渝贵地区西瓜蔓枯病菌对多菌灵和苯醚甲环唑抗性监测及对多菌灵的抗性机理

摘要

由瓜类黑腐球壳菌（Didymella bryoniae）所引起的西瓜蔓枯病是一种世界性的西瓜病害之一，在我国各西瓜产区均有发生，造成重大经济损失。施用多菌灵、苯醚甲环唑等化学杀菌剂是其重要的防治手段，但长期单一使用某种化学药剂导致抗药性的产生，使得防治效果降低甚至防治失败，而国内在西瓜蔓枯病菌的抗药性研究方面报道较少，因此本文在渝贵地区采样并分离获得蔓枯病菌的基础上，开展了关于渝贵地区西瓜蔓枯病菌对多菌灵和苯醚甲环唑敏感性、两种主要防治药剂的抗性动态、田间抗性菌株的主要生物学特性以及西瓜蔓枯病菌对多菌灵的抗性机理方面的研究。通过该研究为多菌灵在蔓枯病菌上的抗性治理提供理论参考，同时为苯醚甲环唑的用药前景和策略提供理论依据。主要结果如下：
　　1.西瓜蔓枯病菌对多菌灵的敏感性基线以及田间抗性分布
　　本研究采用菌丝生长速率法测定了106株西瓜蔓枯病野生菌对多菌灵的的敏感性，结果表明多菌灵对西瓜蔓枯病菌的抑制中浓度 EC50值最大为0.9482μg/mL，最小0.5104μg/mL，不同敏感性的菌株分布频率呈连续的单峰曲线分布，平均 EC50值为0.7125±0.0842μg/mL，最低抑制浓度（Minimal inhibition concentrion,MIC）≦4.5μg/mL。据此，确定以0.7125±0.0842μg/mL为渝贵地区西瓜蔓枯病菌对多菌灵的敏感性基线；以含多菌灵10、50和100μg/mL分别作为田间低、中和高抗的区分剂量，对从重庆市的北碚区、武隆县、合川区、永川区和贵州省息烽县、修文县等6个区县所采集分离得到的591株菌株进行抗性监测，结果表明田间以抗性菌株为主，多菌灵抗性频率为69.2％，并且全部为高抗菌株。2014年，抗性频率最高的是重庆武隆，占94.7%、最低的地区为合川，占38.5%、2015年，抗性频率最高还是重庆武隆，为98.5%，最低地区是贵州修文，为2.4%，抗性发展最快的是合川，2014抗性频率为36.5%、到2015上升为86.9%。随机选取的19株抗性菌株测得的平均抗性倍数为358，以上结果说明西瓜蔓枯病菌的多菌灵田间抗性普遍且严重，应该停止使用多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂。
　　2.西瓜蔓枯病菌多菌灵抗性菌株的主要生物学特性
　　本研究将西瓜蔓枯病菌的多菌灵田间抗性菌株在无药剂选择压力的PDA培养基上连续培养8代，每隔一代测定一次抗性EC50值，通过比较不同代数之间的EC50值，结果表明田间抗性菌株的抗药性能稳定遗传。
　　抗性菌株在生活力、繁殖力等方面是否与敏感菌株具有显著差异，是判断抗性菌株环境适应性强弱的标准，也是进行抗性风险评价的标准之一。本研究比对了抗性菌株与敏感菌株在生活力、繁殖力、致病力以及不同温度对抗、敏菌株生长的影响的差异，结果发现抗性菌株在生活力、繁殖力和致病性方面与敏感菌株没有显著差异。在同一温度下，抗性菌株与敏感菌株的生活力没有显著差异，随着抗性的产生，菌株的温度耐受性没有发生改变，因此抗性菌株对环境的适应性没有下降。
　　本研究通过对多菌灵抗性菌株对不同类型的药剂的敏感性测定，交互抗性测定结果表明，西瓜蔓枯病菌对多菌灵的抗性、敏感菌株对乙霉威（Diethofencarb），戊唑醇(Tebuconazloe)、苯醚甲环唑（Difenoconazole）、醚菌酯（Kresoxim-methy）、咯菌腈（Fludioxonil）、啶酰菌胺（Boscalid）、甲基立枯磷（Tolclofos-methyl）都表现为敏感，而西瓜蔓枯病菌对多菌灵的抗性菌株对苯并咪唑类的甲基硫菌灵表现为抗性，平均抗性倍数为14.62倍，说明在所测的8种药剂中，只有多菌灵与甲基硫菌灵具有交互抗性，而与其他7种药剂之间没有交互抗性，可以在田间轮换使用。
　　4.西瓜蔓枯病菌对多菌灵的抗性机理
　　为了清楚西瓜蔓枯病菌多菌灵田间抗性菌株是否因为β-微管蛋白基因突变而导致抗性的产生。本研利用引物 GK-F1（5’-TGGTGCTGGTAACAACTG-3’）和GK-R1（5’-GTCCTCGACCTCCTTCAT-3’）对20个抗性菌株、12个敏感菌株β-微管蛋白基因进行扩增，测序后分别获得了抗性、敏感菌株的部分β-微管蛋白基因的碱基序列，通过抗性与敏感的比对后发现主要涉及8个碱基的突变，其他7个位点的突变没有引起氨基酸的突变，只有593位碱基由A变为C，相应的多菌灵抗性菌株的198位氨基酸由谷氨酸（Glu）变为了丙氨酸（Ala），这是西瓜蔓枯病菌对多菌灵产生抗性的分子机制。
　　5.西瓜蔓枯病菌对苯醚甲环唑的敏感性基线以及田间抗性分布
　　为了掌握渝贵地区西瓜蔓枯病菌对苯醚甲环唑的的抗性动态，本研究对所采集分离的全部菌株进行了抗性监测，而敏感性基线的建立是进行抗药性监测的基础，据此本研究采用菌丝生长速率法测定了101株西瓜蔓枯病菌野生菌株对苯醚甲环唑的的敏感性，结果表明苯醚甲环唑对西瓜蔓枯病菌的抑制中浓度 EC50值在0.01348-0.17061μg/mL之间，最大值是最小值的12.7倍。不同敏感性菌株的频率呈连续单峰曲线近正态分布，平均EC50值为0.05691±0.002890μg/mL，以此作为西瓜蔓枯病菌对苯醚甲环唑的敏感性基线；同时以15、50和100μg/mL浓度的药剂为区分剂量对重庆和贵州的西瓜蔓枯病菌进行田间抗性监测，结果表明田间以敏感菌株为主，检测到少量的低抗菌株和中抗菌株，频率分别为0.67%与2.03%，未检测到高抗菌株。
　　6.苯醚甲环唑抗性菌株的主要生物学特性
　　药剂抗性风险的评估的标准之一是对抗性菌株的生活力、繁殖力等方面与敏感菌株进行对比，判断其差异性。本研究在比对了抗性菌株与敏感菌株在生活力、繁殖力、致病力、不同温度对抗、敏菌株生长的影响，结果表明抗性菌株在生活力、繁殖力等方面与敏感菌株具有显著差异，抗性菌株的生活力、繁殖力显著弱于敏感菌株。在同一温度下，抗性菌株的生活力要显著弱于敏感菌株，随着抗性的产生，菌株的温度耐受性发生改变，说明抗性菌株对环境的适应性下降，发展为抗性群体的风险有所下降。
　　为了研究西瓜蔓枯病菌苯醚甲环唑的田间抗性菌株的抗药性是否能在无选择压力的条件下稳定遗传，在无药剂选择压力的PDA培养基上连续培养8代，每隔一代测定一次抗性 EC50值，结果表明田间抗性菌株的抗药性能稳定遗传。在日常使用化学药剂中，同类型的药剂应避免重复使用，本研究对苯醚甲环唑抗性菌株进行不同药剂敏感性的测定，交互抗性测定结果表明，西瓜蔓枯病菌的苯醚甲环唑的抗性菌株对乙霉威、戊唑醇，醚菌酯均表现为抗性，平均抗性倍数分别为15.54、79.4和63.7倍；而抗性菌株与敏感菌株都对咯菌腈、啶酰菌胺、甲基立枯磷表现敏感，说明苯醚甲环唑与乙霉威、戊唑醇、醚菌酯之间具有交互抗性，而与咯菌腈、啶酰菌胺、甲基立枯磷没有交互抗性，可以在田间交替使用。
　　本研究表明渝贵地区西瓜蔓枯病菌对多菌灵抗性普遍且严重，以多菌灵为代表的苯并咪唑类药剂已经不能有效控制该病害的发生，需要新的药剂替换；而对苯醚甲环唑则是敏感菌株为主，也出现少量敏感性下降的亚群体，表现为低抗和中抗，对该类药剂不应该长期使用，最好是与不同作用类型的药剂轮换使用，以延长苯醚甲环唑的使用年限。同时对西瓜蔓枯病菌的β-微管蛋白基因的研究表明，β-微管蛋白基因碱基的突变导致198位氨基酸由谷氨酸（Glu）变为了丙氨酸（Ala），这是西瓜蔓枯病菌对多菌灵产生抗性的分子机制。

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第一章 文献综述

1西瓜蔓枯病概述

2苯并咪唑类杀菌剂概况

3三唑类杀菌剂概况

4本研究的目的和意义

第二章 渝贵地区西瓜蔓枯病菌对多菌灵的抗性监测

1供试材料

2试验方法

3结果与分析

4讨论

第三章 多菌灵田间抗性菌株的主要生物学特性

1供试材料

2试验方法

3结果与分析

4结论与讨论

第四章 西瓜蔓枯病菌对多菌灵的抗药性机理

1供试材料

2试验方法

3结果与分析

4 结论与讨论

第五章西瓜蔓枯病菌对苯醚甲环唑的抗性监测

1供试材料

2试验方法

3结果与分析

4结论与讨论

第六章苯醚甲环唑田间抗性菌株的主要生物学特性

1供试材料

2试验方法

3结果与分析

4 结论与讨论

第七章结论与展望

结论

展望

参考文献

附录

致谢

学习期间发表的论文及参加课题