一种农杆菌介导的培育转基因吴屯杨植株的方法

摘要

本发明涉及一种农杆菌介导的培育转基因吴屯杨植株的方法，本发明涉及一种利用基因工程技术培育吴屯杨抗逆新品种的方法，本发明取材方便，直接用吴屯杨叶片作为外植体，对影响基因转化的因素，即抗生素敏感性进行了优化，建立了吴屯杨高效遗传转化系统。为吴屯杨抗逆新品种的培育提供一种转化效率更高的方法，可缩短培育吴屯杨抗逆新品种的时间，为林木的遗传改良提供了一个新途径。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的培育转基因吴 屯杨植株的方法。

背景技术

杨树是重要的速生用材树种，在以往的研究中多以提高杨树产量为目标， 忽视了对其抗逆性等性状的改良。同时，环境不断恶化，杨树生产受到干旱、 盐碱等自然灾害的严重制约。目前，杨树在全世界及我国人工林中占有较大比 重，因此培育抗逆转基因杨树新品种具有十分重要的现实意义。自1987年 Fillatti等首次获得抗除草剂杨树基因工程植株以来，杨树基因转化研究已获 得了较大进展。白杨派已有银白杨的一些派间杂交种、毛白杨等获得了转基因 植株。但目前尚未有青杨派特别是吴屯杨(Populus wutunensis)转基因系统建 立的报告。

抗逆性速生吴屯杨是姜国斌^[1]教授的课题组在辽宁西部新民县大柳屯乡吴 屯村发现的一种被当地老百姓称之为“吴屯杨”的杨树无性系，在当地的自然 环境下高径生长表现优异。大连民族学院生命科学学院通过多年的试验地和盆 栽试验对比等研究，对被害率、苗木活力、苗木组织和细胞内离子分区及含量 分析、幼嫩组织ATPase活性的细胞化学分析、渗透调节物质含量、光合特性等 生理生化指标进行测定，确定了该树种的抗逆和速生等优良特性。吴屯杨具有 繁殖容易，育苗、造林成活率高，根系发达，适应性强，生长速度快、材质优 良等特点，是优良天然杂交种，可用于营造防护林，大、小径阶用材林等。2008 年12月，经专家认定，该品种通过了辽宁省林木品种审定。目前，抗逆性速生 吴屯杨已在在辽宁省西部的阜新蒙古族自治县、新民县以及大连等地推广应用。

发明内容

本发明直接用吴屯杨叶片作为外植体，取材方便。在已建立起的高效组培 再生体系的基础上，建立了以叶片为外植体的吴屯杨基因转化方法，为今后利 用转基因技术对吴屯杨进行遗传改良提供技术上的支持，同时也为林木的遗传 改良提供了一个新途径。

本发明的技术依据为：

草丁膦(Phosphinothricin，PPT)是一种非选择性、广谱、无残留的高效灭 生性除草剂，能强烈抑制植物叶片中谷氨酰胺合成酶(GS)的活性，导致细胞内 氨离子积累、破坏细胞结构而致植株死亡。bar基因能消除PPT对植物体的毒害 作用，它编码乙酰转移酶PAT，使乙酰辅酶A与草丁膦游离氨基结合，形成 AC-PAT复合物，使草丁膦失去活性，从而使植株具有PPT抗性。

农杆菌AGL0为目前在植物遗传转化中常用的一农杆菌品系，本发明使用的 农杆菌AGL0是由韩国生命工学研究院赠送，其含有质粒pCAMBIA3300，质粒 pCAMBIA3300上携带有上述bar基因^[2]作为筛选基因。因此，经农杆菌AGL0介 导转化的阳性植株便具有抗除草剂抗性，当用除草剂为筛选试剂来选择转化细 胞时，阳性的PPT抗性芽能够在筛选培养基上正常生长，而未成功转化bar基 因的假阳性苗则无法在筛选培养基上正常生长。

MS(Murashige and Skoog，1962)培养基，是植物组培的常用培养基，广泛 地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。本发明所用的植 物培养基均以MS为基本培养基，附加了不同浓度的激素。

本发明是通过如下步骤实现的：

a.将吴屯杨无菌苗的叶片沿垂直主脉切2～4个切口，切口深达主脉，正 面向上，放入预培养培养基中，光照培养2～3天，培养温度为25～27℃，光照 强度为3000～4000Lux，光照时间为16～18小时/天；

所述的预培养培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂 粉8g/L；

b.挑取农杆菌AGL0的菌落接种到含有卡那霉素50mg/L的10～15ml YEP 液体培养基中，于26℃下，200rpm震荡培养24小时，取10～100μl的菌液转 接至30～50ml的YEP液体培养基中，于26℃下，200rpm震荡培养至菌体OD₆₀₀达到0.8～1.0时，于4℃，12000rpm条件下离心5min得到菌体，用与离心前 等体积的MS液体培养基重新悬浮菌体，获得侵染菌液；

c.将步骤a获得的叶片浸入步骤b获得的侵染菌液中，于26℃下、100rpm 条件下，震荡10分钟，进行侵染；

d.步骤c获得的叶片，除去叶片上的多余菌液，转移到共培养培养基上， 暗培养2～3天，培养温度为25～27℃；

所述共培养培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+AS 200μmol/L+蔗糖 30g/L+琼脂粉8g/L；

e.步骤d获得的叶片，除去叶片上的多余液体，转移到初次筛选培养基上， 培养21天后，换到二次筛选培养基上，培养至分化出不定芽，所述的初次及二 次筛选培养温度为25～27℃，光照强度为3000～4000Lux，光照时间为16～18 小时/天；

所述的初次筛选培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+Cef400mg/L+ 0.8～1.0mg/L PPT+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

所述的二次筛选培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+Cef400mg/L +1.2～1.6mg/L PPT+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

f.待抗性芽伸长至2～5cm，将抗性芽接入生根培养基中，每瓶接种3株， 2周；

所述的生根培养基为：1/2MS+IBA 0.03mg/L+NAA 0.03mg/L+Cef 400mg/L+ PPT 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

g.CTAB法的全称是十六烷基三甲基溴化铵法(Hexadecyltrimethy  Ammonium Bromide)能够提取植物基因组DNA，属于一般分子生物学常规操作。 采用CTAB法提取转基因植株的DNA，作为被检模板，采用PCR(Polymerase Chain  Reaction)法对候选植株进行鉴定，所用引物如下：

上游引物：5’-CGGTCTGCACCATCGTCAACC-3’，

下游引物：5’-GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3’。

PCR反应条件：

94℃1min，68℃1min，72℃2min，35个循环；最后在72℃下继续延伸 10min。

PCR又称为“多聚酶链式反应”，是本领域技术人员公知的实验方法，根据 PCR引物以及PCR反应条件，本领域技术人员可依据常识确定PCR反应体系，扩 增出目的基因。

上述步骤e中初次筛选培养基的优选为：

MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Cef400mg/L+PPT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉 8g/L；

上述步骤e中二次筛选培养基的优选为：

MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Cef400mg/L+PPT1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉 8g/L。

有益效果：本发明与现有技术相比显著优点是：以吴屯杨叶片作为外植体 建立高效的吴屯杨遗传转化系统，在短时间内可选育出吴屯杨抗逆新品种。

附图说明

图1：初次筛选培养基上获得的PPT抗性芽；

图2：二次筛选培养基上获得的PPT抗性芽；

图3：转基因吴屯杨基因组PCR检测；

具体实施方式

下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和 材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或可以常规方法制备。

含bar基因的农杆菌AGL0：由韩国生命工学研究院赠送；

6-BA：6-Benzylaminopurine，6-苄氨基嘌呤，购自生工生物(上海)有限 公司；

NAA：1-naphthlcetic acid，a-萘乙酸，购自生工生物(上海)有限公司；

AS：Acetosyringone，乙酰丁香酮，购自生工生物(上海)有限公司；

Cef：Ceftriaxone，头孢曲松钠，购自生工生物(上海)有限公司；

PPT：Phosphinothricin，草丁膦，购自生工生物(上海)有限公司；

DL500DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；

Taq酶，dNTP及10×缓冲液均购自生工生物(上海)有限公司；

酵母提取物、蛋白胨、NaCl均购自生工生物(上海)有限公司；

YEP液体培养基(单位g/L)：酵母提取物：10；蛋白胨：10；NaCl：5。

MS培养基：购自Duchefa公司，商品号：M0222.0050，使用浓度为4.4g/L， 1/2MS培养基的浓度为2.2g/L。

实施例1

a.将作为转化外植体的吴屯杨无菌苗的叶片沿垂直主脉切3个切口，切口 深达主脉，正面向上，放入预培养培养基中，共50个叶片，每个培养皿接种9～ 11个叶片，共接种5个培养皿，光照培养2天，培养温度为26℃，光照强度为 3400Lux，光照时间为16小时/天；

上述预培养培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉 8g/L；

b.挑取带有bar基因的农杆菌AGL0的菌落接种到含有卡那霉素50mg/L的 10mlYEP液体培养基中，于26℃下，200rpm震荡培养24小时，取100μl的菌液 转接至30ml的YEP液体培养基中经过200rpm震荡培养，当菌体0D₆₀₀达到0.8 时，4℃条件下，通过12000rpm离心5min收集菌体，用30ml的MS液体培养基 重新悬浮菌体，获得侵染菌液；

c.将经步骤a处理的叶片全部浸入步骤b获得的30ml侵染菌液中，于26℃、 100rpm条件下，震荡10分钟，进行侵染；

d.侵染后的叶片放置在无菌的滤纸上，除去多余菌液，转移到共培养培养 基上，每个培养皿接种5个叶片，暗培养2天，培养温度为26℃；

上述共培养培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+AS 200μmol/L+蔗 糖30g/L+琼脂粉8g/L；

e.共培养后的叶片放置于无菌的滤纸上，除去多于液体，每个培养皿9～11 个叶片，转移到初次筛选培养基上，培养21天后收获15个抗性芽，将收获到 的15个抗性芽，每瓶接种5～6株换到二次筛选培养基上，培养至分化出不定 芽，共收获11个。

上述初次及二次筛选培养温度为26℃，光照强度为3400Lux，光照时间为 16小时/天；

上述初次筛选培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Cef400mg/L+PPT 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

上述二次筛选培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Cef400mg/L+PPT 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L。

图1为初次筛选培养基上获得的PPT抗性芽，其中(2)指向正常转化苗， (1)、(3)、(4)、(5)未见任何抗性芽生长。图2为二次筛选培养基上获得的 PPT抗性芽，其中(7)、(8)指向阳性转化苗，转化苗正常生长，根不断伸长， 顶芽缓慢生长，叶片逐渐伸展，叶面逐渐扩展；(6)、(9)指向假阳性苗，筛选 培养基中的PPT对叶片生长具有显著的抑制效应，使得假阳性苗不能生长、或 者在生长过程中逐渐死亡。

f.待抗性芽伸长至4cm，将11个抗性芽分别接入生根培养基中，每瓶接种 5～6株；经过温度为26℃，光照强度为3400Lux，光照时间为16小时/天的培 养，天后，获得抗PPT吴屯杨无性系5株。

上述生根培养基为：1/2MS+IBA 0.03mg/L+NAA 0.03mg/L+Cef400mg/L+PPT 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L。

g.利用以上已建立起来的吴屯杨转基因体系，得到了抗PPT吴屯杨无性 系5株。对所得5株PPT抗性吴屯杨无性系均作PCR检测。采用CTAB法提取5 株转基因植株DNA，作为被检模板，扩增目的基因片段。

根据bar基因编码区序列合成一对特异PCR引物，目标产物410bp：

上游引物：5’-CGGTCTGCACCATCGTCAACC-3’，

下游引物：5’-GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3’；

PCR反应体系：

候选植株DNA：     1μl

引物1：           1μl

引物2：           1μl

dNTP：            2μl

10×PCR缓冲液：   2.5μl

Taq酶：           0.25μl

无菌水：          12.25μl

反应总体积        20μl

上述候选植株DNA浓度为10ng/μl，引物1、引物2浓度为10μM，dNTP的 浓度为10μM。

PCR反应条件：

94℃1min，68℃1min，72℃2min，35个循环；最后在72℃下继续延伸 10min。

扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。采用CTAB法^[3]提取农杆菌AGL0的 质粒pCAMBIA做为阳性对照，以提取未转化植株叶片DNA做为阴性对照，进行 PCR鉴定。PCR产物经电泳分析，电泳结果如附图3所示，其中，M：DL500DNA Marker，CK⁺：阳性对照，CK^-：阴性对照，R1～R5：待检植株。从电泳图中可以 看出，在待检植株中，R1得到一条约为410bp的片段，与CK⁺阳性对照组所示的 条带大小基本一致，因此可以说明外源bar基因已经整合到吴屯杨基因组中， 初步确认R1为转bar基因阳性植株。而R2～R5植株基因组中没有扩增出对应 片段，为假阳性植株；

实施例2除草剂临界浓度的确定

由于用于基因转化的农杆菌AGL0带有bar基因，因此经农杆菌AGL0介导 转化的阳性植株便具有了抗除草剂抗性，以除草剂为筛选试剂来选择转化细胞， 为了确定吴屯杨对除草剂的抗性，进行了叶片对除草剂抗性的临界浓度的试验， 将均匀一致的叶片分别置于含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L PPT的培养基上： MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L，接种密度为每个培养 皿5个叶片，筛选培养温度为26℃，光照强度为3400Lux，光照时间为16小时 /天。观察叶片对一系列浓度梯度除草剂的反应，培养30天后进行统计，得到 除草剂临界浓度的确定。所述的对照培养基为：MS培养基附加了1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L。

  PPT浓度(mg/L)   叶片表现状况   0   深绿色，正常分化不定芽   0.5   部分失绿，分化不定芽   1.0   叶片变黄色，无不定芽分化   1.5   叶片变黄色，大部分坏死   2.0   整个叶片枯死   2.5   整个叶片枯死

实验证明：叶片对PPT非常敏感，低浓度的PPT就可抑制叶片不定芽的分 化。在不含PPT的对照培养基中，叶片都产生大量的丛生芽。随着PPT浓度的 增大，叶片变黄，进一步坏死，不定芽发生从多到少到完全不出芽。叶片在含 PPT0.5mg/L的筛选培养基上，产生少量不定芽，但不定芽的颜色淡黄，随着培 养时间的延长，不定芽多数死亡，当浓度为1.0mg/L时，叶片全部变黄，不能 分化出芽，因此PPT 1.0mg/L为叶片不定芽的临界浓度。

初次筛选时，如果PPT的浓度过高，不仅未转基因的细胞死掉，转基因的 细胞也会受其影响而死掉，二次筛选时转基因的细胞已长出很多，提高PPT的 浓度，使得未转基因的细胞快速死亡，转基因的细胞团正常生长。因此最优筛 选条件的PPT的选择为：初次筛选培养基选择PPT浓度1.0mg/L；二次筛选培养 基选择PPT浓度1.5mg/L。

参考文献：

[1]金华；姜国斌；王颖；马金龙；闫艳华.吴屯杨叶片组织培养获得再生植株的方 法[P].CN201010291353.3.大连民族学院.2011-01-26

[2]Raza Ahmad et al.，Stress-induced expression of choline oxidase in  potato plant chloroplasts confers enhanced tolerance to oxidative，salt， and drought stresses，Plant Cell Report，(2008)27：687-698.

[3]Porebski S，Bailey L G，Baum B R.Modification of CTAB DNA extraction  protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol  components.Plant Mol.Biol.Report，1997，15：8-15.