聚合酶链式反应鉴别熊胆粉真伪的方法

摘要

本发明为一种聚合酶链式反应鉴别熊胆粉真伪的方法，包括样品的基因组提取，用于扩增的样品的聚合酶链式反应引物，及扩增的聚合酶链式反应体系和扩增条件和扩增结果，聚合酶链式反应扩增产物的检测系统来鉴别熊胆粉样品的真伪；该鉴别方法简单可靠，减少假冒伪劣的中药材熊胆及其熊胆粉给患者造成的不良后果，对于提高中药质量，保障群众用药安全以及更好地开拓中药的国内外市场等方面都具有十分重要的意义。

说明书

技术领域

本发明为一种聚合酶链式反应鉴别熊胆粉真伪的方法。

技术背景

熊胆因珍稀名贵，市场价格昂贵，市场常有以鸡、牛、羊、猪胆汁干燥加工成粉混充熊胆粉出售现象，掺假现象极为严重。熊胆粉掺假除影响药品本身质量外，更重要的是影响中药的疗效及配伍而给患者造成不良后果，所以熊胆粉及其制剂真伪的鉴别在实际中拥有重要的意义。由于中成药的组成及成分复杂，干扰因素多，用传统生药学方法鉴定其真伪及纯度有较大的难度。而DNA水平上鉴定打破了中药常规鉴定的界限，可以从生物的种或种以下水平进行准确地鉴定，不受组织或药材部位对鉴定的影响，因而对于准确、合理、安全用药、保障患者的权益具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有所存在的问题，提供一种分辨力强、重现性好的一种聚合酶链式反应鉴别熊胆粉真伪的方法。

本发明的具体方法如下：

a、样品（熊胆粉与伪品）的基因组提取方法

取熊胆粉2克，伪品鸡、羊、牛、猪胆汁干燥品各2克，放入各自的试管中，采用酚-氯仿-异戊醇抽提方法对其基因组DNA进行提取。

b、用于扩增的样品的聚合酶链式反应引物

上游引物：5'  CGCCATGAACCCTCCCTCTA  3'   

下游引物：5'  CCTGGGCAGTGAATCCCTCTT  3' 

c、用于扩增的聚合酶链式反应体系和扩增条件

在反应体系中：取50ng/μl样品的DNA模板2μl，10倍缓冲液  2μl ， 2.5mM 的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）2μl，上游引物：5'  CGCCATGAACCCTCCCTCTA 3' 1μl，下游引物：5'  CCTGGGCAGTGAATCCCTCTT  3'  1μl，聚合酶0.2μl放入试管中，用灭菌去离子水补充至25μl。

其扩增条件： 94.0℃ 8分钟；之后35个循环包括：94.0℃  1分钟 ，58.6℃  1分钟， 72.0℃  2分钟，最后72.0℃ 10分钟35个循环；得到聚合酶链式反应扩增产物。

d、聚合酶链式反应扩增产物的检测方法

在水平电泳槽中制备其浓度1.5%琼脂糖凝胶；将上述聚合酶链式反应扩增产物 5μl加入点样孔，在对比孔中加入5 μl分子量标准 2000型作为对比；电压120 V，电泳40min后在图谱成像系统中成像。

e、通过电泳图谱判断熊胆样品的真伪。

本发明的有益效果是

该方法不仅可以对来源相近的正品与混淆品进行区别，而且可以对干燥加工成粉熊胆粉进行鉴别。

熊胆粉是熊分泌物，很难由药材推逆原动物的品种与质量，而来源相近的正品与混淆品则更不易区分。因此，很多传统的中药鉴定方法无法解决目前许多动物类中药的鉴别问题。用本方法进行中药材DNA分子标记鉴别，只需取极少量的样品即可提得足够用于多聚酶链反应(PCR)扩增的DNA模板，然后进行鉴别判定。该方法速度快、分辨力强、重现性好，可以澄清熊胆及其粉剂的真伪和优劣（涉及剂量、比例），弥补传统中药鉴定中动物类中药鉴别的弱项，为临床合理用药提供科学依据。

该技术的运用是提高中药材的质量，保障千百万人民身体健康和生命的安危、保障中医疗效的基础；可以有效的遏制伪造、掺假、滥用、误用、混用等现象，提高中医药的信誉，保障人民用药安全，其经济效益不言而喻的。

附表： 熊胆粉与伪品扩增后的结果

真品熊胆样品鸡样品羊样品牛样品猪样品344个碱基 163个碱基109个碱基109 个碱基109 个碱基375个碱基250个碱基173个碱基173 个碱基280 个碱基 350个碱基359个碱基359 个碱基360 个碱基 406个碱基530个碱基422 个碱基375 个碱基 626个碱基80个碱基565 个碱基390 个碱基   790 个碱基405 个碱基    531 个碱基    675 个碱基    785 个碱基    1000个碱基

表中可以看出熊胆粉与伪品和混淆品在扩增的带型和片段的大小上存在差异: 真品熊胆扩增的结果主要有2个条带大小分别是: 375个碱基、344个碱基 ；主要的伪品鸡样品扩增结果主要有5个条带分别是:626个碱基、406个碱基、350 个碱基、250个碱基、163 个碱基；羊样品扩增结果主要有5个条带分别是:800 个碱基、530个碱基、359个碱基、173个碱基、109个碱基；牛样品扩增结果主要有6个条带分别是:790个碱基、565个碱基、422个碱基、359个碱基、173个 碱基、109个碱基；猪样品扩增结果主要有10个条带1000 个碱基、785个碱基、675个碱基、531个碱基、405个碱基、390个碱基、375个碱基、360个碱基、280个碱基、109个碱基，无论从带型和片段的大小上，样品之间都存在着差异，这是鉴定样品真伪和种属的多态性依据。