杀蛴螬类害虫的苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫蛋白

摘要

本发明涉及一种杀蛴螬类害虫的苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫蛋白，新菌株的保藏编号为CCTCC No.M2011267。本发明的菌株及其杀虫蛋白可用于制备防治蛴螬类害虫的制剂。本发明的菌株对蛴螬类害虫具有特异性杀虫活性，其杀虫晶体蛋白对我国主要地下害虫华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟均具有较好的防治效果。

说明书

技术领域

本发明属于害虫生物防治技术领域，具体涉及一种杀蛴螬类害虫的苏云金 芽孢杆菌新菌株及其杀虫蛋白，即苏云金芽孢杆菌新菌株B-Y7-1及其杀虫蛋白。

背景技术

蛴螬是鞘翅目金龟甲总科幼虫的通称，为害各种农作物、果树、林木和牧 草等植物，是地下害虫中种类最多、分布最广和为害最重的一大类群，也是国 内外公认的难防治的土栖性害虫。据调查统计，植物地下部分受害的86％是由 蛴螬危害造成的。每年全国蛴螬发生面积约1亿亩，严重年份曾达3亿2千万 亩，产量损失达20％～40％，全国尤以黄淮流域受害最为严重。我国已经记载的 蛴螬种类有100余种，其中常见的有30余种，其中以华北大黑鳃金龟(Holotrichia  oblita Faldermann)、暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela Motschulsky)、铜绿丽金 龟(Anomala corpulenta Motschlsky)等发生普遍而严重。在蛴螬的防治上化学 农药发挥了一定的作用，但化学农药易造成严重的环境污染和生态平衡的破坏， 同时化学农药在食物中的残留和累积，不仅危害人体健康，而且不利于社会的 可持续发展。而生物防治具有不污染环境、对人畜安全和害虫不易产生抗性等 优点，因此，开发新的生物防治技术是当前害虫综合治理亟待解决的问题。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布极其广泛的 革兰氏阳性细菌，它在形成芽孢的同时，能产生对多种昆虫、螨类和原生动物 等具有特异活性的蛋白性质的伴孢晶体，由于其杀虫晶体蛋白(Insecticidal  crystal proteins，简称ICPs)对目标害虫高效专一，对非靶标生物安全和对环境 无污染。因此，Bt已广泛用于防治农林、仓贮和卫生等方面的害虫，是目前国 内外产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，其杀虫晶体蛋白也是目前应用 最为广泛和最有潜力的一类抗虫蛋白。20世纪80年代以前，有关Bt的研究和 应用大多集中在对鳞翅目害虫的防治上，自Ohba等(1992)筛选获得了一株对 多种金龟子幼虫具有特异杀虫活性的Bt新菌株Buibui后，近年来对金龟子类幼 虫具有活性的Bt菌株的研究和开发引起了人们的关注。目前国际上已相继分离 了一些杀金龟子类害虫的Bt菌株，如冯书亮等(2000)分离了对黄褐丽金龟 (Anomala exoleta)和铜绿丽金龟等具有杀虫活性的Bt分离株HBF-1，Yu等 (2006)分离了对暗黑鳃金龟具有活性的菌株Btl85。但目前成功防治蛴螬类害 虫的Bt菌株及其产品数量还相对较少，因此，筛选分离出具有更高效杀虫效果 的苏云金芽孢杆菌，发掘新型、高效和广谱的杀虫蛋白，对于蛴螬类地下害虫 的防治具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种杀蛴螬类害虫的苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫 蛋白，即苏云金芽孢杆菌菌株B-Y7-1，及其杀虫晶体蛋白，以弥补现有技术的 不足。

本发明的一个方面涉及苏云金芽孢杆菌新菌株Bacillus thuringiensis B-Y7-1，其于2011年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC No.M2011267。

本发明筛选的菌株，用于制备防治蛴螬类害虫的活菌制剂。

本发明的另一个方面涉及一种从新菌株中分离的杀虫晶体蛋白，其蛋白的 氨基酸序列SEQ ID NO：1。

本发明的杀虫蛋白用于制备防治蛴螬类害虫的制剂。

本发明的菌株分离自山东省烟台地区土壤，对蛴螬类害虫具有特异性杀虫 活性，其杀虫晶体蛋白与国内外报道的不同，作用对象也不相同，对我国主要 地下害虫华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟均具有较好的防治效果。

附图说明

图1：本发明的苏云金芽孢杆菌菌株B-Y7-1杀虫晶体蛋白SDS-PAGE图，

其中泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为B-Y7-1。

具体实施方式

实施例1苏云金芽孢杆菌菌株B-Y7-1的分离和生物学特性：

1.1土样来源

土样采集于山东省各地，选择荒草地、林地等非耕地的土壤采样，取地表 以下5～10em土壤约50g，装袋封口，编号并登记采集地点。

1.2培养基

菌株分离采用NGKG选择性培养基(NISSUI公司，日本)，3.975g NGKG 培养基加135mL蒸馏水，灭菌20min，冷却到50℃后加蛋黄液15mL(3mL 蛋黄液+12mL 0.85％生理盐水)，倒平板。菌株培养采用LB培养基(蛋白胨1％， 酵母粉0.5％，NaCl 1％，pH7.0)或牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.3％，蛋白 胨0.5％，pH7.0)，固体培养基添加1.3％～1.5％的琼脂。

1.3Bt菌株的分离

将1g土样悬浮于10mL无菌水中，剧烈震荡20min，然后静置5min。将 上层悬液稀释100倍，取80μL涂于NGKG选择性培养基平板上，30℃倒置培 养72h。用接种环挑外观似芽孢杆菌的单个菌落，用石碳酸复红染色后，镜检 有无伴孢晶体产生。将镜检到有伴孢晶体的菌落划线接种于LB平板培养基纯化 后，获得苏云金芽孢杆菌菌株。

1.4Bt菌株的培养和保藏

将单菌落接种于LB或牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，30℃培养3～4d后，置 于4℃冰箱，可短期保存三个月至半年。或将培养3～4d后产生的芽孢经无菌操 作制成孢子悬浮液，取100μL加入灭菌的沙土管中，充分混匀后置真空干燥器内 干燥，管口用石蜡密封，放于盛有氯化钙干燥剂的容器中，可长期保存。使用 时，从原始保藏菌种转接，接种于LB或牛肉膏蛋白胨培养基斜面上进行活化。

1.5Bt菌株B-Y7-1的生物学特性

Bt菌株B-Y7-1分离自山东省烟台地区，在LB或牛肉膏蛋白胨培养基上菌 落呈圆形、蜡质状、边缘不光滑，在15～40℃之间均能生长，最适生长温度为 27～32℃。营养体呈杆状，大小为3.2～5.2μm×1.2～2.0μm，单生或成链状， 革兰氏染色阳性，对甲基红正反应，乙酰甲基甲醇(V-P反应)正反应，在葡萄 糖、果糖、麦芽糖和可溶性淀粉中产酸。形成的芽胞囊呈长卵圆形，较营养体 略膨大；芽胞囊破裂后释放出游离的芽孢和伴孢晶体，芽孢呈卵圆形，大小为 2.0μm×0.8μm，伴孢晶体近方形，大小不等，伴孢晶体蛋白分子量为130kDa。

实施例2Bt菌株B-Y7-1菌液的制备和生物活性测定

2.1样品制备

挑取菌株B-Y7-1单菌落，接种于5mL的LB液体培养基中，30℃200r/min 振荡培养16～17h，取1mL培养液接种于100mL的LB液体培养基中，30℃200 r/min振荡培养约72h，显微镜下检查，待芽孢和晶体分离后，10000r/min离心 10min弃去上清液，用无菌水悬浮收集的菌体，制成菌液制剂备用。

2.2生物活性测定

以无菌水做对照，将5mL菌液与10g饲料(细土豆丝)以及90g灭菌土 混合均匀，放入直径为12cm和高度为9cm的塑料盒中，每盒接入3日龄的蛴 螬5头，每个处理6盒(共30头虫)，重复3次，置于室温下饲养，分别于7d 和14d检查死虫和活虫数，计算校正死亡率。结果表明，Bt菌株B-Y7-1对华 北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫均具有较高的杀虫活性，在浓度为6.7μg/g(蛋 白量与土的质量比)时，对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫14d的杀虫效果 分别达到86.7％和76.7％。

实施例3Bt菌株B-Y7-1伴孢晶体蛋白的生物活性

3.1蛋白样品的制备

挑菌株B-Y7-1单菌落，接种于LB液体培养基中，30℃200r/min培养约3～ 4d，待芽孢和晶体分离后，提纯伴孢晶体蛋白，测得的序列为SEQ ID NO：1。 蛋白碱解后用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，蛋白样品保存于-20 ℃，供生物活性测定用。

3.2伴孢晶体蛋白的生物活性

将纯化的伴孢晶体蛋白分别稀释成不同的浓度，分别将5mL不同浓度的蛋 白溶液与10g饲料(细土豆丝)以及90g灭菌土混合均匀，放入直径为12cm 和高度为9cm的塑料盒中，每盒接入3日龄的蛴螬5头，每个处理6盒(共30 头虫)，重复3次，置于室温下饲养，分别于7d和14d检查死虫和活虫数，计 算致死中浓度(LC₅₀)。活性测定的结果见表1。

表1伴孢晶体蛋白对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟的生物活性测定

结果表明，本发明的伴孢晶体蛋白对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟均具有 较好的杀虫效果，对华北大黑鳃金龟14d的LC₅₀为5.7μg/g，对暗黑鳃金龟14d 的LC₅₀为2.0μg/g。因此，本发明筛选出的苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫蛋白 具有明显的杀虫效果，具有广阔的应用前景。