一种水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDT701启动子及其应用

摘要

本发明公开了一种水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDT701启动子及其应用。该启动子的序列是下列核苷酸序列之一：(a)序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(b)在严谨条件下能与a)的DNA序列杂交并且具有相同功能的核苷酸序列；(c)与a)或b)的DNA序列具有90％以上的同源性，并且也具有启动子功能的核苷酸序列。本发明从水稻中克隆出HDT701基因的启动子：水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDT701启动子，该启动子能够启动下游基因在水稻中的部分器官中表达，是一个组织特异性启动子，因此可将其应用于转基因工程中，使的目的基因的表达产物在一定的器官或组织部位积累，增加局部表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费，因此在转基因工程中有良好的应用前景。

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程和水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻组蛋白脱乙酰化酶基因 HDT701编码区上游启动子序列的克隆-水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDT701启动子，以及该 启动子在转基因水稻中的应用。

背景技术：

启动子是指DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，通常位于 编码基因的上游。在启动子片段中存在大量的顺式作用原件，转录因子通过与顺式作用原件 结合从而调控基因的转录使基因具有时空表达特异性。所以启动子的分离和功能分析是基因 工程研究的重要内容。

植物基因工程中常用到的启动子按其作用方式和功能分为3类：组成型、组织特异型以 及诱导型启动子。组成型启动子在所有组织中都启动基因的表达，具有持续性、没有时空特 异性。基因工程中常用到的有目前在植物表达载体中常用的是组成型启动子，如花椰菜花叶 病毒CaMV 35S启动子、玉米的Ubiquitin启动子等。但是外源基因在受体植物内持续、高 效地表达往往会引起植物的形态发生改变，影响植物正常的生长发育，甚至导致植物死亡。

组织特异型启动子能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加局部表达 量。这样避免了基因过量表达对植物体造成的伤害，同时也可以避免植物营养的不必要浪费。 所以近年组织特异型启动子的研究备受关注。

近年来随着现代基因工程技术的发展获得了很多转基因植物包括很多粮食作物，但是食 品安全问题却制约了转基因农作物的推广和发展。转基因水稻中外源基因在胚乳中表达致使 外源蛋白在其中积累，是影响一些具有很好品质的转基因水稻发展受限制的主要因素。针对 这种现象，利用组织特异型启动子使外源基因只在营养器官中表达而在人类食用部分不表达 以降低食品安全风险是促进转基因水稻和转基因农作物推广的一个重要途径。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种具有组织特异性的水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDT701 启动子。

本发明的水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDT701启动子，其特征在于，其序列是下列核苷酸 序列之一：

(a)序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(b)在严谨条件下能与(a)的DNA序列杂交并且具有相同功能的核苷酸序列；

(c)与(a)或(b)的DNA序列具有90％以上的同源性，并且也具有启动子功能的核 苷酸序列。

本发明的如SEQ ID NO.1所示的水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDT701启动子，其顺式 作用原件分析如表1所示：

表1：水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDT701启动子顺式作用原件分析

本发明将如SEQ ID NO.1所示的水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDT701启动子插入到载 体PCAMBIA1391Z的多克隆位点处形成由HDT701启动子启动GUS基因表达的融合表达载 体，通过农杆菌介导法转化水稻成熟胚愈伤组织得到转基因植株。通过对转基因水稻的PCR 检测和GUS染色，结果显示我们已经成功的把HDT701启动子整合到水稻基因中，并且HD T701启动子驱动的GUS基因在转基因水稻除胚乳以外的器官中均有表达，由此说明本发明 的如SEQ ID NO.1所示的序列是一个启动子，命名为水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDT701 启动子，该启动子启动GUS基因在转基因水稻除胚乳以外的器官中均有表达，即在转基因水 稻中只是在部分器官组织中表达，由此说明这个启动子有组织特异性，是一个组织特异性启 动子。

因此，本发明的第二个目的是提供一种表达载体，其特征在于，含有水稻组蛋白脱乙酰 化酶基因HDT701启动子。

本发明的第三个目的是提供一种宿主菌，其特征在于，含有上述表达载体。

所述的宿主菌优选为农杆菌EHA105。

本发明的第四个目的是提供一种水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDT701启动子在启动下游 目的基因在水稻中表达的应用。

本发明从水稻中克隆出HDT701基因的启动子：水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDT701启 动子，该启动子能够启动下游基因在水稻中的部分器官中表达，是一个组织特异性启动子， 因此可将其应用于转基因工程中，使的目的基因的表达产物在一定的器官或组织部位积累， 增加局部表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费，因此在转基因工程中有良好的应 用前景。

附图说明：

图1是HDT701启动子的PCR产物凝胶回收检测图，M为2KB分子量标记，1为目的产物 条带。

图2是双元载体PCAMBIA1391Z的结构示意图。

图3是表达载体PCAMBIA1391Z-HDT701P构建完成酶切检测图，M为2KB分子量标记，1 为HindIII/speI酶切条带，2为HindIII/PstI酶切条带。

图4是PCR检测阳性转基因水稻植株图，M为2KB分子量标记，以1-8泳道为8棵转基因 植株叶片，野生型水稻叶片为第9泳道，转基因的3、4、6、7号水稻都能得到399bp的GUS 目的条带，野生型的作为阴性对照没有得到目的条带。

图5是HDT701基因在水稻幼根、幼叶、生殖期的根、生殖期的叶、茎以及颖壳中的半定量 表达分析显示图，A为HDT701基因，B为Actin基因(登录号为AK100267)，1为幼苗，2 为茎，3为生殖期的叶，4为颖壳，5为生殖期的根，6为幼根。

图6是HDT701启动子融合GUS染色转基因材料的染色结果图，1为茎，2为叶枕，3为愈 伤组织，4为颖壳，5为叶片，6为幼根，7为颖壳和花药，8为生殖期的根，9为萌发不同天 数的幼苗，10为成熟种子的颖壳，11为萌发的种子的胚乳。

图7是转基因水稻幼根和幼叶半薄切片结果图，1为幼根纵切图，2为幼根横切图，3为幼叶 横切图。

图8是转基因植株不同时期、不同组织器官GUS蛋白相对活性比较图。

图9是转基因植株不同器官受到冷胁迫后GUS蛋白相对活性比较图。

图10是转基因植株受到各种胁迫后GUS蛋白相对活性比较图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如质粒的提取等是按照 分子克隆实验指南或者按照制造商所建议的实验条件进行，如：DNA回收采用东盛生物公司 的DNA凝胶回收试剂盒，按其说明书进行操作。

实施例1：OSHDT701基因的启动子：HDT701启动子的克隆

1、以水稻粳稻品种日本晴为实验材料，通过CTAB法提取基因组DNA做为模板。

2、根据NCBI上已知的水稻基因OSHDT701(Genebank登录号为AK072845)的序列， 取起始密码子前面2KB设计引物，以粳稻品种日本晴的基因组DNA为模板进行PCR扩增。

上游引物：F：5’-TGAAGCTTTAAGGCGAATAAGCGAAAC-3’

下游引物：R：5’-CTCTGCAGGAAGAACCCTAGAAAAGAAA-3’

PCR反应按50ul体系进行，反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58.9℃退 火45s，72℃延伸2min，循环35次；72℃后延伸5min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶 电泳分离(图1)后回收纯化，然后克隆入载体pMD18-T中，在16℃连接过夜。

连接产物用热激法转化大肠杆菌感受态细胞JM109，对长出的单克隆进行菌落PCR鉴 定，选取转入了连有目的片段的pMD18-T的阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序，得 到扩增片段的序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，片段大小为1844bp，将该序列命名为HDT 701。

实施例2：HDT701-GUS融合表达载体的构建

将实施例1中测序正确的阳性克隆大量提取质粒。提取的质粒和载体PCAMBIA1391Z(其 结构如图2所示)同时用HindIII和PstI进行酶切，回收目的片段、连接，即可得到以HDT701 作为启动子，其下游基因为GUS的表达载体PCAMBIA1391Z-HDT701P。在HDT701P片段 的700bp处有一个SpeI酶切位点，在PCAMBIA1391Z上没有SpeI酶切位点，所以用HindIII 和SpeI酶切融合载体鉴定阳性质粒会得到0.7KB的小片段(图3)。阳性质粒通过冻融法转 入农杆菌EHA105，菌落PCR鉴定转入表达载体PCAMBIA1391Z-HDT701P的阳性克隆用于 水稻转化。

实施例3：根癌农杆菌转化水稻成熟胚愈伤

采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza  sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA， 1994，Plant Journal 6：271-282)将构建好的植物融合表达载体PCAMBIA1391Z-HDT701P 导入水稻粳稻品种中花11成熟胚的愈伤组织中获得转基因植株。

农杆菌介导的遗传转化步骤如下：

1、愈伤组织诱导

成熟的水稻种子去壳，用体积分数为70％的乙醇处理1min，质量分数为1％的升汞溶液 消毒15min；灭菌水清洗种子3～5次，前几次3-5min，最后一次10min。将消毒好的种子接 种于诱导培养基上26℃暗室中培养2周。

2、愈伤组织继代

接种两周后将膨大的盾片从种子上切下来，转入新的诱导培养基上，2周后挑选米黄色 的颗粒状的小愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周。

3、预培养

挑选一定大小的颗粒状愈伤，放于诱导培养基上黑暗下预培养3天，温度26℃。

4、农杆菌活化

将实施例2的含构建好的含有载体PCAMBIA1391Z-HDT701P的农杆菌EHA105在带有 50mg/L卡那霉素和25mg/L硫酸链霉素的YM固体培养基(YM培养基属于现有技术中的培 养基)上划线，28℃倒置培养48小时；挑单菌落接种于含有相同抗生素的5ml YM液体培 养基中28℃摇床上培养24-48h，取1ml接种于30ml的相同抗生素的YM液体培养基中振荡 培养使OD600＝0.6-0.8，离心收集菌体，用加有200umol/L乙酰丁香酮(As)的AAM液体 培养基重悬菌体，用于浸染。

5、农杆菌侵染

将预培养3天的愈伤放入上述农杆菌悬浮液中浸泡15min，中间每隔几分钟震荡一下， 取出愈伤后用灭菌滤纸吸干多余菌液；然后接种在共培养基上暗培养3d，温度22℃。

6、愈伤的清洗和筛选

用加有500mg/L头孢霉素的灭菌水对共培养后的愈伤进行清洗4-5次，前几次每次 4-5min，最后一次10min，然后转移到无菌滤纸吸干水分，将愈伤接入到筛选培养基上26℃ 暗培养，每两周继代一次。继代两次后在老愈伤上面会长出新的抗性愈伤。

7、分化及生根

将长到一定大小的抗性愈伤转接到加有ABA的预分化筛选培养基上暗培养7d，三层无 菌滤纸上干燥3天后再转移到分化筛选培养基上，26℃光照培养箱中培养直至长出小苗。将 长出的小苗转入筛选生根培养基上生根。

8、移栽

将生根后的小苗拿到室温条件下炼苗一周，然后种到花盆土中，正常管理。

实施例4：转基因植株的鉴定

待转基因植株长到一定大小后，剪取叶子CTAB法提取基因组DNA，并设计引物对其进 行PCR检测，引物为：

F：5’-GGAGTGAAGAGTATCAGTGTGC-3’

R：5’-GATAATCATCGCAAGACCG-3’。

PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸90s， 循环30次；72℃后延10min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离。预期PCR产物 片段长为399bp。结果如图4所示，M为分子量标记，以1-8泳道为8棵转基因植株叶片， 野生型水稻叶片为第9泳道，转基因的3、4、6、7号水稻都能得到399bp的GUS目的条带 (阳性植株)，野生型的作为阴性对照没有得到目的条带。由此获得转入PCAMBIA1391Z- HDT701P载体的阳性转基因水稻植株。

实施例5：半定量分析目的基因HDT701基因在水稻幼根、幼叶、生殖期的根、生殖期 的叶、茎以及颖壳中的表达。

分别取水稻幼根、幼叶、生殖期的根、生殖期的叶、茎以及颖壳进行RNA的提取，然后 进行半定量表达分析：

RNA的提取方法和半定量表达分析方法如下：

所用的引物序列：

F：5’-TGTGAGCCTGAAGATGAACG-3’，

R：5’-GAGAGGGTTCCAATGACTAGC-3’

1、RNA的提取：(Trizol法)

(1)取100mg各种器官组织，加液氮研磨成粉末状。

(2)加入1ml Trizol，室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。

(3)加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温5min。

(4)12000rmp，4℃离心，15min。

(5)吸上层无色水相，移入另一EP管中(约0.5ml)。

(6)加等体积异丙醇，-20℃，30min。

(7)12000rmp，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀

(8)弃上清，将离心管倒置于纸巾上，吸干水分；

(9)加1ml 75％乙醇，弃上清(清洗两次)，空气干燥DNA；

(10)用含DNAaseI的水50μl溶解，37℃放一小时，再加如550ul的DHPC水然后重复步骤 3-11；

(11)用40μl DHPC水溶解，-20℃，取1μl加入99μl DEPC水测OD260/OD280；

(12)计算浓度与纯度，-70℃保存。

2、cDNA第一链的合成

在RNase free的PCR管中配制下列溶液：

Total RNA                1μg

DEPC处理H₂O              补足15.5μl

70℃水浴10min，置冰上；

再加入下列试剂：

上述混样于37℃保温1h，72℃10min灭酶活。将反转录产物稀释5倍用于PCR扩增模板。

3、PCR反应

扩增体系为：

RT-PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，Tm值复性1min，72℃延伸1min， 35个循环；72℃延伸10min。

PCR产物进行电泳，电泳条带经密度扫描仪扫描得到待测基因与内参基因条带各自的峰 面积积分值，计算各组样品两者的比值，结果如图5所示，在所取得组织中目的基因HDT701 均有表达。

实施例6：对阳性转基因植株的GUS染色分析

分别取实施例4的转入PCAMBIA1391Z-HDT701P载体的阳性转基因水稻植株的叶、茎、 根、颖壳以及萌发不同天数的种子浸入GUS染液中，37℃过夜，无水乙醇脱色后拍照观察。 如图6所示，GUS基因在水稻除胚乳以外的器官中均有表达。由此说明，如SEQ ID NO.1所 示序列的HDT701片段是一个启动子，命名为水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDT701启动子， 该启动子启动GUS基因在转基因水稻除胚乳以外的器官中均有表达，即在转基因水稻中该启 动子只启动下游基因在部分器官组织中表达，由此说明这个启动子具有组织特异性，是一个 组织特异性启动子。

GUS染液：50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mmol/L K₄Fe(CN)₆，5mmol/L K₃Fe(CN)₆， 10mmol/L EDTA，0.1％TritonX-100，1.0mg/mL X-Gluc。

实施例7：对阳性转基因植株进行不同器官GUS蛋白相对活性的测定

分别取营养生长期和生殖生长期的实施例4获得的阳性转基因水稻的根、茎、叶、叶鞘 进行GUS蛋白相对活性测定。

GUS蛋白相对活性测地方法如下：

(1)取0.1g材料于1.5ml离心管中，加入液氮，研成粉末，加入600ul酶提取液。

(2)13000rpm，4℃离心10min，取上清。

(3)取50ul的上清，加入50ul的灭菌去离子水中使终体积为100ul，用考马斯亮蓝法测 定蛋白的含量。

(4)取50ul含GUS的上清加入到450ul在37℃预热的检测液(2mmol/L MUG溶液) 中。迅速充分混匀，并立刻取出50ul加入到1950ul反应终止液(0.2mol/L Na₂CO₃)，将该 管作为酶促反应的0点。

(5)然后分别在5min、10min、20min和30min分别取出50ul的反应液，转入1950ul 的反应终止液中。

(6)用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，测定不同时间点的荧 光值，计算反应生成的MU的量；

(7)计算样品中GUS活性，GUS活性＝单位时间内反应生成的MU/蛋白量(单位：pmol MU.mg-1.min-1)。

GUS酶提取液：0.1M磷酸缓冲液(PH7.0)50ml，10％SDS 1ml，0.5M EDTA(PH8.0)2ml， 甲醇20ml，Triton X-100 100ul，β-巯基乙醇100ul，ddH₂O up to 100ml。

GUS检测液(MUG溶液)：MUG(C₁₆H₁₆O₉ 4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷)分子量： 352.3，将50mg MUG溶解到72ml的GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的浓度。

反应终止液(0.2mol/L Na₂CO₃)：配制500ml 0.2mol/L的Na₂CO₃溶液：Na₂CO₃ 10.6g H₂O up to 500ml

4-MU溶液配制：4-MU(4-甲基伞型酮)分子量：176.2，称0.14096g 4-MU固体溶于 40ml反应终止液(0.2M Na₂CO₃)中，配制成20mM的4-MU溶液。然后再稀释到1mM浓 度，贮存于-20度，留待制备MU标准曲线。

Bradford溶液配制：称取100mg考马斯亮蓝药品，溶解在100ml 85％磷酸和50ml 95％ 乙醇混合液中。染料溶解完全后，用冷水补足至1000ml，滤纸过滤，避光保存。

结果如图8所示，图8显示在不同器官中GUS蛋白相对活性均是营养生长期大于生殖生 长期，而在营养生长期在根中的表达量最强，在生殖生长期是茎中的表达量最强。

实施例8：不同胁迫条件下转基因水稻的GUS蛋白相对活性测定

将实施例4获得的转入PCAMBIA1391Z-HDT701P载体的营养生长期的转基因水稻，4℃ 处理12小时后测定根、茎、叶、叶鞘的GUS蛋白相对活性，具体测定步骤参见实施例7， 结果如图9所示，各个器官在低温处理后GUS蛋白相对活性均下降，只是下降的程度有差异。

另外还测定了在不同胁迫条件下两叶一心期转基因水稻中的GUS蛋白的相对活性(幼根 取0.05g，幼叶取0.05g)，其中冷胁迫处理是将转基因植株于4℃处理12小时取样，进行测 定；高温处理是将转基因植株于40℃处理12小时取样，进行测定；干旱胁迫是将转基因植 株用20％的PEG处理12小时取样，进行测定；黑暗处理是将转基因植株放置于黑暗中处理 12小时取样，进行测定，具体测定步骤参见实施例7，每个处理重复3次。结果如图10所示， 高温处理后GUS蛋白相对活性会上升，而低温处理、干旱处理和暗处理后GUS蛋白的相对 活性会下降。

实施例9：半薄切片：

1、溶液的配制

A液：含2.5％戊二醛和2％的多聚甲醛的磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.2)。

B液：含1％锇酸的磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.2)

C液：磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.2)

2、固定与包埋

(1)固定：将剪切的合适大小染色并脱过色的水稻幼苗的根和叶迅速投入A液中，4℃固 定过夜。

(2)洗涤：用C液4℃洗涤六次，每次20min。

(3)再固定：在溶液B中，4℃固定16小时。

(4)洗涤：用C液4℃洗涤6次，每次20min。

(5)体积分数为30％、50％、70％、80％、90％、100％系列的预冷乙醇逐级脱水，每 级15min，100％乙醇2次，每次30min。

(6)环氧丙烷过渡，Epon812常规方法包埋。包埋好的材料可以进行半薄切片，切成2um 厚的切片，Carl Zeiss显微镜观察拍照。

结果如图7所示，图7显示，在幼根及叶中GUS主要集中在维管束的周围表达，推测 HDT701启动子也许参入营养物质的运输。

实施例10：为了更好的了解HDT701启动子的功能，将HDT701启动子放在PLACE上 做了顺式作用原件分析。其结果如表1所示。

最后，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然本发明不限于以上实施例，还 可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容导出或者联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。

附：涉及到转基因水稻过程中用的培养基

1)诱导、继代培养基：

2)AAM培养基

3)共培养基

水稻成熟胚愈伤组织共培养基：N6大量+MS-Fe盐+B5微量+B5有机+2，4-D 2.0mg/L+CH 300mg/L+proline 500mg/L+肌醇100mg/L+AS 100μM+蔗糖30g/L+ phytagel 3.0mg/L pH 5.2。

4)筛选培养基

诱导培养基+50mg/L的潮霉素+500mg/L头孢霉素。

5)预分化培养基

用时加入50mg/L的潮霉素和500mg/L头孢霉素(预分化筛选培养基)。

6)分化培养基

用时加入50mg/L的潮霉素和500mg/L头孢霉素(分化筛选培养基)。

7)生根培养基

用时加入50mg/L的潮霉素和500mg/L头孢霉素(筛选生根培养基)。