱状而使图17所示的截面为星形 等各种形状，以获得各种搅拌效果等。

另外，在上述实施方式和实施例中，以培养细胞作为计测对象，但不限于 此，例如也可以以浮游生物等其他有机体或无机物作为计测对象。培养容器内 的“液体”除培养液等液体外，也包括半流体。另外，可以使用比培养细胞的 比重大的培养液作为培养容器11内的培养液，由此能够使培养细胞位于培养容 器11内的上部，从而对其进行计数。另外，在上述实施方式和实施例中，不仅 可以计数细胞，也可以观察细胞的生育状态等。

产业实用性

本发明能够适用于需要培养大量细胞的生物医药、再生医疗、免疫疗法等 领域。