哈茨木霉多菌灵抗性菌株的构建及其对水稻立枯病的防治

摘要

由于化学农药造成了严重的环境污染，生物农药越来越受到人们的关注。但是，生物农药防治效果较慢，使农业生产承担了很大的风险。因此，化学农药与生物农药复合使用已成为目前植物病害防治的一条新途径。哈茨木霉（Trichodermaharzianum）是一种优良的植物病害防治真菌，由于对苯并咪唑类杀菌剂的高度敏感性，限制了其与杀菌剂的复合使用。因此获得具有杀菌剂抗性的优良菌株，研究抗性菌株与杀菌剂协同作用防治植物病害，对新型菌药混配剂的开发和应用具有重要的理论与实践意义。
　　使用简并PCR和反向PCR方法，从哈茨木霉（T.harzianum）基因组DNA中扩增出了α-、β1-、β2-和γ-微管蛋白基因序列。BlastP比对结果显示，4条基因推测的氨基酸序列与其它真菌的相应氨基酸序列均具有较高的同源性，与粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）的同源性分别达93％、92%、92%和90%。通过序列分析确定了各微管蛋白氨基酸的保守结构域和典型基序的位置，对蛋白的二级结构和三级结构进行了预测。
　　采用PEG-CaCl2介导的原生质体法，成功地将BenR基因转化到哈茨木霉（T.harzianum）β2-微管蛋白基因位点，获得了具有多菌灵抗性的菌株。Southernblot分析结果表明，BenR基因已经整合到哈茨木霉（T.harzianum）基因组DNA中，并稳定遗传；抗性水平检测结果显示，抗性菌株可以在1500μg/mL的多菌灵浓度下生长，多菌灵抑制菌丝生长的有效中浓度达471.26μg/mL，抑制孢子萌发的有效中浓度达307.21μg/mL，比原菌株提高了1200倍以上。
　　对哈茨木霉（T.harzianum）抗性菌株的主要生物学特性进行了研究。结果表明，各抗性菌株的最适生长温度、最适产孢温度及分生孢子萌发的适宜温度均为25℃～30℃；各菌株对pH的适应范围较广，但偏酸性条件有利于菌丝生长、分生孢子产生及孢子萌发；光照对产孢具有明显的促进作用；在测定的多菌灵浓度下各菌株可以生长、产孢并孢子萌发，但随多菌灵浓度的升高逐渐降低；菌株TS1分生孢子产生的最佳固体发酵条件为：麸皮与秸秆比例为2∶1、培养基含水量为55%、接种量为25%，培养温度为26℃，在此条件下发酵产生的分生孢子可达15.42×108个/g；抗性菌株对噻菌灵、苯菌灵和甲基托布津表现正交互抗药性。
　　通过室内拮抗实验及室内防效测定，得出以下结论：哈茨木霉（T.harzianum）各抗性菌株抑菌谱广，对供试的8种植物病原菌均具有一定的抑制作用，其中抗性菌株TS1对水稻立枯病病原尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）和立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）菌丝生长抑制率分别达81.34%和86.19%；抗性菌株TS1与多菌灵复合处理对水稻苗期立枯病的室内防效最高，为82.25%，比单独处理分别提高了22.82%和11.24%。
　　生防真菌对水稻幼苗根部与抗病相关的主要防御酶的诱导研究表明，抗性菌株TS1和多菌灵复合处理的POD、PAL、PPO及SOD活性均高于对照，但除SOD外，各酶活性与用菌株TS1单独处理时相比无显著差异，这表明复合处理可以激发水稻的防卫反应，诱导系统获得抗性，但对酶活的诱导无普遍增效作用；与原菌株相比，哈茨木霉（T.harzianum）抗性菌株TS1对POD、PAL及PPO活性的诱导持续期延长。
　　研究了抗性菌株TS1与多菌灵复合处理对水稻苗期立枯病的田间防效及菌株TS1在水稻根际的定殖能力。结果表明，3种配比的复合处理对病害防治均具有增效作用，但配比不同增效程度不同，其中6∶4配比增效作用最显著，对尖孢镰刀菌（F.oxysporum）和立枯丝核菌（R.solani）的相对防效分别为87.80%和84.08%；根际定殖能力测定结果表明，菌株TS1可以在水稻根际和根表定殖；多菌灵对菌株的根际定殖能力在灭菌土壤中未表现出明显的促进作用。

目录

哈茨木霉多菌灵抗性菌株的构建及其对水稻立枯病的防治

CONSTRUCTION OF Trichoderma harzianum WITH CARBENDAZIM RESISTANCE AND IT’S RICE BLIGHT CONTROL

摘要

Abstract

第1章 绪论

1.1 课题研究的目的和意义

1.2 国内外研究综述

1.2.1 木霉菌生防能力的研究现状及意义

1.2.2 苯并咪唑类杀菌剂抗性发生的机理及抗性基因的利用

1.2.3 微管蛋白的结构与功能研究进展

1.2.4 丝状真菌遗传转化体系

1.2.5 水稻立枯病的特征及防治概况

1.2.6 植物诱导抗病性研究进展

1.2.7 菌药混配研究进展

1.3 存在的问题

1.4 课题来源及主要研究内容

1.4.1 课题来源

1.4.2 主要研究内容

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株及质粒

2.1.2 培养基

2.1.3 酶和试剂

2.1.4 仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 哈茨木霉微管蛋白基因家族部分成员的克隆与测序

2.2.2 融合PCR技术构建同源重组载体pMD-lbr

2.2.3 哈茨木霉多菌灵抗性菌株的获得

2.2.4 哈茨木霉抗性菌株主要生物学特性研究

2.2.5 抗性菌株TS1与多菌灵对水稻的诱导抗病性

2.2.6 抗性菌株TS1与多菌灵协同作用防治水稻苗期立枯病害

第3章 哈茨木霉微管蛋白基因的克隆及序列分析

3.1 哈茨木霉α-Tub基因的克隆及序列分析

3.1.1 α-Tub基因的扩增和测序

3.1.2 α-Tub基因的一级结构分析

3.1.3 α-微管蛋白的二级结构预测

3.1.4 α-微管蛋白的三级结构预测

3.2 哈茨木霉β1-Tub基因的克隆及序列分析

3.2.1 β1-Tub基因的克隆和测序

3.2.2 β1-Tub基因的一级结构分析

3.2.3 β1-微管蛋白的二级结构预测

3.2.4 β1-微管蛋白的三级结构预测

3.3 哈茨木霉β2-Tub基因的克隆及序列分析

3.3.1 β2-Tub基因的克隆和测序

3.3.2 β2-Tub基因的一级结构分析

3.3.3 β2-微管蛋白的二级结构预测

3.3.4 β2-微管蛋白的三级结构预测

3.4 哈茨木霉γ-Tub基因的克隆及序列分析

3.4.1 γ-Tub基因的克隆和测序

3.4.2 γ-Tub基因的一级结构分析

3.4.3 γ-微管蛋白的二级结构预测

3.4.4 γ-微管蛋白的三级结构预测

3.5 关于Tub基因克隆、序列分析及微管蛋白结构的讨论

3.5.1 关于Tub基因家族部分成员克隆的讨论

3.5.2 关于Tub基因序列及微管蛋白结构的讨论

3.6 本章小结

第4章 粗糙脉孢菌BenR基因在哈茨木霉中的转化

4.1 哈茨木霉对多菌灵的敏感性测定

4.2 质粒pBT6在哈茨木霉中的转化

4.2.1 哈茨木霉原生质体的制备与再生

4.2.2 质粒pBT6在哈茨木霉中的转化

4.2.3 转化子PCR检测

4.2.4 转化子Southern blot分析

4.2.5 转化子对多菌灵抗性水平检测

4.2.6 转化子的遗传稳定性检测

4.3 同源重组载体pMD-lbr的构建

4.3.1 片段TL、NB和TR的独立扩增

4.3.2 片段TL、NB和TR的融合反应

4.3.3 融合片段LBR的全长扩增

4.3.4 同源重组载体pMD-lbr的构建

4.4 携带BenR基因的同源线性片段在哈茨木霉中的转化

4.4.1 携带BenR基因的同源线性片段转化哈茨木霉

4.4.2 转化子PCR检测

4.4.3 转化子Southern blot分析

4.4.4 转化子对多菌灵抗性水平检测

4.4.5 转化子的遗传稳定性检测

4.5 关于粗糙脉孢菌BenR基因转化哈茨木霉的讨论

4.5.1 关于同源重组载体构建的讨论

4.5.2 关于BenR基因转化哈茨木霉的讨论

4.6 本章小结

第5章 抗性菌株主要生物学特性及室内拮抗作用研究

5.1 抗性菌株的主要生物学特性研究

5.1.1 菌落形态及菌体特征观察

5.1.2 环境因子对固体平板培养性状的影响

5.1.3 环境因子对分生孢子萌发的影响

5.1.4 抗性菌株分生孢子致死温度测定

5.1.5 菌株TS1分生孢子产生的固体发酵条件研究

5.2 多菌灵对抗性菌株生物学特性的影响

5.2.1 多菌灵对菌丝生物量的影响

5.2.2 多菌灵对产孢能力的影响

5.2.3 多菌灵对分生孢子萌发能力的影响

5.3 抗性菌株与其它杀菌剂的交互抗药性模式

5.4 抗性菌株对不同植物病原菌的室内拮抗作用

5.4.1 抗性菌株对植物病原菌的抑制效果

5.4.2 抗性菌株TS1对尖孢镰刀菌的室内拮抗作用

5.4.3 抗性菌株TS1对立枯丝核菌的室内拮抗作用

5.5 关于抗性菌株主要生物学特性及室内拮抗作用的讨论

5.6 本章小结

第6章 抗性菌株TS1与多菌灵协同作用防治水稻苗期立枯病害

6.1 多菌灵对水稻立枯病病原菌的毒力测定

6.1.1 多菌灵对尖孢镰刀菌的毒力

6.1.2 多菌灵对立枯丝核菌的毒力

6.2 抗性菌株TS1与多菌灵对水稻苗期立枯病的诱导抗病性

6.2.1 对尖孢镰刀菌的室内防治效果

6.2.2 水稻幼苗根部可溶性蛋白含量的变化

6.2.3 对水稻幼苗根部与抗病相关的防御反应酶的诱导研究

6.3 抗性菌株TS1与多菌灵对尖孢镰刀菌的田间防治效果

6.3.1 对尖孢镰刀菌的田间防治效果

6.3.2 秧苗素质分析

6.3.3 抗性菌株TS1在水稻根际定殖能力研究

6.4 抗性菌株TS1与多菌灵对立枯丝核菌的田间防治效果

6.4.1 对立枯丝核菌的田间防治效果

6.4.2 秧苗素质分析

6.4.3 抗性菌株TS1在水稻根际定殖能力研究

6.5 抗性菌株与多菌灵协同作用防治水稻苗期立枯病的分析

6.5.1 抗性菌株TS1与多菌灵对水稻立枯病的诱导抗病性

6.5.2 抗性菌株TS1与多菌灵对水稻苗期立枯病的田间防效

6.5.3 生防菌株的根际定殖能力分析

6.6 本章小节

结论

参考文献

附图

攻读学位期间发表的学术论文

哈尔滨工业大学博士学位论文原创性声明

哈尔滨工业大学博士学位论文使用授权书

致谢

个人简历