改善表面生物活性特征的方法及具有由此改善的表面的物体

摘要

本发明提供改善植入物表面生物活性的方法。本发明还提供改善生物实验室用品表面生物活性的方法。本发明还提供在物体上附着细胞的方法。本发明还提供为医疗移植制备物体的方法。本发明还提供具有附着的细胞的用品，以及用于医疗移植的用品。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请主张享有以下申请的优先权：2009年4月14日提交的名称为“改 善表面生物活性特征的方法及具有由此改善的表面的物体(METHODS FOR  IMPROVING THE BIOACTIVITY CHARACTERISTICS OF A SURFACE  AND OBJECTS WITH SURFACES IMPROVED THEREBY)”，申请号为 61/168,971的美国临时申请，2009年6月18日提交的名称为“改善表面生 物活性特征的方法及具有由此改善的表面的物体(METHODS FOR  IMPROVING THE BIOACTIVITY CHARACTERISTICS OF A SURFACE  AND OBJECTS WITH SURFACES IMPROVED THEREBY)”，申请号为 61/218,170的美国临时申请，2009年8月31日提交的名称为“改善表面生 物活性特征的方法及具有由此改变的表面的物体(METHODS FOR  IMPROVING THE BIOACTIVITY CHARACTERISTICS OF A SURFACE  AND OBJECTS WITH SURFACES IMPROVED THEREBY)”，申请号为 61/238,462的美国临时申请，以及2009年3月11日提交的名称为“利用气 体团簇离子束技术改变生物材料表面湿润性和其他生物相容性特征的方法 及由此制备的生物材料(Methods for Modifying the Wettability and other  Biocompatability Characteristics of a Surface of a Biological Material by the  Application of Gas Cluster Ion Beam Technology and Biological Materials Made  Thereby)”，申请号为61/159,113的美国临时申请，以上申请的内容以参考引 用的方式结合于此。

技术领域

本发明总体上涉及改善物体表面生物活性特征的方法，以及至少部分表 面具有改善的生物活性的物体的生产。更具体地，本发明涉及利用气体团簇 离子束技术通过提高表面生物活性使其表面改善的方法。

背景技术

我们通常期望物体的表面具有吸引并主导活生物细胞的生长、附着和增 殖的增强的能力。这样的示例通常是某些生物实验室用品，包括例如组织培 养皿、烧瓶和辊烧瓶、孔(wells)和玻片、板(plates)、陪替氏培养皿(Petri  dishes)等。这样的实例还通常是用于移植的医疗用品，还有用于检验在空 气或水中传播的污染物的环境检验装置。

此处使用的术语“生物活性”涉及表面、物体或部分物体，其意为表面、 物体或部分物体对于吸引活细胞、或对于在其上面改善细胞和/或组织活性、 或对于活细胞附着、或对于提高在其上面活细胞生长或提高在其上面活细胞 繁殖的适宜性。此处使用的术语“氧化钛”意为包括含陶瓷形式的所有形式 的钛的氧化物，以及连同具有本征氧化物或其他含有钛元素氧化物(包括不 限于二氧化钛(TiO2)和/或不完善的化学计量学的二氧化钛(TiO2))的表 面涂层的钛金属本身(或其合金)。可植入的医疗装置通常由钛金属(或合 金)制成，一般具有氧化钛表面(可以是本征氧化物或故意氧化的表面或其 他)。

生物实验室用品可以用于细胞培养、组织培养、外植体培养和组织工程 应用(例如)，并且通常由大体上惰性和/或生物相容性的材料制成，如玻璃、 石英、塑料和聚合物、及某些金属和陶瓷。通常期望的是，能够改变这些生 物实验室用品表面中的至少一部分，以增强其生物活性。

准备植入哺乳动物(包括人)体内或身体组织的医疗物体，例如医用假 体或手术植入物或移植物，可以有多种材料制成，包括但不限于适于应用并 适当具有生物相容性能的多种金属、合金、塑料或聚合物或共聚物材料(包 括纺织、针织和非纺织聚合/共聚织物)，固体树脂材料，玻璃和玻璃质材料， 诸如骨骼和胶原蛋白的生物材料，丝和其他自然织物，和其他材料(包括但 不限于聚[谷氨酸]，聚[乳酸-乙醇酸]和聚[L-乳酸])。例如，应用某些不锈 钢合金、钛和钛合金(包括可能的本征氧化物层)、钴铬合金、钴铬钼合金、 钽、钽合金、锆、锆合金(包括可能的本征氧化物层)、聚乙烯和其他惰性 塑料，以及包括氧化钛、氧化铝、氧化锆陶瓷的多种陶瓷。例如，聚合/共聚 织物可以由聚酯(包括聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate， PETE)、聚四氟乙烯(polytetrafl[upsilon]oroethylene，PTFE)、芳纶、聚酰胺 或其他合适纤维形成。准备用于移植的医疗物品例如包括但不限于血管支 架，血管和其他移植物，牙科植入物，人工和自然的关节，冠状动脉心脏起 搏器，植入式镜片等及其部件。通常，此类装置具有低于期望理想状态的细 胞附着和细胞繁殖特征的自然表面状态。这此类示例中，通常期望能够改变 物体表面的至少一部分，增强细胞附着，以便使其更适于移植应用。

环境检验装置通常包括如金属、塑料和聚合物、玻璃和石英等材料。

气体团簇离子束(Gas-cluster ion-beam，GCIB)照射已经用于表面的纳 米级改变。在同时待决的、共同持有的申请号为12/210,018、名称为“利用 气体团簇离子束技术改变医疗装置表面的可湿性特征的方法和系统及由此 制成的医疗装置(Method and System for Modifying the Wettability  Characteristics of a Surface of a Medical Device by the Application of Gas  Cluster Ion Beam Technology and Medical Devices Made Thereby)”的美国专利 申请中，GCIB放射已经表现为改变非生物材料表面的亲水性。通常已知， 细胞，包括但不限于如成纤维细胞和成骨细胞的贴壁依赖性细胞喜好亲水性 表面以良好地附着、生长或分化，它们还喜好生理pH值下带电荷的表面。 已经采用多种方法提高亲水性或改变非生物表面的电荷，如，喷砂 (sandblasting)、酸蚀(acid etching)、喷砂加酸蚀(SLA)、涂层等离子喷雾、 二氧化碳激光平滑和各种清洗方式，包括机械、超声、等离子和化学的清洗 技术。其他方式包括添加表面活性剂或应用具有不同可湿性特征的薄膜或涂 层。多种方法还应用于提高表明的细胞粘附特性，如紫外线(UV)处理、 紫外线和臭氧处理、共价附着聚乙二醇(PEG)以及应用蛋白质产品，如抗 体抗-CD34和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽链(RGD肽链)。

因此，本发明的目的在于，提供一种通过GCIB处理具有改善的生物活 性的表面和至少具有一部分该表面的物体。

本发明的另一目的在于，提供形成通过使用GCIB技术具有改善的生物 活性的表面或至少具有部分该表面的物体的方法。

本发明的又一目的在于，提供用于医疗植入的物体，其具有至少部分通 过GCIB处理改变的表面和在医疗植入前体外附着的细胞。

本发明的再一目的在于，提供形成用于医疗植入的物体的方法，该物体 具有至少部分通过GCIB处理和通过在医疗植入前细胞的体外附着改变的表 面。

发明内容

上述本发明的目的及其他目的和优势通过以下描述实现。

组织工程最重要的任务之一是能够允许来自不同谱系的细胞以一种在 人体内可见方式生长并互相作用。表面的GCIB照射在保持细胞分化的同时， 很大程度上提高细胞的粘附性和繁殖性。当他们在具有受GCIB照射改变的 表面的惰性或生物活性材料上生长时，有益于源于上皮、内皮、间叶或神经 元细胞的组织和器官的创伤修复。无论目标是获得基础骨骼和牙种植体之间 的融合；韧带和附着骨骼之间的细胞渗透和融合；加强皮肤或头皮移植物融 合；或重建突触的神经元再生，使用GCIB照射是组织工程和创伤修复发展 中有益的加工过程。

本发明指明，使用GCIB处理在准备细胞附着的物体上形成表面区域， 该表面区域具有改善的生物活性特征，以适于细胞的生长、附着和/或繁殖。 本发明也指明，在医疗/手术移植之前，在医用物体的经GCIB处理的表面区 域上细胞体外附着。该附着的细胞可以来自准备进行医疗/手术移植的个体， 或来自其他相容的来源。

当准备细胞附着的物体表面的特定所选部分改善生物活性，并当不准备 物体表面的其他部分参与细胞附着过程，通过限制GCIB处理只针对物体表 面所选的部分进行处理限制GCIB处理，只增加所选部分的生物活性特征。 控制GCIB横截面积和/或控制扫描和/或GCIB偏转限制仅对所选表面部分的 照射范围，可以实现对所选区域的GCIB处理限制。可选地，常规遮蔽技术 可用于对不期望GCIB处理的表面部分进行遮盖，并使需要GCIB处理的所 选表面部分暴露出来。之后，可使用漫射或扫描GCIB照射遮盖物和穿过遮 盖物暴露的表面部分。本领域的技术人员将理解限制GCIB照射所选表面区 域或物体表面的其他不同方法，并纳入本发明。

常规高能离子束、加速带电原子或分子广泛地应用于形成半导体装置 结、通过溅射改变表面、改变薄膜的特征。不同于常规离子，气体团簇离子 由(通常具有几百到几千的分布，平均值为几千)常温常压下呈气态的材料 的大量弱束缚原子或分子的团簇(例如通常为氧气、氮气或惰性气体，如氩 气，但任何可冷凝气体可用于产生气体团簇离子)形成，每一团簇共用一个 或多个电荷，其可通过高压(依次从约3kV至约70kV或更高)共同加速， 以便具有高总能。在气体团簇形成和加速后，可以改变其带电状态或变为可 变的(甚至为电中性)，他们可切断为较小的团簇离子和/或电中性的较小团 簇，但其趋于保持由高压加速形成的相对较高的总能。松弛束缚，气体团簇 离子在与表面的撞击后进裂，构成原子之间分配加速的气体团簇离子的总 能。由于该能量分配，团簇中的单个原子相比常规离子具有小得多的能力(进 裂之后)，因此，尽管加速的气体团簇离子具有高能，原子穿透深度较浅。 此处使用的术语“GCIB”、“气体团簇离子束”和“气体团簇离子”包括在 加速之后其电荷状态全部或部分变化的加速离子束和离子。术语“GCIB” 和“气体团簇离子”包括包含加速的气体团簇的所有束，即使他们也可以包 括非团簇的粒子。

由于气体团簇内单个离子的能量非常小，通常为几到几十eV，因此在 冲击期间原子最多只能穿透目标表面的若干原子层。撞击原子的该浅层穿透 (通常几纳米至约十纳米，依赖于束的加速)意味着全部团簇携带的所有能 量因此在小于微秒的时间段内在非常浅的表层内以极小容量释放。这与常规 离子束穿透材料有时几百纳米不同，在材料表面下深处产生改变和材料变 性。由于气体团簇离子的高总能和极小的相互作用容量，撞击处释放的能量 密度远高于常规离子的撞击。因此，表面的GCIB处理可以产生增强表面特 征使其具有用于随后的细胞生长、附着和繁殖的适宜性的变化。

没有期望得到任何特定理论，我们相信，根据本发明提供的方法经GCIB 处理的表面观测到的增强的生物活性可能因为经GCIB照射的表面的结构发 生物理变化。

根据公知技术，气体团簇离子束产生和传输的目的在于对工作部件进行 照射，所述公知技术例如在Kirkpatrick等人申请的、申请号为 2009/0074834A1公开的美国专利中教导，其全部内容作为参考纳入本说明 书。必要步骤包括将高压气体注入减压室中，在气体膨胀期间形成气体团簇 的同时形成喷射，在喷射中将气体团簇从大部分非团簇燃气中分离，将气体 团簇电离形成气体团簇离子，并且形成、加速并引导气体团簇离子束作用于 减压环境中的工作部件，用于进行GCIB照射处理。工作部件可以在排空减 压室之前或穿过本领域技术人员公知的大气真空负荷锁引入减压室。本领域 公知的多种类型支架用于支承GCIB照射路径上的物体，并用于操纵物体使 物体的多个部分得到照射。

具有根据本发明经GCIB改变的表面的物体可以应用于(例如，但不限 于)准备细胞培养、组织培养、外植体培养、组织工程或其他细胞附着或生 长的生物实验室用品、可以医疗/手术植入体内或体表或哺乳动物的身体组织 或其他生物体，或者用于环境检测装置等。可选地，物体还可以加工为在其 应用前在经GCIB处理的表面上体外附着细胞，例如在医疗/手术移植中。

本发明提供一种改变可移植物体表面生物活性的方法。该方法包括以下 步骤：在减压室中形成气体团簇离子束，将物体引入减压室；并使用气体团 簇离子束照射所述物体表面的至少第一部分。该方法中的物体为医用假体、 手术植入物、手术移植物、部分医用假体、部分手术植入物、部分手术移植 物或其他准备移植的物体。

本发明还提供一种改善生物实验室用品表面生物活性的方法。该方法包 括以下步骤：在减压室中形成气体团簇离子束，将物体引入减压室；并使用 气体团簇离子束照射物体表面的至少第一部分。该方法中的物体为一项生物 实验室用品。

本发明还提供一种将细胞附着于物体上的方法。该方法包括以下步骤： 选择物体表面的至少一部分，在减压室中形成气体团簇离子束，将所述物体 引入所述减压室，使用所述气体团簇离子束照射所述表面的所述至少一部 分，将所述物体从所述减压室中移出，并且将所述表面的所述至少一部分暴 露于活细胞。

本发明还提供一种用于制备医疗移植的物体的方法。该方法包括以下步 骤：选择物体表面的至少一部分，在减压室中形成气体团簇离子束，将物体 引入减压室中，并使用气体团簇离子束照射所选至少一部分，以增加该至少 一部分的生物活性。该方法的对象为医疗植入物。

本发明还提供一种具有使用方法实现具有附着细胞的制品，该方法包括 以下步骤：选择物体表面的至少一部分用于附着细胞，在减压室中形成气体 团簇离子束，将所述制品引入所述减压室，使用气体团簇离子束照射所述表 面的所述至少一部分，将所述物体从所述减压室中移出，并将所述表面的所 述至少一部分暴露于活细胞。

本发明还提供一种通过方法实现的用于医疗移植的制品，该方法包括以 下步骤：选择医疗植入物的表面的至少一部分，在减压室中形成气体团簇离 子束，将所述植入物引入所述减压室；并使用气体团簇离子束照射所述表面 的所述至少一部分，以增加所述表面的所述至少一部分的生物活性。

附图说明

为了更好地理解本发明及其目的，参考如下附图，其中：

图1为表100，对比细胞附着和繁殖的比率；

图2为未经处理的钛薄膜的表面部分的扫描电镜显微照片200，示出了 表面上的细胞附着；

图3为根据本发明的实施例经GCIB照射处理的钛薄膜部分表的扫描电 镜照片300，示出了表面上改善的细胞附着/繁殖；

图4a至4f为根据本发明的实施例包括对照和GCIB照射条件下的玻璃 衬底的部分表面的光学显微镜照片，并示出了GCIB照射后表面上改善的细 胞附着/繁殖；

图5a至5i为根据本发明的实施例包括对照、GCIB照射和商业细胞处理 条件下的聚苯乙烯衬底的部分表面的光学显微照片，并示出了接受GCIB照 射的表面上改善的细胞附着/繁殖；

图6a和6b为聚苯乙烯衬底的部分表面的光学显微照片，其中部分表面 在GCIB照射期间被遮盖，以显示未经照射的被遮盖部分与GCIB照射部分 的平行比照，并示出了GCIB照射部分上改善的细胞附着/繁殖；

图7a和7b为PTEE衬底的部分表面的电镜显微照片，其中图7a示出了 非离子束照射对照部分，图7b示出了GCIB照射部分，其中GCIB照射部分 示出了与对照部分相比显著改善的细胞附着和/或繁殖；

图8为非晶态石英衬底的部分表面的光学显微照片，其中在GCIB照射 期间遮盖部分表面，以便示出非照射遮盖部分和GCIB遮盖部分的平行比对， 并示出了GCIB照射部分和非照射部分上的较高程度的细胞附着/繁殖；

图9为晶态蓝宝石衬底的部分表面的光学显微照片，其中在GCIB照射 期间遮盖部分表面，以便示出非照射遮盖部分和GCIB照射部分的平行比对， 并示出了GCIB照射部分上的较高程度的细胞附着/繁殖；以及

图10为PETE织物表面的部分表面的扫描电镜显微照片，其中在GCIB 照射期间遮盖部分织物表面，以便示出非照射遮盖部分和GCIB照射部分的 平行比对，并示出了细胞在GCIB照射部分优选附着。

具体实施方式

公开多个示例性实施例，示出广泛范围和多种类型的材料表面能够享有 本发明的GCIB处理方法的益处以增强其生物活性。选择这些示例用于说明 本发明应用范围广，不限于一种或几种材料，而是广泛应用于广泛围的材料 表面。

钛示例性实施例

在第一示例性实施例中公开钛表面改善。钛是常用于准备植入哺乳动物 的医疗物品中的材料。0.01mm厚的钛薄膜样本首先在70％异丙醇中清洗2 小时，之后在生物安全橱中进行空气干燥过夜。应该理解，清洗后的钛薄膜 样本，如已经暴露在正常大气环境下的任何钛，很可能具有非常薄的自然氧 化钛表面覆盖层，这是不完全和不完善的。然后，薄膜样本使用30kV加速 电压加速的氩GCIB，以剂量5x10¹⁴离子/cm²被GCIB照射，或保持未经照 射，作为对照组。之后，将钛薄膜(照射过的样本和对照样本)切为0.9cm ×0.9cm的方块，并放置在24孔的多孔(TM)聚苯乙烯板(BD Falcon 351147) 中的单个孔(8个对照方块和8个GCIB照射方块)底部。将由骨(hFOB 1.19， ATCC CRL-11372)获得的人胚胎成骨细胞进行继代培养，并将大约3500个 细胞放置在补充了10％胎牛血清(FBS)和0.3mg/ml G418抗生素(也称为 遗传霉素)的Dulbecco′s Modified Eagle Medium F-12(DMEM/F12)营养混 合物中的每一钛薄膜方块顶部，并在温度为37℃并且空气中CO₂含量为5％ 的潮湿的培养箱中进行孵育。在孵育之后的第一天和第五天，移出培养基样 本，根据厂家说明使用来自普洛麦格(Promega)的CellTiterAqueous细 胞增殖实验对细胞进行检验，使用Dynex OpsysMR酶标仪(plate reader)以 波长490nm进行测量。之后从孔中移除实验溶液，然后通过在孔中钛薄膜方 块上放置-20℃冷冻的甲醇至少30分钟固定钛薄膜和细胞。固定之后，空气 干燥钛薄膜方块，使用日立(Hitachi)TM1000扫描电镜使附着于钛薄膜方 块上的细胞成像。结果显示孵育一天后附着于薄膜的成骨细胞在对照薄膜上 为694.5细胞+/-164.8细胞，在GCIB照射过的薄膜上提高到2082.3细胞+/- 609.2细胞(P＜0.03)。孵育五天后，增殖的成骨细胞在对照上为1598.7细胞 +/-728细胞，对比在GCIB照射过的薄膜上的3898.0细胞+/-940.9细胞 (P＜0.003)。

图1即图表100，其对比对照钛薄膜，示出了hFOB 1.19人胚成骨细胞 附着并以提高的速率在GCIB照射的钛薄膜上增殖。

图2为孵育5天后对照钛薄膜的扫描电镜显微照片200。图3为孵育5 天后GCIB照射的钛薄膜的扫描电镜照片300。图2和图3都以相同的放大 倍率显示，并以相等表面区域成像。对比图2和图3得出，GCIB照射钛薄 膜(图3)具有增强的成骨细胞附着程度，并且更多成骨细胞表现出散布并 产生细胞与细胞的接触，这是在诸如成骨细胞和成纤维细胞的贴壁依赖性细 胞之间起始细胞增殖中重要的因素。材料的GCIB照射，所述材料用于形成 哺乳动物体内的医疗/手术植入物，引起表面变性，使其更适于细胞附着和增 殖。

通过制造更适于细胞附着和繁殖的物体表面，为了提高用于植入哺乳动 物体内或身体组合或体表的植入物的医疗物体的融合应用该作用，包括以下 步骤：1)识别用于植入的物体，其期望提供增强的融合性；2)确定是否物 体的所有表面均需要此加强，或是否将增强限制于仅物体的部分表面更为合 适(如，髋关节假体，其中附着到骨的部分得益于改善的结合，然而球状物 或骼髋臼杯的滑动部分不得益于增强的细胞附着)；以及3)仅GCIB照射期 望提高融合性的医疗物体的部分表面，最后，物体(改性为增强的融合性) 通过医疗/手术方式植入哺乳动物体内。当然，如果优选地，医疗物体表面的 所有部分都得益于增强的融合性，那么，优选地，GCIB照射表面的所有部 分。

可选地，在照射步骤之后和植入步骤之前，融合性还可以通过包括医疗 物体表面上的细胞成长和附着(体外)的步骤得到增强。这可以包括来自特 定个体的细胞的分离、培养和体外附着，其中医疗物体准备植入该特定个体， 或可以包括使用由另一个体或干细胞或其他多能细胞(来自相同或不同的哺 乳动物物种)中获得的细胞。

可选地，照射步骤可以包括使用遮盖物或引导光束或其他方法，以限制 GCIB处理物体所选的部分。

现有技术中，已经显示，微观粗糙的钛表面更适于成骨细胞附着。SLA 钛已经是针对骨移植的普遍应用的材料。SLA处理既改善亲水性又微粗化表 面。GCIB照射和未GCIB照射情况下，比较SLA钛和对照钛(平滑加工) 样本。

比较平滑加工和SLA表面的钛样本(1cm×1cm×0.6mm)，具有氩 GCIB照射和未照射。使用原子能量显微测量技术以粗糙度作为平滑加工和 SLA表面的特征。表1显示，在1平方微米的扫描区域内评估的两类表面的 平均粗糙度(Ra)。

表1

  钛样本   Ra(nm)   平滑加工   8.38   SLA表面   20.08

平滑加工和SLA表面在30kV加速电压、剂量5x10¹⁴氩气团簇/cm²下用 GCIB照射，或作为对照保持未照射。将钛片(每种情况9个样本，总共36 个样本)放置在24孔板的单个孔中，并将大约2500个原代人成骨细胞放置 在补充了10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的Dulbecco′s Modified  Eagle Medium营养混合物(DMEM)中的每个钛样本上，并在温度为37℃ 并且空气中CO₂含量为5％的潮湿的培养箱中进行孵育。在孵育之后的第三 天、第七天和第十天，每个条件下的三个样本从培养基中移出，根据厂家说 明使用来自普洛麦格(Promega)的CellTiterAqueous细胞增殖实验对细 胞进行检验，使用Dynex OpsysMR酶标仪(plate reader)以波长490nm进 行测量，以评价细胞对样本的附着。结果如表2所示。

表2

表2所示的结果显示，在未照射的平滑加工和未照射的SLA钛表面之 间在细胞增殖上不存在什么差异。另一方面，可以看出，在两种情况下(平 滑加工和SLA表面)GCIB照射的表面上增殖得到实质上增强。另外，相比 SLA(Ra＝20.08nm)表面，平滑加工(Ra＝8.38nm)表面上的增殖改善更 为明显。显而易见地，即使由SLA处理的微观粗糙度在过去已被看作细胞 附着和增殖的优选的表面条件，GCIB照射甚至在低粗糙度值(Ra＜10nm) 的情况下提供较好的结果。

玻璃示例性实施例

在第二示例性实施例中公开玻璃表面改善。玻璃是常用于生物实验室用 品的材料。玻璃和玻璃状或类似玻璃的材料也用于制造准备移入哺乳动物的 物体。玻璃盖玻片(康宁玻璃2865-25)形式的厚玻璃衬底首先在70％的异 丙醇中清洗2小时，之后空气干燥。然后，玻璃样本使用30kV加速电压加 速的氩GCIB，以剂量5×10¹⁴离子/cm²照射，或保持未照射作为对照。之后， 在补充了10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的Dulbecco′s Modified  Eagle Medium营养混合物(DMEM)中在玻璃盖玻片(照射样本和对照样本) 上以40,000细胞/cm2的初始密度接种原代人成骨细胞，并在温度为37℃并 且空气中CO₂含量为5％的潮湿的培养箱中进行孵育。观察盖玻片，并在最 初4小时内每隔一小时拍照一次(光学显微镜检查)，以观察细胞附着情况。 4小时后，将营养混合物和未附着细胞移出，并替换新鲜的、补足的营养混 合物，继续孵育。在接种后的24小时和48小时，拍摄另外的显微图像。

图4a、4c和4e为接种细胞后间隔4小时、24小时和48小时(分别) 拍摄的对照玻璃盖玻片的光学显微照片。图4b、4d和4f也为接种细胞后间 隔4小时、24小时和48小时(分别)拍摄的经GCIB照射的玻璃盖玻片的 光学显微照片。通过在每一时间点控制组和经GCIB照射的表面的比较，明 显的是，与未经照射的对照组相比，人胚成骨细胞在经GCIB照射的盖玻片 表面附着数量更多，增殖更好。

聚合物示例性实施例

在第三示例性实施例中公开第一聚合物表面改善。聚合物材料是常用于 生物实验室用品中的材料，例如，聚苯乙烯、聚丙烯等。聚合物材料也用于 制备用于哺乳动物植入物的医疗物体。陪替氏培养皿形式(费希尔科学费希 尔品牌(Fisher Scientific Fisherbrand)08-757-12，)的聚合物衬底使用30kV 加速电压加速的氩气GCIB，以剂量5×10¹⁴离子/cm²照射，或保持未经照射， 作为对照组。另外，作为对比，使用细胞培养皿(BD Biosiences 353003)形 式的聚苯乙烯衬底作为可选的聚苯乙烯表面。商业上获得的细胞培养皿具有 用于增强细胞生长的特殊处理的表面。之后，原代人成骨细胞以2,500细胞 每cm²的初始密度在补充了10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的Dulbecco′s  Modified Eagle Medium营养混合物(DMEM)中接种这三个聚苯乙烯样本(经 照射的陪替氏培养皿和对照陪替氏培养皿样本，以及未经照射的可选的细胞 培养皿)，并在温度为37℃并且空气中CO₂含量为5％的潮湿的培养箱中进 行孵育。观察这三个聚苯乙烯样本，并在最初4小时内每隔一小时拍照(光 学显微镜检查)，以观察细胞附着情况。4小时后，将营养混合物和未附着细 胞移出，并替换新鲜的、补足的营养混合物，继续孵育。在接种后的24小 时和48小时，拍摄另外的显微图像。

图5a、5d和5g为接种细胞后间隔4小时、24小时和48小时(分别) 拍摄的对照聚苯乙烯陪替氏培养皿的光学显微照片。图5b、5e和5h也为接 种细胞后间隔4小时、24小时和48小时(分别)拍摄的经GCIB照射的聚 苯乙烯陪替氏培养皿的光学显微照片。图5c、5f和5i同样为接种细胞后间 隔4小时、24小时和48小时(分别)拍摄的经GCIB照射的聚苯乙烯细胞 培养皿的光学显微照片。通过在每一时间点比较陪替氏培养皿对照和经 GCIB照射的陪替氏培养皿表面以及未照射的细胞培养皿表面，明显的是， 与未经照射的陪替氏培养皿对照或未经照射的细胞培养皿表面相比，人胚成 骨细胞在经GCIB照射的玻璃盖玻片表面上附着数量更多，增殖更好。

部分遮盖陪替氏培养皿形式(费希尔科学费希尔品牌(Fisher Scientific  Fisherbrand)08-757-12)的另一聚合物衬底，之后使用30kV加速电压加速 的氩GCIB，以剂量5×10¹⁴离子/cm²对其进行GCIB照射。使用的遮盖物为 接近聚苯乙烯表面处的非接触阴影遮盖。未遮盖部分接受全部GCIB剂量， 然而遮盖部分不接受GCIB照射，由此作为对照表面。之后，原代人成骨细 胞以2,500细胞/cm²的初始密度在补充了10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素 /链霉素的Dulbecco′s Modified Eagle Medium营养混合物(DMEM)中接种 陪替氏培养皿，并在温度为37℃并且空气中CO₂含量为5％的潮湿的培养箱 中进行孵育。针对最初的4小时，每隔一小时观察聚苯乙烯陪替氏培养皿(经 GCIB照射和未照射区域之间界面处的光学显微镜检查)，以观察细胞附着情 况。4小时后，将营养混合物和未附着细胞移出，替换新鲜的、补足的营养 混合物，继续孵育。在接种后的24小时和48小时，拍摄另外的显微照片。

图6a和6b为接种细胞后间隔4小时、24小时和48小时(分别)拍摄 的部分遮盖的聚苯乙烯陪替氏培养皿的光学显微照片，在遮盖的未经照射和 未遮盖经GCIB照射区域之间的界面处观察。图6a和6b中每幅图的左侧为 经GCIB照射区域，图6a和6b中每幅图的右侧为未经照射的对照区域。通 过在两个时间点比较未经照射和经GCIB照射区域，明显的是，与未经照射 的(遮盖的)部分相比，人胚成骨细胞在聚苯乙烯表面上经GCIB照射的部 分上附着数量更多，增殖更好。

在第四示例性实施例中公开第二聚合物表面改善。遮盖一半条状(30mm 长×10mm宽×1.5mm厚)的聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene，PTFE) 聚合物衬底，并使用30kV加速电压加速的氩气GCIB，以剂量5×10¹⁴离子 /cm²对其进行照射，或保持未经照射，作为对照。使用的遮盖物为接近PTEE 表面处的非接触阴影遮盖。未遮盖的表面部分接受全部GCIB剂量，然而遮 盖的表面部分不接受GCIB照射，因此作为对照表面。从新鲜的前韧带上获 得猪的原代成纤维细胞。猪的原代成纤维细胞以5,000细胞每cm²的初始密 度接种全部(经照射和对照部分)PTEE表面，并允许在补充了10％胎牛血 清(FBS)和1％青霉素/链霉素的Dulbecco′s Modified Eagle Medium营养混 合物(DMEM)中附着24小时，并在温度37℃下在培养箱中进行孵育。随 后的24小时中，移出培养基，使用1×磷酸盐缓冲液简单漂洗细胞，并将细 胞固定在-20℃下预冷冻1小时的甲醇中。使用日立TM-1000扫描电镜拍摄 经GCIB照射部分和未经GCIB照射的对照部分的PTEE表面。结果显示， 在PTEE表面的非GCIB照射部分和GCIB照射部分上的细胞附着之间存在 明显区别。

图7a为接种细胞后24小时后PTEE衬底的非GCIB照射对照表面的扫 描电镜显微照片。图7b也为接种细胞(及随后的固定)24小时后PTEE衬 底的GCIB照射表面的扫描电镜显微照片。

图7a示出了细胞附着少于PTEE表面的GCIB未照射对照部分的1％。

图7b示出了细胞附着接近PTEE表面的GCIB照射部分的100％。

影响表面细胞附着的能力对仅在限制区域内期望细胞生长的多种应用 中非常有用。示例包括PTEE心血管支架，其可以将GCIB照射管腔表面允 许内皮重建，并保持非内皮表面上的完整(未照射)的PTEE表面，以抑制 平滑肌生长和斑块形成；硅有机树脂橡胶管的GCIB照射允许神经元再生； 及其他。

非晶态石英示例性实施例

在第五示例性实施例中公开非晶态石英表面处理。非晶态石英材料是常 用于生物实验室用品的材料，也可作为制备用于哺乳动物植入物的医疗物 体。非晶态石英是公知的对于细胞的表面附着和增殖非常有利的材料。部分 遮盖纯净无菌的非晶态石英衬底，之后使用30kV加速电压加速的氩气 GCIB，以剂量5×10¹⁴离子/cm²对其进行照射。所用遮盖物为接近石英表面 的非接触阴影遮盖。未遮盖部分接受全部GCIB剂量，而遮盖部分不接受 GCIB照射，因此作为对照表面。从新鲜的前韧带上获得原代猪成纤维细胞。 原代猪成纤维细胞在补充了10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的 Dulbecco′s Modified Eagle Medium营养混合物(DMEM)中以5,000细胞每 cm²的初始密度接种在非晶态石英表面，并在温度为37℃并且空气中CO₂含 量为5％的潮湿的培养箱中进行孵育。4小时后，移出培养基和未附着细胞， 替换新鲜培养基，继续孵育。观察表面，并在最初4小时内每小时拍照，另 外在初始接种后的6小时、24小时和48小时拍照。

图8为接种细胞后24小时拍摄并在遮盖的未照射区域和未遮盖的GCIB 照射区域之间界面处观察的部分遮盖的非晶态石英衬底的光学显微照片。结 果显示，无论表面经GCIB照射与否，成纤维细胞更倾向于附着非晶态石英 表面。图8左侧为GCIB照射区域，而图8右侧为未照射对照区域。

晶态蓝宝石示例性实施例

在第六示例性实施例中公开(单晶)晶态蓝宝石表面改善。部分遮盖纯 净无菌的晶态蓝宝石衬底，之后使用30kV加速电压加速的氩气GCIB，以剂 量5×10¹⁴离子/cm²对其进行GCIB照射。所用遮盖物为接近蓝宝石表面的 非接触阴影遮盖。未遮盖部分接受全部GCIB剂量，而遮盖部分不接受GCIB 照射，因此作为对照表面。从新鲜的前韧带上获得原代猪成纤维细胞。原代 猪成纤维细胞在补充了10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的 Dulbecco′s Modified Eagle Medium营养混合物(DMEM)中以5,000细胞每 cm2的初始密度接种在晶态蓝宝石表面，并在温度为37℃并且空气中CO₂含量为5％的潮湿的培养箱中进行孵育。4小时后，移出培养基和未附着细胞， 替换新鲜培养基，继续孵育。观察表面，并在最初4小时内每小时拍照，另 外在初始接种后的6小时、24小时和48小时拍照。

图9为接种细胞后24小时拍摄的在遮盖的未照射区域和未遮盖的GCIB 照射区域之间界面处观察的部分遮盖的晶态蓝宝石衬底的光学显微照片。图 9左侧为GCIB照射区域，而图9右侧为未照射对照区域。通过比较未照射 区域和GCIB照射区域，明显的是，与未经照射的(遮盖的)部分相比，猪 成纤维细胞在晶态蓝宝石表面经GCIB照射的部分上附着数量更多，增殖更 好。

我们相信，晶态材料如蓝宝石的GCIB照射造成非常浅的表层(数十埃) 的部分或全部非晶化。不依赖任何特定理论的情况下，照射实现的非晶态表 面变性，有助于改善的细胞附着和增殖。其他可以有助于改善的可能的机制 是增加表面的湿润性、亲水性和/材料表面电荷状态的改变。

聚合物丝/聚合物织物示范性实施例

织物可以由聚合物或共聚物纤维通过纺织、针织和/或其他非纺织技术制 成。某些聚合物织物(最著名的是聚对苯二甲酸乙二酯)是特别适合用于制 造血管移植物的织物。纺织的聚对苯二甲酸乙二酯(有时写作聚(乙烯对苯 二甲酸酯)，及简写为PET或PETE)纤维的织物也可以其商业名称之一， Dacron，提及，并通常作为用于制造血管移植物的材料。在第七示例性实施 例中，公开纺织的聚对苯二甲酸乙二酯(PETE)的表面改善。由PETE织物 制造的血管移植物有时覆盖蛋白质(例如胶原或白蛋白)以减少血液流失和 /或覆盖抗生素以防止移植物感染。大多数通过使用药理学或生物学试剂设计 用来减少术后再狭窄的方案，涉及直接抑制织物表面上血管平滑肌细胞的增 殖。然而，作为可选的，可以通过在创伤和移植物处使用内皮再生特定助长 剂，间接抑制平滑肌细胞增殖。在过去，内皮再生通常很慢或不完全。在该 实施例中，我们已经评估未覆盖的、纺织的PETE纤维材料的GCIB照射示 出，该方法使材料更具生物活性并更适于帮助内皮再生。

将纺织的PETE织物切成15mm×30mm的片。遮盖一半这些片，之后 使用30kV加速电压加速的氩气GCIB，以剂量5×10¹⁴离子/cm²对其进行 GCIB照射。所用遮盖物为接近PETE织物表面的非接触阴影遮盖，并覆盖 每个织物片的一侧的一半。未遮盖部分接受全部GCIB剂量，而遮盖部分不 接受GCIB照射，因此作为对照表面。将织物片放置在单独的陪替氏培养皿 中，活的鼠内皮细胞(EOMA细胞系)以50,000细胞每cm²的初始密度接 种在全部(照射的和对照部分)PETE织物表面，并允许在37℃下在潮湿的 培养箱中孵育期间，在补充了10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的 Dulbecco′s Modified Eagle Medium营养混合物(DMEM)中附着24小时。 24小时后，移出培养基和未附着细胞。将在-20℃下预冷冻1小时的甲醇放 置在PETE织物上10分钟，以固定附着的细胞。之后，使用扫描电镜对织 物和附着的鼠内皮细胞拍照。使用日立TM-1000扫描电镜拍照具有附着的 鼠内皮细胞的PETE织物的GCIB照射和的未照射对照部分的表面区域。结 果显示，在PETE纺织织物表面的GCIB照射部分和未经GCIB照射部分上 的细胞附着之间有明显的差异。

图10为接种鼠内皮细胞后24小时(在甲醇固定之后)后制作的，处理 过的PETE织物片表面的扫描电镜显微照片。图中左侧的PETE织物部分是 在接种之前未照射的PETE织物的被遮盖的部分。图中右侧的PETE织物部 分为在接种细胞前接受GCIB照射的部分。

图10示出了鼠内皮细胞的在PETE织物的GCIB照射部分上的再生比未 照射控制部分上发展地更为明显。EOMA细胞更趋于附着在接受GCIB照射 的PETE织物部分。

在以上公开的若干实施例中，本发明的方法可以进一步包括结合其他用 于改善表面和/或增强生物活性和融合性的公知方法，包括但不限于，喷砂、 酸蚀、涂层的等离子喷雾、CO₂激光平滑和包括机械、超声、等离子和化学 清洗技术的多种清洗方式，使用表面活性剂或应用具有不同湿润性特征的薄 膜或涂层，紫外线处理，紫外线和臭氧处理，共价附着聚(乙二醇)(PEG) 和应用蛋白质产品，如抗体抗CD-34和/或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽 (RGD肽)和/或胶原蛋白和/或白蛋白。这种结合纳入本发明范围内。

尽管本发明已经为示例性目的公开了应用钛薄膜、玻璃、聚苯乙烯、 PTFE、石英、蓝宝石和PETE织物表面，但应该理解，由下列材料制成的用 于医疗植入的物体：钛和/或钛合金(具有或不具有氧化层)、钴铬合金、钴 铬钼合金、钽、钽合金、多种其他金属和金属合金、包括聚乙烯和其他惰性 塑料的塑料或聚合物或共聚物材料、固体树脂材料、玻璃状材料、纺织、针 织和非纺织的聚合/共聚物织物、生物材料例如骨骼、胶原蛋白，丝和其他自 然织物，包括氧化钛和可以适于应用并具有合适的生物相容性的其他材料的 多种陶瓷。尽管本发明描述了涉及用在医疗移植的物体的领域中的多个实施 例和应用，但本发明人可理解，其应用不限于该领域，并且表面GCIB照射 的概念使它们更有助于细胞生长、附着，并且附着的应用具有更广泛的领域， 这对于本领域技术人员来说将是显而易见的。该更广泛的领域纳入本发明范 围。应该意识到，在本发明和权利要求的精神和范围内，本发明还可以具有 多种其他实施例。