一株多菌灵降解木霉菌株及其制备方法

摘要

本发明为一株多菌灵降解木霉菌株及其制备方法。本发明所提供的生防菌株为木霉（Trichoderma sp.）Tr1，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.5210；该菌株是利用含有多菌灵的无机盐培养基，从受多菌灵污染的土壤中分离、筛选、培养获得的；应用该菌株的发酵菌液制得的微生物制剂，可用于防治植物真菌病害，同时对受到多菌灵污染的土壤进行生物修复。

说明书

技术领域

本发明属于生物高技术领域，涉及一种多菌灵农药残留降解木霉，是利用微生物的方法降解化学农药残留，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。

背景技术

多菌灵（Carbendazim，MBC）是一种广谱高效低毒的内吸性杀菌剂，化学名称为N-（2-苯并咪唑基）氨基甲酸甲酯，对各种农作物、瓜果蔬菜病害具有较好的防治效果，也是其他杀菌剂，例如苯菌灵、甲基硫菌灵等咪唑类杀菌剂的代谢中间产物。据统计，我国2006年农药需求总量（有效含量）为29.96万吨，其中多菌灵的需求量在0.8～1.0万吨。多菌灵在土壤和水中性质非常稳定，降解半衰期较长，在蔬菜、果品和土壤中残留与累积可通过食物链影响人体健康，例如导致染色体畸变，引起肝病等。2002年被我国列为环境激素类化学农药。因此，多菌灵在环境中的降解研究愈来愈受到人们的关注。

生物降解是去除环境中多菌灵残留的主要途径，目前已报道的多菌灵降解菌均为细菌类。现有的木霉菌类对多菌灵几乎没有降解功能，甚至在多菌灵污染严重的土壤中无法生存和繁殖。

发明内容

本发明目的是针对现有技术的不足，提供一株具有多菌灵降解作用的生防木霉菌株及其

制备和应用。

    本发明提供的一株可降解多菌灵的生防菌株为木霉（Trichoderma sp.）Tr1，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；保藏号为CGMCC No.5210，保藏时间为2011年9 月 1 日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所述的可降解多菌灵的木霉菌株（Trichoderma sp.）Tr1是利用含有多菌灵的无机盐培养基，从受多菌灵污染的土壤中分离、筛选、培养获得的。该菌株不仅对多菌灵具有良好的降解效果，对各种病原菌也具有一定的抑菌效果。该发明为获得降解多菌灵的木霉菌制品奠定了基础。

     本发明所述的可降解多菌灵的生防菌株木霉（Trichoderma sp.）Tr1的分离培养条件，包括下列步骤：

采集日照东港区三庄镇吉洼村某长期施用多菌灵的葡萄园耕作土层（10-30cm），称取土样10g，加到100ml多菌灵浓度为1000μg/ml的无机盐培养基中，28℃150r/min摇床培养7d，吸取10ml培养液转接到相同培养基中，培养7d，共连续转接5次。取1ml培养液，稀释10^-5，取200μl培养液均匀涂布于固体无机盐培养基（其中添加100μg/ml链霉素用于抑制细菌）中，28℃培养至平板上出现单菌落，将菌株转接到PDA平板（其中添加100μg/ml链霉素用于抑制细菌）上，28℃恒温培养，反复纯化至纯培养后，转接到无机盐培养基中继续摇床培养，利用HPLC检测菌株对多菌灵的降解能力，筛选对多菌灵降解能力最强的菌株进行保藏，即为保藏号为CGMCC No.5210的木霉（Trichoderma sp.）Tr1菌株。

    将上述培养筛选获得的菌株转接到PDA平板上，发现该菌株在PDA平板上菌落初期气生菌丝呈白色致密丛束状，边缘松散，呈发散状生长，背面初期无色，后期出现菌丝产孢区，颜色从浅绿渐至深绿色。分生孢子梗从菌丝侧枝生出，呈十字轮生排列，顶生分生孢子，分生孢子光滑，亚球形至卵形（图1）。通过一系列培养形状及光学显微镜观察，经鉴定为木霉属（Trichoderma sp.）。

    上述培养、筛选木霉（Trichoderma sp.）Tr1的培养基配方如下：

     无机盐培养基（g/L）：NaCl 1.0g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄NO₃ 1.0g，蒸馏水 1000mL，多菌灵（100mg/mL）10ml。

     固体无机盐培养基（g/L）：上述无机盐培养基中添加琼脂10g。

     PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂 15g，蒸馏水 1000ml。

     本发明所述木霉（Trichoderma sp.）Tr1的发酵生产方法如下：

    采用固体PDA培养基，将该木霉Tr1接种在试管培养基上，27-30℃下培养48h后，将培养好的木霉菌种转接到液体PDA培养基中，28℃摇床培养72h。将液体培养好的木霉菌株按照1%（v/w）的接种量转接到小麦培养基中，27-30℃扩大培养3d。清洗已培养好的木霉菌株，制成7×10⁹个/ml的木霉孢子悬浮菌液。

上述所得到的木霉孢子悬浮菌液可经常规工艺流程制成商品微生物制剂。

上述小麦培养基为将小麦用清水浸泡、煮沸所制得的液体小麦培养基。

具体配方实例如下：

称取1000g麦粒，清洗干净后，加10L清水浸泡过夜，第二天煮沸至不发硬为止，同时用手感觉麦粒不发粘，分装广口玻璃瓶40瓶，121℃，20min高压灭菌，两次。

应用本发明所述木霉（Trichoderma sp.）Tr1发酵菌液制得的微生物制剂，可用于防治植物真菌病害，同时对受到多菌灵污染的土壤进行生物修复。

附图说明

图1是木霉Tr1分生孢子梗及分生孢子

图2是多菌灵降解菌Tr1对各种病原菌的抑菌效果。1：Rhizoctonia solani；2：Phytophthora capsici；3：Verticillium dahliae Kleb；4：Phoma uvicola Berk；5：Bipolaris sorokiniana（Sacc.）hoemaker；6：Fusarium moniliforme Sheld

图3是木霉Tr1对含多菌灵土壤的生物修复。

具体实施方式

    实施例1.

    木霉（Trichoderma sp.）Tr1的培养及多菌灵降解能力检测

    将木霉Tr1转接到PDA（添加链霉素，100μg/ml）平板上，培养5D后，用无菌水冲洗孢子，制成10⁹个/ml孢子悬浮液，按照1%的接种量转接到无机盐培养基中，28℃摇床培养14D，以不接菌的多菌灵降解培养基为对照。培养完毕，按照体积比为1：4的比例在加入丙酮，混匀后，采用高效液相色谱法（HPLC）进行分析。流动相为乙腈：水＝18：82。流速为1ml/min，进样量10μl，可变波长检测器的工作波长为270nm，采用外标法按峰面积定量，按照下列公式计算多菌灵降解率：

    式中，X为降解率，A为未接菌处理液中多菌灵浓度，B为接菌处理液中多菌灵浓度。

该菌株14D内对多菌灵的降解率达到了55.47%，即14天降解了554.7mg，经条件优化，无机氮源替换成有机氮源（酵母粉，1.0g/L），培养温度为28℃，初始pH6.5，降解率达到了63%，即多菌灵降解了大约630mg。

    实施例2.

    木霉Tr1抑菌活性检测

    各种病原菌和木霉Tr1在PDA培养基上培养三天后，用灭菌打孔器取带菌丝的圆盘型培养基块，将圆盘型带有病原菌的培养基块放距PDA平板中央1.5cm处，将木霉Tr1的培养基菌块放在距病原菌菌块3.0 cm处，28℃下培养3天后记录抑菌带的宽度。计算木霉Tr1的抑菌率。实验中以市场上销售的木霉制剂LTR-2可湿性粉剂作为对照。

    上述病原菌为：Rhizoctonia solani，Phytophthora capsici，Verticillium dahliae Kleb，Phoma uvicola Berk，Bipolaris sorokiniana（Sacc.）hoemaker，Fusarium moniliforme Sheld

    结果见图2，由图2可知，木霉Tr1和LTR-2均对各种病原菌均有一定程度的抑制作用，Rhizoctonia solani，Phytophthora capsici，Verticillium dahliae Kleb几种病原菌，LTR-2的抑菌效果强于Tr1，而对Phoma uvicola Berk，Bipolaris sorokiniana（Sacc.）hoemaker，Fusarium moniliforme Sheld，木霉Tr1的抑菌效果稍强于木霉LTR-2，说明该发明中分离获得的木霉菌株Tr1不仅能够降解多菌灵，而且对各种植物病原真菌也具有一定的抑制效果。

   实施例3.

   多菌灵降解木霉菌对土壤的生物修复试验

取山东省科学院生物中心基地土壤，风干，过筛，检测土壤中多菌灵的含量。未发现筛选得到的土壤中含有多菌灵，分装，40g/瓶，121℃灭菌2h。按照表2进行土壤处理，搅拌均匀后，取1g检测多菌灵含量。以后每隔7天取样进行检测，共检测4周。其中多菌灵采用50％可湿性粉剂，每处理重复三次。采用HPLC检测土壤中的多菌灵含量，以不加木霉Tr1为对照。

注：“＋”，加入的克数为5g；“－”，不加入任何物质，最终克数为50g/瓶。

木霉Tr1对污染多菌灵的土壤生物修复试验结果见图3。

由图3可以看到，将木霉Tr1与灭菌土壤、多菌灵混匀后，发现随着时间的延长，土壤中的多菌灵含量明显降低，经木霉Tr1处理后的土壤28天后检测多菌灵含量在29.74%，降解率达到了43.96％。说明本发明中获得的木霉Tr1在土壤修复试验中起到了主要的作用。