通过mRNA诱导体细胞为多能干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种通过mRNA诱导体细胞为多能干细胞的方法，该方法包括：从小鼠ESC提取mRNA；将所述mRNA包封于至少一种脂质体递送剂中；将体细胞暴露于所述mRNA脂质体；在板或者未涂层培养皿的盖上倒置悬滴培养经暴露的体细胞，持续足以加速细胞聚集的时间；在稀释的琼脂糖凝胶上或者在未涂层的培养皿中混悬培养已聚集的细胞以形成EB；在饲养细胞顶部上或者在涂层板和皿上或者在补充了生长因子的适宜培养基的基质胶上培养EB样细胞；以及选择具有干细胞形态的细胞集落，籍此将所述体细胞去分化为多潜能细胞，用于细胞疗法和化妆品应用。

说明书

本申请是申请号为200680046641.4(国际申请日为2006年10月16日、国 际申请号为PCT/US2006/040723，优先权文件：2005年10月14日申请的 US20050726915P、2006年2月21日申请的US20060358465)、发明名称为“体 内和体外再生细胞的方法”的进入国家阶段的PCT申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及再生细胞的方法以及这些被再生细胞的人类临床和兽医的应 用，更具体地说，涉及通过mRNA诱导体细胞为多潜能(pluripotent)或多能 的(multipotent)胚胎干细胞或干样(stem-like)细胞(也称多能干细胞(iPS)) 的方法。所述的再生方法还适用于哺乳动物的器官和身体。

背景技术

老化是生命不可避免的过程。老化是一种有害的、进行性、普遍性且因而 不可逆的变化综合症。细胞的老化特征在于减少细胞的功能、降低对应激响应 的能力、增加了体内稳态的失衡以及增加了患疾病的风险。因此，老化本身可 被视作“疾病过程”，并且是对大分子、细胞、组织和器官损伤的积聚。

细胞的老化由运行于个体寿命始终的生物钟调节，依赖于影响负责维护、 修复和防御响应的系统的基因表达的变化。老化与在DNA复制过程中细胞分裂期 间的端粒变短相关。老化是由累积突变和损伤而加速的，从大分子(DNA，RNA， 蛋白质，碳水化合物和脂质)到组织，通过自由基、糖化、辐射、交联剂等而 引起的。

目前已确定了在老化过程中的多种基因途径。这些途径的其中一种涉及基 因Sir2，一种NAD+-依赖性组蛋白脱乙酰基酶。额外拷贝的Sir2能够延长蠕虫和 蝇类的寿命。人类似物SIRT1蛋白已被证实为脱乙酰p53、Ku70、特异性组蛋白 残基和叉头家族的转录因子。超氧化物歧化酶，一种防止线粒体自由基作用的 蛋白质，当它被过量表达时可以延长稳定期酵母的寿命。但是，尚未清楚这些 机理是否也存在于人类中，因为在人类和模型有机体之间在生物学和病理生理 学方面存在明显的区别。

通常，生命的质量随老化而下降。因为老化，腱和韧带中的胶原蛋白和弹 性蛋白变得弹性更小和更片断化，特别是由于糖化(由糖交联蛋白质)。关节软 骨变得已磨损，而且接头间关节液变得“更稀薄”。在循化功能方面的衰退有助于 这个过程。胶原蛋白和弹性蛋白还在皮肤中交联，导致弹性的损失。手指甲中 角质蛋白还是皮肤外层(表皮)的成分，其提供了“防水性”。表皮随年龄而变薄， 导致皱褶。汗腺分泌的减少增加了热休克易发性。当与毛囊相关的黑色素细胞 (产生皮肤和毛发着色物质黑色素的细胞)失去功能时，毛发变白。黑色素细 胞功能的部分减少导致毛发变灰。然而，90％白种人表现为黑色素增加，在他们 手背上呈现棕色斑点的形式(“肝斑”)。肺部胶原蛋白和弹性蛋白的韧性损失导 致弹性反冲更小。排气变得更加困难，这减少了空气交换和呼吸，并因此降低 了工作能力。

动物细胞可分为生殖细胞(精子或卵)、干细胞以及体细胞(已分化的功能 性体细胞)。在组织培养中的胚胎纤维原细胞在他们达到50次分裂的Hayflick限 度之前中止分裂(Hayflick L，Moorhead PS Exp Cell Res 1961，25：585-621)。 生殖细胞、干细胞和“永生化”癌细胞包含一种被称作端粒酶的酶，其代替了损失 的端粒，因此使它们不经历Hayflick限度。在人的生殖细胞和大约85％的癌细胞 中，这种酶-人端粒酶逆转录酶(hTERT)和RNA模板足以产生新的端粒。维持端 粒功能所需蛋白质中的缺陷还可导致染色体的不稳定性和癌症。端粒酶表达还 使细胞对氧化性应激所诱导的凋亡产生更大的抗性。

已用端粒酶的逆转录酶亚基转染的人体细胞表达端粒酶。这种细胞显示超 出它们Hayflick限度的20群体倍增，并且继续显示为常规的、健康的和年轻的 细胞外观及活性。这种结果创造了一个现实的期望，采用一种形式的基因治疗， 在体细胞中诱导自体端粒酶的表达或者在自然形成之前将遗传物质添加至工程 化端粒酶组成的细胞中，在一些组织中保存青春是可能的。

关于通过生活方式改变和预防性疾病的预防(例如，减少热量的摄入同时 维持适当的营养、食用低脂肪/高纤维的饮食、避免烟草和酒精、锻炼、以及接 受抗氧化剂补充剂)而减缓老化进程以延长平均寿命，已进行了广泛的研究。但 是，没有极端的生活方式改变，难于取得减缓老化的非常直接的益处。

根据定义，干细胞是未分化的细胞，它能够自我更新并分化为各种功能的 成熟细胞，从神经元细胞到肌肉细胞。未分化细胞分裂以便于形成分化为特定 体细胞和干细胞的子细胞。胚胎干细胞(这里称作“ESC”)衍生自胚胎并且本身 是多潜能的。多潜能细胞可产生大多数但非全部的、胎儿发育所需的组织。多 潜能细胞专门化为通常产生具有特定功能的多能细胞(例如，多能血液干细胞 可产生红细胞、白细胞和血小板)。ESC能够分化为特殊的细胞、组织或甚至器 官类型，取决于所用的分化条件。人ESC在细胞替代疗法和移植术中是非常有用 的，用于治疗疾病如帕金森症、组织移植以及用于药物和毒素的筛选。ESC还可 应用于开发用于移植的细胞培养和制造生物制品，诸如，胰岛素、抗体以及因 子VIII。

ESC在治愈许多人类疾病方面保持有发展前景。但是，对ESC存在一些关注。 首先，关于从胎儿获取ESC存在伦理和政治问题。其次，由NIH资助的研究项目 受限于有限组的22ESC细胞系，它们可能不足以用于基础研究试验。第三，我 们身体中的免疫系统保护对抗植入的ESC。结果是，这可能引起排斥植入的ESC 或脐带血干细胞而且导致移植物抗宿主疾病。

除了应用核移植外，已尝试了用细胞重编程将体细胞转化为多潜能细胞。 Hansis等(Curr Biol 2004，14：1475-1480)描述了一种用非洲爪蟾卵(Xenopus  egg)提取物重编程体细胞(包括人淋巴细胞和人293T肾细胞)的方法。他们发 现，BRG1是体外重编程所必需的。但是，还不清楚是否细胞获得了多潜能性质。 Tada等(Curr Biol 2001，11：1553-1558)描述了一种用体外细胞杂交将体细 胞转变为多潜能细胞的方案。他们将胚胎干细胞(ESC)与分化的胸腺细胞末端 融合。这些ESC-胸腺细胞杂交细胞具有原ESC的多潜能性。但是，这些杂交细胞 是带有不稳定基因组的四倍体细胞，而且不能直接地用于临床治疗。Do及同事 (Stem Cells 2004，22：941-949)描述了一种用体外细胞杂交将体细胞转变成 多潜能细胞的类似方案。他们将神经球(neurosphere)细胞(NSC)与ESC融合。 已融合的细胞具有活化的Oct4，一种ESC中多潜能性必需的基因。他们进一步证 明了，ESC的重编程能力源自ESC核。同样地，这些杂交细胞是四倍体细胞而且 不能用于细胞替代疗法。Collas及其同事(Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2003，358：1389-1395)发表了一系列为细胞疗法而转分化细胞的论文。但是 由于技术难题，他们尚未报道将体细胞成功地转分化为多潜能细胞。

尽管似乎不能将老化停止于年轻阶段，但是替换或修复损伤器官、组织、细 胞甚至分子可能是上佳的策略。这些策略可再生细胞而且恢复年老有机体的功 能。因此，本发明的目的是克服或者至少缓解现有技术的一些问题，并且提供 一种有效地体内和体外再生细胞的更有效且更可行的方法，而且，下面的描述 提供了一种满足上述本领域所需的可行系统并且还提供了额外的优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种再生细胞、组织和全身的、技术上领先的方法。

本发明中所涉及的胚胎、胚胎干细胞、胎儿、胎儿组织、胎儿细胞、ESC、 胚泡细胞及受精卵均是指非人类的胚胎、胚胎干细胞、胎儿、胎儿组织、胎儿 细胞、ESC、胚泡细胞及受精卵。

在一种实施方案中，本发明提供了一种经过如下步骤再生年老细胞的方法， a.提供包括年老体细胞的样品；b.提供包括再生提取物、白蛋白、ATP、磷酸 肌酸、肌酸激酶、核糖核酸酶(RNase)抑制剂以及核苷酸磷酸盐的再生溶液； c.将该再生溶液与年老细胞混合并培养足以使再生溶液成分透过细胞的时间； 和d.加入适宜的细胞培养基溶液，如具有氯化钙和任选地抗生素的KO-DMEM。 在这种方法中，再生提取物可以从发育早期的细胞提取，所述细胞选自卵、受 精卵、胚泡、胚胎、脐带血干细胞、干细胞、原始生殖细胞、胚胎干细胞或胎 儿。胎儿细胞可以是胎儿肝细胞。任选地，再生提取物从细胞或者包含细胞核 的细胞部分提取。任选地，再生提取物可以从处于细胞周期的任何阶段的细胞 或细胞核获得，或者从处于细胞周期的多个阶段的多种细胞或细胞核获得。

在另一种实施方案中，本发明提供了一种经过如下步骤将细胞再生为多潜 能胚胎干样(ESL)细胞的方法：提供包括年老体细胞的样品；提供包括再生提 取物、白蛋白、ATP、磷酸肌酸、肌酸、核糖核酸酶抑制剂以及核苷酸磷酸盐的 再生溶液；用该再生溶液与年老细胞组合在一起并且培养充足的时间，以便使 再生溶液的成分渗透至细胞从而产生再生的细胞；将细胞培养基、氯化钙和任 选地抗生素的溶液加至已再生的细胞以便于扩增细胞群体；将已扩增的细胞倒 置悬滴培养在板或者未涂层培养皿(Petri dish)的盖上充足的时间，以便于加速 细胞的聚集；在稀释的琼脂糖凝胶上或者在已涂层的板和皿上、或者在补充生 长因子的适宜培养基中的基质胶(matrigel)上，混悬培养细胞聚集物，以形成 拟胚体(EB)；在饲养细胞的顶部培养拟胚体样细胞；而且，选择具有与干细 胞相同形态的细胞集落，籍此将体细胞去分化为多潜能细胞，用于细胞疗法和 化妆品应用。该稀释的琼脂糖凝胶可以是约0.2％至2％的琼脂糖。

在另一种实施方案中，本发明提供了一种用胚胎干细胞(ESC)mRNA转染 将体细胞再生为多潜能ESL细胞的方法，包括如下步骤：从多潜能细胞中提取 mRNA；将mRNA包封于至少一种脂质体递送试剂中；将体细胞暴露于mRNA脂 质体；在板或者未涂层培养皿的盖上倒置悬滴培养已暴露体细胞充足的时间， 以便于加速细胞的聚集；在稀释的琼脂糖凝胶上或者在未涂层的培养皿中混悬 培养聚集细胞，以形成EB；在饲养细胞、涂层板和皿上或者在补充了生长因子 的适宜培养基中的基质胶上培养EB样细胞；而且，选择具有与干细胞相同形态 的细胞集落，籍此将体细胞去分化为多潜能细胞，用于细胞疗法和化妆品应用。 所述的多潜能细胞可以是ESC、原始生殖细胞(PGC)、胎儿细胞、卵、受精卵、 脐带血干细胞、组织干细胞、胚泡细胞或者其组合。所述充足的时间是指约两 小时至过夜。除了用脂质体转染，所述的细胞可经过电穿孔或病毒介导。

在另一种实施方案中，本发明提供了一种通过ESC细胞与哺乳动物体细胞融 合而形成用于自体移植的、多潜能、二倍体ESL细胞的方法，包括如下步骤：a. 提供ESC；b.废除ESC中的DNA复制能力；c.将非复制ESC与多个体细胞混合； d.通过向其中加入聚乙二醇，将非复制ESC和体细胞融合；e.将已融合细胞倒 置悬滴培养，以生产聚集细胞；f.在稀释的琼脂糖凝胶上混悬培养聚集细胞， 以生产EB，持续1-10代；g.在饲养细胞、涂层板和皿、或者在补充了生长因子 的适宜培养基中的基质胶上培养EB；而且，h.选择具有与干细胞相同形态学特 征并且包含哺乳动物特异性二倍体ESL细胞的、患者特异性ESL细胞的细胞集 落。所述ESC可用干细胞替代，而且所述体细胞可以是纤维原细胞。废除DNA 复制能力的步骤可以用物理的或化学的处理来实现。所述物理的处理可以是γ辐 射或者曝露于UV光。所述化学的处理可以是结合至染色体DNA的化学品，包括 放线菌素D、依托泊苷、DNA螯合且相互作用试剂、以及其他的化疗剂。

在另外一种实施方案中，本发明提供了一种用年老体细胞与非复制靶细胞 融合以诱导其中重编程而形成二倍体治疗细胞的方法，包括如下步骤：a.提供 靶细胞；b.废除靶细胞中DNA复制能力；c.提供自体体细胞；d.将非复制靶细 胞与自体体细胞组合在一起；e.将聚乙二醇加至上述的组合，以便于融合细胞， 其中非复制靶细胞重编程体细胞的基因组；f.将已融合的细胞培养于适宜的细 胞培养基中，以生成具有靶细胞形态和功能的二倍体细胞；和，g.选择具有靶 细胞形态和功能的自体重编程二倍体细胞，籍此向供体提供重编程的自体二倍 体细胞，用于细胞替换疗法和化妆品。废除DNA复制能力的步骤可以用物理的 或化学的处理来实现。所述物理的处理可以是γ辐射或者曝露于UV光。所述化学 的处理可以是结合至染色体DNA的化学品，包括放线菌素D、依托泊苷、DNA 螯合且相互作用试剂、以及其他的化疗剂。所述靶细胞可以是外源性ESC、成体 干细胞或者分泌胰岛素的细胞。所述体细胞可以是成熟皮肤细胞、血液细胞和 骨髓细胞。

在另一种实施方案中，本发明提供了一种可以代替使用ESC或组织干细胞的 实施细胞疗法和化妆品应用的方法。首先，提供ESL细胞；然后，实施细胞疗法 或化妆品应用，但是用患者特异性二倍体ESL细胞代替ESC或组织干细胞。

在另一种实施方案中，本发明提供了一种局部地再生人皮肤的方法，包括 如下步骤：a.用透化皮肤细胞的物质预处理皮肤；b.施用再生试剂，其选自新 生细胞(novacell)提取物、ESC提取物、干细胞提取物、卵提取物、重组蛋白 质或者其组合；c.保持皮肤与再生试剂接触；和，d.必要时重复步骤a-c。这种 方法可在进行前先消毒皮肤。所述再生试剂可包含细胞或细胞核的提取物，向 其中一种添加白蛋白、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、核糖核酸酶抑制剂和核苷酸 磷酸盐。

在另外一种实施方案中，本发明提供了一种从全细胞制备再生因子的方法， 包括如下步骤：a.提供新生细胞，ESC，组织干细胞，卵或者从胚胎、胎儿、 胎儿组织获得的细胞，重组蛋白质或者其组合；b.分离待提取的细胞；c.对细 胞进行至少两个冻融循环；d.以高速离心细胞；和，e.抽取含有再生因子的上 清液。

在另外一种实施方案中，本发明提供了一种从细胞核制备再生因子的方法， 包括如下步骤：a.提供新生细胞，ESC，组织干细胞，卵或者从胚胎、胎儿、 胎儿组织获得的细胞，重组蛋白质或者其组合；b.分离待提取的细胞，包含胎 儿细胞和/或ESC；c.在低渗缓冲液中裂解细胞；d.离心以分离除去缓冲液；e.对 剩余的细胞核进行至少两个冻融循环；f.离心以获得细胞核的提取物；和，g.任 选地用透析浓缩再生物。

在另外一种实施方案中，本发明提供了一种局部地再生器官的方法，包括 如下步骤：a.提供从细胞或细胞核制备的再生试剂；和，b.将再生试剂定期地 给药至器官，直至在征兆、症状或检验结果方面改善，籍此减慢器官的老化和/ 或改善它的功能。给药的方法可以是通过静脉内、皮下、腹膜内、肌内、心室 内、气管内、关节内、心包内、肺内、鼻内或动脉内的途径。当应用鼻内途径 时，可将再生试剂放置鼻腔内，籍此该再生试剂达到中枢神经系统以便于治疗 神经退行性疾病。

在另一种实施方案中，本发明提供了一种经简化工艺、再生哺乳动物体细 胞并将它们分化为所期望细胞的方法，包括如下步骤：a.用孔道打开处理来处 理体细胞并且用生理缓冲液洗涤；b.将步骤a的体细胞暴露于再生缓冲液、ESC 细胞核提取物和期望的细胞提取物，约1小时；c.将步骤b的细胞培养于 KO-DMEM溶液，该溶液任选地补充了20％FBS、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、 非必需氨基酸、β-巯基乙醇、bFGF、TGF-β1和LIF；d.在平板盖上倒置悬滴培 养所培养的细胞，约两小时至过夜；e.收集和合并倒置的液滴；和，f.在明胶 涂层板上，收集的细胞生长于补充了生产细胞所需试剂的DMEM中，直至细胞 形成期望的细胞类型。在一个变化形式中，体细胞含有纤维原细胞，期望的细 胞类型是肌细胞，而且生产细胞所需试剂包括2％灭活马血清、从成肌细胞的细 胞培养介质过滤的上清液，因此，将所收集的细胞如此暴露，直至形成肌管。 在这种方法中，步骤a的处理纤维原细胞可包括胰蛋白酶-EDTA、链球菌溶血素 O、电穿孔或病毒介导。

在另一种实施方案中，本发明提供了一种再生缓冲液组合物，包含来自细 胞或细胞核或者它们组合的再生因子；1mg/ML白蛋白；1mM ATP；5mM磷酸 肌酸；25μg/mL肌酸激酶；0.4U/mL核糖核酸酶抑制剂；和，各自1mM的4种 dNTP。优选地，组合的提取物为约二分之一胎儿细胞提取物和二分之一的ESC 细胞核提取物。优选地，细胞或细胞核提取物不含细胞。

在一种实施方案中，一种系统性再生哺乳动物身体并且改善总体健康和免 疫功能的方法，包括如下步骤：提供获得自新生细胞提取物、干细胞提取物、 卵提取物、新生细胞、ESC、干细胞、重组蛋白质或者其组合的再生试剂；而且， 根据改善的提示，定期地施用再生试剂。给药的途径可以是静脉内、腹膜内、 肌内、鞘内、鼻内的途径或者其组合。

在另一种实施方案中，一种再生在组织培养中已经过多次传代的细胞的方 法，包括如下步骤：提供预先培养的细胞；提供再生提取物、白蛋白、ATP、磷 酸肌酸、肌酸激酶、核糖核酸酶抑制剂和核苷酸磷酸盐；用再生溶液与细胞组 合在一起并培养充足的时间，使得再生溶液的成分渗透细胞；加入细胞培养基、 氯化钙和任选地抗生素的溶液；和，培养细胞以扩增细胞群体，因此再生在组 织培养中已经过多次传代的细胞。此外，一种关于方法的变化是用下列的步骤 代替了最后的两步：在板或未涂层培养皿的盖上倒置悬滴培养已再生细胞充足 的时间，以便于加速细胞聚集，在0.2％至2％琼脂糖上或者在未涂层培养皿中混 悬培养细胞聚集物以形成EB，在饲养细胞上、在涂层板或皿上、或者在补充了 生长因子的适宜培养基中的基质胶上培养EB样细胞，和选择具有与干细胞相同 形态的细胞集落，因此，将预先培养的细胞去分化为多潜能细胞，用于进一步 的组织培养。

一种治疗无论是否由化疗方案引起的液体癌、白血病、淋巴瘤和造血障碍 的方法，包括如下步骤：首先提供通过提供年老体细胞而制备的再生细胞；提 供包含再生提取物、白蛋白、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、核糖核酸酶抑制剂和 核苷酸磷酸盐的再生溶液；用再生溶液与年老体细胞组合在一起并培养充足的 时间，使得再生溶液的成分渗透细胞；加入细胞培养基、氯化钙和任选地抗生 素的溶液，以扩增细胞群体；分离已再生的细胞；和，将生理溶液与已再生细 胞组合在一起，以便于制备可给药的制品。接下来，为患有无论是否由化疗方 案引起的液体癌、白血病、淋巴瘤和造血障碍的哺乳动物施用已再生细胞。

在另一种实施方案中，本发明公开了一种治疗患有CNS创伤、中风、阿尔 茨海默病、帕金森病或者肌萎缩侧索硬化症患者的方法。第一步是提供再生细 胞，该再生细胞的制备如下：i.提供年老体细胞样品；ii.提供含有再生提取物、 白蛋白、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、核糖核酸酶抑制剂和核苷酸磷酸盐的再生 溶液；iii.将再生溶液与年老体细胞组合在一起而且培养充足的时间，使得再生 溶液的成分渗透细胞；iv.加入细胞培养基、氯化钙和任选地抗生素的溶液，以 扩增细胞群体；v.分离再生细胞；和，vi.将生理溶液与再生细胞组合在一起， 以便于制备可给药的制品。下一步是对患有CNS创伤、中风、阿尔茨海默氏病、 帕金森病或者肌萎缩侧索硬化症的哺乳动物施用再生细胞。

在另一种实施方案中，本发明提供了一种用于再生年老细胞的试剂盒，包 括：a.用于打开年老细胞孔道的试剂，选自胰蛋白酶或链球菌溶血素O；b.再 生缓冲液组合物；和，c.不含细胞的胎儿细胞和ESC细胞核提取物。所述的提 取物可以用源自多潜能细胞的mRNA提取物代替。所述的多潜能细胞可以是 ESC、PGC、胎儿细胞、卵、受精卵、脐带血干细胞、组织干细胞、胚泡细胞， 或者其组合。

附图说明

图1概述了本发明的方法，从个体获得成熟细胞、培养细胞、将细胞再生成 “新生细胞”并且随后用于细胞替代疗法。

图2A-2F表示的是对照纤维原细胞(A、B和C)和用胎儿提取物再生的新生 细胞(D)、用ESC细胞核提取物再生的新生细胞(E)和倒置液体中的再生的纤 维原细胞(F)。图2G-2I表示的是对照老化骨髓基质细胞(G)和用胎儿提取物 再生的新生细胞(H)以及用ESC细胞核提取物再生的新生细胞(I)。

图3A和3B是未处理皮肤活检(A)和具有更多细胞增殖的再生皮肤活检(B) 的显微照片。

图4A表示的是未再生FNSK2细胞；图4B-4F表示的是，在不同阶段，自FNSK2 细胞形成的新生细胞。4B表示的是早期的FN-ESL新生细胞；4C表示的是在拟胚 体中的FN-ESL新生细胞；4D表示的是在基质胶涂层板上进一步的生长；4E表示 的是在琼脂糖凝胶上的进一步生长；和，4F表示的是在饲养细胞层上的FN-ESL 新生细胞。

图5是凝胶照片，表明FNSK2纤维原细胞没有产生三个胚胎干细胞特性异性 生物标志物(Oct4，Ndp52L1和DPP A3)，然而，三个阶段的再生细胞都产生了 所有这些生物标志物。

图6A-6I表示的是初始成熟纤维原细胞和从各种方案得到的新生细胞。图 6B-6E表示的是从处理成熟细胞使得它们可透过再生因子的各种方法获得的新 生细胞。6F-6K表示的是从多种再生提取物获得的新生细胞。

图7A-7D表示的是经放射或放线菌素D损害复制之后、从来自成熟雄性和复 制缺陷干细胞的纤维原细胞而产生的融合新生细胞。

图8是生产用于细胞疗法新生细胞的再生和分化过程的概述。

图9A-9G表示的是新生细胞分别分化为神经前体、神经细胞、分泌胰岛素的 小岛、C-肽阳性小岛(positive islands)、搏动心肌细胞、骨骼肌细胞和脂肪 细胞。

图10A-10D分别表示的是WTCL未再生肿瘤细胞、在饲养细胞上的新生细胞、 ESL新生细胞集落和在饲养细胞上的ESL新生细胞集落。经再生后，肿瘤细胞显 示为更少或者不显现产生肿瘤的能力，如较少的形成琼脂凝胶集落和在裸小鼠 中无肿瘤所显示的。这种再生诱导的去分化可提供一种开发肿瘤疗法的突破性 策略。

图11A-11C表示的是将成熟纤维原细胞转变成再生肌细胞的一步再生/分化 方案的结果。

图12是凝胶印记，说明在经历了再生过程的细胞中端粒酶的再活化；2号、 3号和7号泳道表示的是未处理对照；而且，4号和5号泳道表示的是再生结果， 并且与6号泳道内的ESC阳性对照更好地相比较。

图13概括了应用新生细胞体内产生再生的方法。

图14A和14B表示的是未处理皮肤疤痕和经体内再生的褪色疤痕。

图15A-14D表示的是包括对照老化小鼠的小鼠(A和C)。图15B和D表示的是 更活泼的再生小鼠。

图16是预编程pES载体的示意图。应用限制酶将转录因子克隆入pEGFP-N3载 体。

图17A、17B和17C分别表示的是纤维原细胞，经两步体外表观遗传重编程、 生长在饲养细胞上的多潜能胚胎干样(ESL)细胞，以及生长在基质胶涂层板上 的ESL细胞。

具体实施方式

本发明描述了将年老细胞再生为比原始细胞更年轻和更具潜能的“新生细 胞”的方法。新生细胞变成全能的、多潜能的或多能的。所述再生的细胞已恢复 了老化过程中丧失的功能，因而在人疾病的细胞替代疗法中非常有用。当体内 应用该方法时，细胞再生将减慢或停止组织、器官和全身的老化进程。

本发明的主要优点是，它再生从将要接受再生细胞的患者获得的细胞或组 织。应用这种自体细胞和组织，不存在发生移植物抗宿主排斥的风险。可从各 种来源，包括皮肤、血液或者骨髓，收集待再生的细胞。

图1示意性概述将年老细胞体外再生为潜能新生细胞的方法。首先，收集来 自上年纪人(例如，从皮肤、血液、骨髓或活检组织)的细胞，而且在适宜的 培养基中培养从而扩增细胞群体。任选地，将细胞暴露于细胞膜透化试剂(例 如，胰蛋白酶/EDTA)以打开细胞的间隙连接。经离心和分离透化试剂后，在再 生缓冲液中用再生因子再生细胞。经37C培养一小段时间(约30分钟至3小时) 后，将细胞培养于含有胎牛血清(FBS)和抗生素的培养基中。再生的细胞已增 强了生理功能并且以快于初始年老细胞的速度而生长。这些再生新生细胞可用 于细胞疗法，包括对皮肤的美容应用。

骨髓基质细胞，支持造血作用的间质来源非造血细胞，在培养中是多能性 和自我复制的。类似于ESC，这些祖代可被分化为多种其他的细胞类型，如成骨 细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经元样(neuron-like)细胞和星 形细胞。基质细胞的可塑性是潜在用于细胞替代疗法的基础。

但是，老化还是细胞培养物中骨髓基质细胞生长的重要决定因素。从年老 小鼠中分离的基质细胞比从年轻小鼠中分离的那些生长得更缓慢。因此，希望 体外再生那些骨髓基质细胞，然后将它们用于细胞替代疗法。同样地，希望在 治疗白血病或其他造血疾病的移植之前，再生骨髓细胞以增强骨髓的生长和恢 复。

干细胞定义为多潜能细胞，具有自我更新和分化为特定组织的成熟细胞的 能力(Morrison等，Ann Rev Cell Dev Biol 1995，11：35-71)。ESC的特性之 一是它们在分化培养基中分化为其他细胞的能力。ESC还可生长为未分化的EB。

一般地，将年老细胞再生为潜能新生细胞的方法包括这些步骤，用含有源 自发育早期阶段细胞(例如胚胎、胎儿、胚泡、ESC、干细胞、脐带血干细胞和 卵)的组织和细胞组份的再生试剂，将细胞体外再生为潜能新生细胞。再生提 取物的来源通常比待再生细胞更年轻。

得到的新生细胞比原始细胞在形态学、生理学和功能性方面更年轻地起作 用(younger-acting)和更增殖性的。这些新生细胞相对于初始细胞已增强了 体外和体内的功能。这些年轻作用的实例包括但不限于制造更多的胶原蛋白和 弹性蛋白以及更增殖性的红细胞前体和骨髓细胞。优选地，新生细胞在形态学、 生理学、功能性和多潜能性方面具有ESC的特性。这些新生细胞可用在研究和商 业应用方面，例如，治疗特殊疾病、创造新的可相容器官和组织以及筛选新的 治疗药物，用于代替ESC。

在这里所教导的方法中，可使用多种体细胞，包括但不限于纤维原细胞， 淋巴细胞，表皮细胞，内皮细胞，骨骼、心脏和平滑肌细胞，肝细胞，胰岛细 胞，骨髓细胞，星形细胞和非胚胎干细胞(即组织干细胞)。所述的方法还可用 于再生在组织培养中经历了多次传代的细胞。

新生细胞可用于代替ESC，分化为在细胞疗法中所需的组织或组织特异性前 体细胞。已再生的新生细胞还可用于植入人或者动物的特定器官或组织，以便 于治疗疾病。

术语再生试剂是指能够重编程细胞并且将它们再生为发育早期阶段细胞 (例如新生儿的、胎儿的、胚胎的和ESC)的因子。本发明所用的再生试剂包括 但不限于含有能将体细胞再生为多潜能新生细胞的再生因子的组织提取物、细 胞核提取物或细胞提取物。所述再生试剂包含胚胎、新生儿、新生儿组织、胎 儿、胎盘以及胎儿肝脏和其他组织的组织提取物。所述的细胞核提取物可获得 自ESC、干细胞、脐带血干细胞、生殖细胞和原始生殖细胞(PGC)、卵、受精卵、 胚胎、新生儿组织、胎儿肝脏、其他胎儿组织以及其他未成熟组织。再生因子 还可以是重组蛋白质和重组eDNA和DNA，单独的或者在载体(例如质粒或病毒) 中。在本发明的另一方面，再生试剂包含源自ESC、干细胞、脐带血干细胞、PGC、 卵、受精卵、胚胎、新生儿组织、胎儿肝脏以及其他组织的mRNA或者总RNA。将 这些mRNA或者总RNA导入体细胞使得mRNA在细胞内合成因子，其中它们表观遗传 地重编程基因组而且将细胞再生为全能或多潜能细胞。或者，再生试剂包含新 生儿血清和从ESC、PGC、卵、受精卵、胚胎、新生儿组织、新生儿血清、胎盘、 胎儿肝脏以及其他胎儿组织克隆的重组蛋白质。

新生细胞定义为比尚未被再生的细胞更年轻地起作用并且是更增殖性的再 生细胞。此外，新生细胞显示已改善的功能性并且具有延长的寿命。新生细胞 增强了端粒酶的活性因此必然延长了端粒。这些细胞可无限传代而没有早期的 老化。

新生细胞合成更多的生物化合物，包括但不限于蛋白质、酶、激素和生长 因子。因此，新生细胞在恢复特异性细胞、组织和器官的功能方面是有用的。 例如，年老的皮肤纤维原细胞不能产生或实际上制造很少的胶原蛋白和弹性蛋 白，引起皮肤皱纹。当在年长者中植入或注射入皮肤内以治疗皱纹时，再生的 纤维原细胞的功能类似于胎儿和新生儿皮肤细胞的那些功能，而且产生更多的 胶原蛋白和弹性蛋白。再生的血液细胞，诸如骨髓和造血细胞，是更增殖性的 并且存活更久，因此有益于再生障碍性贫血、先天性贫血、化疗引起的贫血以 及其他血液疾病。

根据治疗目标，可以应用多种给药方法。递送的方法可以变化，包括但不 只限于静脉内、皮下、腹膜内、肌内、脊柱内、脑室内、气管内以及关节内(进 入关节)。再生因子还可施用于皮肤或者置入皮肤贴片，尤其是增加皮肤渗透性 的那种。

这里所用的术语“有效量”用于描述有效产生预期结果的组份(例如分化剂)、 前体或祖细胞、专门细胞(例如神经细胞)和/或其他物质的浓度或数量，想要 的结果包括将干和/或祖细胞分化为专门的细胞，诸如神经细胞或其他细胞类 型。根据本发明的组合物可用于实现组合物内新生细胞的移植，以便于在大脑 或脊髓或者在待治疗疾病或病况中产生有利的变化，无论这种变化是稳定化还 是改善(例如，停止或者逆转各种退化疾病或病况，包括神经缺陷)。

术语“给药(administration)”或“给药(administating)”用于整个说明书， 以描述这样的过程，籍此将本发明主题的细胞(如新生细胞或由此获得的分化 细胞)为了治疗目的而递送至患者。本发明主题的细胞是通过多种途径给药的， 包括但不限于胃肠外的、鞘内的、心室内的、脑实质内的(包括进入脊髓、脑 干或运动皮层)、脑池内的、颅内的、纹状体内的、口服的、局部的以及黑质内 的途径，等等。基本上，可使用任何方法，使得本发明主题的细胞到达最终的 靶点。可以新生细胞或分化细胞的形式施用本发明主题的细胞。根据本发明的 组合物可与未处理的分化试剂(“未处理的”即没有为了促使新生细胞样品内的细 胞分化而进一步处理)或者经过处理(“已处理的”)的分化试剂或者其他试剂一 起使用，所述的其他试剂引起新生细胞样品内的某些干和/或祖细胞分化为显现 分化表型(诸如神经元表型)的细胞。所述的细胞在给药至患者前可经历活体 外分化。

通常，给药取决于所治疗的疾病或病况，而且优选地通过胃肠外的途径， 例如通过静脉，通过给药至脑脊液(cerebrospinal fluid)，通过鼻吸入，通 过直接植入被作用的组织，或者通过其他的系统性或局部的方式。例如，对于 阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病，优选的给药途径为直接地植入CNS(例如， 对于帕金森病而言，是纹状体、黑质体或者两者)。对于肌萎缩侧索硬化症(Lou  Gehrig病)以及多发硬化症，期望优选的给药途径为注射至脑脊液。

术语“移植(grafting)”和“移植(transplanting)”和“移植物(graft)”和“移 植(transplantation)”在本发明整个说明书中以相同意义使用，以描述籍此将 本发明主题的细胞递送至特定部位的过程，细胞在所述部位中预期显示有利作 用，诸如修复患者中枢神经系统的损伤(这能减小所述损伤引起的认知或行为 缺陷)、治疗急性或亚急性神经退行性疾病、由脑血管意外事件(中风)或身体 伤害(创伤)而引起的神经损伤。还可以用本领域技术人员已知的任何给药方 式将本发明主题的细胞递送至身体的远端区域，依赖于细胞迁移至适当区域从 而实现移植。

分子生物学技术

现有技术中已知的而未专门地描述的标准分子生物学技术一般遵循于诸如 Sambrook等，《分子克隆：实验手册》(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY  MANUAL)，Cold Springs Harbor Laboratory，纽约州(1989年，1992年)，和 Ausubel等，《分子生物学的当今方案》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR  BIOLOGY)，John Wiley and Sons，巴尔的摩市，马里兰州(1989年)。聚合酶 链式反应(PCR)方法学通常是采用如Jam等规定于《PCR方案：方法和应用指南》 (PCR PROTOCOLS：A GUIDE TO METHODS AND APPLICA′HONS)，学院出版社，圣 迭戈市，加州(1999年)。涉及其他核酸技术的反应和操作，除非另有说明，通 常是按照Sambrook等，《分子克隆：实验手册》(MOLECULAR CLONING：A  LABORATORY MANUAL)，Cold Springs Harbor Laboratory，以及下列美国专利 的方法而实施的：美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659、 和5,272,057，而且通过引用结合入本文。应用与流式细胞术结合的原位PCR检 测包含特异性DNA和mRNA序列的细胞(例如，Testoni等，1996年，“Blood”， 87：3822)。

现有技术中已知的而这里没有专门描述的免疫学标准方法通常遵循下列的 文献：Stites等(主编)，《基础临床免疫学》(BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY)， 第8版，Appleton & Lange，诺沃克市，康涅狄克州(1994年)；以及Mishell和 Shigi(主编)，《细胞免疫学中的选择方法》(SELECTED METHODS IN CELLULAR  IMMUNOLOGY)，W.H.Freeman and Co.，纽约市(1980年)。

免疫检验

通常，免疫检验是用于评价样品的细胞表面标志物等。免疫细胞化学检验 本领域技术人员熟知的。在检验中可应用多克隆和单克隆两种抗体。至于适宜 的其他免疫检验，诸如酶联免疫吸附检验(ELISA)和放射免疫检验(RIA)，是 本领域技术人员熟知的，而且也可使用。可利用的免疫检验被更广泛地描述于 专利和科学文献中。参见，例如，美国专利3,791,932；3,839,153；3,850,752； 3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074； 3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771；和 5,281,521，以及Sambrook等，《分子克隆：实验手册》(MOLECULAR CLONING：A  LABORATORY MANUAL)，Cold Springs Harbor Laboratory，1989年。对于本领 域的技术人员而言，大量的其他出版物、科学参考文献是易于获得的。

基因疗法

这里所用的基因疗法是指将感兴趣的遗传物质(例如，DNA或RNA)转移至 宿主内，以治疗、预防或者改变各种疾病或病况。所述感兴趣遗传物质编码了 一种体内期望产生的产物(例如，蛋白质，多肽，肽，功能RNA，和/或反义分 子)。例如感兴趣遗传物质编码有治疗价值的激素、受体、酶多肽或肽。或者， 感兴趣遗传物质编码自杀基因。对于详细的综述参考《药理学进展》(ADVANCES  IN PHARMACOLOGY)中的“基因疗法”，学院出版社，圣迭戈市，1997年。

移植用细胞的给药

本发明的新生细胞可根据医疗质量管理规范(good medical practice)进 行给药和用药，同时考虑个体患者的临床状况，给药的部位和方法，给药的方 案，患者的年龄、性别、体重以及医学执业者认为重要的其他因素。用于这里 目的的药学上“有效量”或者剂量方案是由这些考虑而确定的，如在实验临床研 究、药理和临床医学领域中技术人员已知的。所述的数量必须是有效的，以便 于取得症状以及其他指标的稳定化、改善(包括但不限于年轻的外观和功能) 或者消除，所述的指标是由本领域技术人员选择作为疾病进展、衰退或改善的 适当量度。

在本发明的方法中，可以用适于在CNS或其他组织或器官中植入新生细胞的 各种途径施用新生细胞。途径包括，但不限于，胃肠外给药包括静脉内或动脉 内给药，鞘内给药，心室内给药，脑实质内、颅内的、脑池内、纹状体内的、 黑质内给药，以及口服和局部给药。

本发明还考虑到了包含有效量新生细胞的药物组合物。这些组合物包含有 效数目的细胞，任选地，与药学上可接受的载体、添加物或赋形剂组合在一起， 并且混悬于一种或多种适当介质中。在本发明的一方面，对于需要移植的患者， 以无菌盐水而施用细胞。在本发明的另一方面，以汉克斯平衡盐溶液(HBSS)、 Isolyte S pH 7.4或者其他的这类液体而施用细胞，所述液体选自5％葡萄糖溶 液、0.9％氯化钠溶液、或者5％葡萄糖与0.9％氯化钠混合物。稀释剂的其他实例 可选自乳酸林格氏溶液，乳酸林格氏+5％葡萄糖溶液，Normosol-M和5％葡萄糖， 以及酰化林格氏溶液。当然还可应用其他的方法，包括应用不含血清的细胞媒 介物。在某些适应症中，对患者细胞系统性给药是优选的；然而，在其他适应 症中，在位于或者临近已发病和/或损伤组织的地方直接给药可以是优选的，如 药物介绍所确定的以及诸如本领域技术人员所确定的。同样地，本发明考虑了 通过各种其他介质施用患者细胞，包括可注射的或可植入的小球等。

根据本发明的药物组合物优选地包含有效数目的新生细胞，范围为约1.0× 104个细胞至约1.0×1014个细胞，更优选地约1×105至约1×1013个细胞，特别 优选地约2×105至约8×1012个细胞。所述的细胞通常是以混悬液形式给药，任 选地，与为实现药学上可接受结果所要求的药学上可接受的载体、添加剂、辅 助剂或者赋形剂组合在一起。

贯穿本申请，引用了各种专利和专利出版物。在那些出版物内所引述的所 有这些专利和专利出版物公开的内容全部地通过引用结合入本文，目的是为了 更全面地描述本发明所述领域的发展状态。下面的实施例不是为了限制本发明 权利要求的范围，只是为了示例某些实施方案。在示例性方法中本领域技术人 员所想到的任何变更将落入本发明的范围。

实施例

将年老细胞体外再生成潜能新生细胞的示意性概括方法表示在图1中。首 先，从成人，例如，从皮肤、血液、骨髓或活检组织，收集细胞。并且培养于 适当的培养基中，以扩增细胞群体。其次，将细胞暴露于细胞膜透化试剂，例 如胰蛋白酶/EDTA，以便于打开细胞的间隙连接。经离心后，用再生缓冲剂中的 再生因子再生细胞。尽管不期望被任何理论所束缚，再生因子还是被认为进入 了细胞核并改型了染色质。表观遗传重编程(例如，DNA甲基化和组蛋白修饰) 活化涉及细胞生长和老化的基因。经过用这些因子培养后，将细胞培养于存在 胎牛血清(FBS)和抗生素的培养基。再生的细胞增强了生理学功能性(诸如端 粒酶或端粒长度、生长因子表达、胶原蛋白合成和细胞复制能力)并且以快于 原始年老细胞的速度而生长。这些已再生新生细胞在细胞疗法包括化妆品应用 方面是有用的。细胞疗法随着体外分化的新生细胞而改变。用途实例包括但不 限于肝衰竭、胃溃疡、灼烧、白血病以及化疗相关的贫血。

实施例1-培养皮肤纤维原细胞

经消毒后，从年龄49岁男性志愿者的前臂内侧切皮肤活检(2mm2)。用已 消毒剃刀将皮肤活检切成数个小片并且直接放置于6孔板中，其中，用补充了10％ 胎牛血清(FBS)和100U/mL的青霉素和100μg/mL链霉素的、一薄层DMEM培养基 (Invitrogen，Carlsbad，加州)将其覆盖，然后37℃在补充5％CO2的室内空气中 培养。每日用新鲜的DMEM更换培养基。

大约培养2周后，纤维原细胞已开始在皮肤边缘周围生长。用1X胰蛋白酶 -EDTA(Invitrogen)分离纤维原细胞。以1200rpm离心3分钟，分离所得到的 胰蛋白酶/纤维原细胞溶液。重新悬浮纤维原细胞沉淀并计数细胞。根据计数， 将细胞接种于一个新的6-或24-孔、DMEM培养基的板中。收集纤维原细胞并转移 至75mm板或烧瓶，用于进一步扩增。这些年老纤维原细胞比已再生细胞生长得 更缓慢而且产生更少的胶原蛋白和弹性蛋白(参见下文)。将细胞再次胰蛋白酶 化，离心分离，并重新悬浮于10％FBS和8％DMSO中。将这种细胞溶液存储于液 氮中。

实施例2-培养血液或骨髓细胞

骨髓移植的成功率随着年龄增长而下降，因此，人们可推论，优选更年轻 (新生儿的)的细胞用于造血重建。同样，老化还是骨髓基质细胞在细胞培养 中生长的重要决定因素。从老化小鼠中分离的基质细胞比从年轻小鼠分离的那 些生长得更缓慢。因此，希望在用于细胞替代疗法之前，体外再生老化的骨髓 细胞。

白细胞提供了可用于体外再生的末端分化细胞的、快捷且常规的来源。应 用肝素钠作为抗凝剂而收集10mL血样并加至15mL试管，并且用四倍体积的、 含有EDTA(3mM)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释。将稀释溶液装载于50mL圆 锥试管中的Ficoll-Hypaque介质(Sigma，圣路易斯市，密苏里州)上，然后在 20℃、以400rpm在吊桶式旋转器中不间断地离心30分钟。除去上层(血浆)，然 后小心地将中间的细胞层(包含淋巴细胞和单核细胞)移至另一个50mL试管中。 加入含有2mM EDTA的PBS至总体积30mL，然后以300rpm离心另外10-20分钟。 重复这种洗涤步骤，然后将细胞沉淀重新悬浮于300μL脱气缓冲液(PBS，pH 7.2， 补充了0.5％牛血清白蛋白[BSA]和2mM EDTA)。在75-100mm板上，将细胞混悬 于DMEM(Invitrogen)中。活单核细胞(包括干细胞)在约30分钟内附着在板 上。剩余的红细胞和其他的白血病仍混悬于介质中，并且通过简单更换介质将 其洗掉。将附着于板上的细胞胰蛋白酶化，并用于再生。任选地，应用MiniMacs 分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Auburn，加州)，进一步地分离CD34-阳性祖细 胞。收集白细胞沉淀并培养于Myelocult培养基中(H1500，干细胞技术公司，温 哥华市，BC省，加拿大)，该培养基补充了10％FBS和人细胞因子，所述细胞因 子包括干细胞因子(SCF，10ng/mL)、Flt3配体(FL，10ng/mL)、白介素-3(IL-3， 20ng/mL)、IL-6(10ng/mL)、IL-11(10ng/mL)，促血小板生成素(TPO，50ng/mL) 以及促红细胞生成素(EPO，4单位/mL)。细胞因子可购自EMD Biosciences(圣 迭戈市，加州)和BD BioSciences(圣何塞市，加州)。培养物于37℃、在补充 了5％CO2空气中培养。

实施例3-制备用作再生因子的胎儿提取物

在发育早期收集的组织(例如，胎儿和胚胎)是用于再生细胞的极好再生 因子来源。下述小鼠胎儿肝脏的实例说明了这种方法。

从怀孕小鼠收集胎儿，而且将胎儿肝脏解剖分离至含有冰冷PBS的培养皿 中。用无菌剪刀或剃刀将肝组织切碎成小片，用PBS将其转移至玻璃均质器中。 随着研棒温和上下运动约20次，将肝组织均质化。使细胞通过尼龙层，以便于 除去纤维状结缔组织，并且于4℃、以600rpm离心10分钟。用冰冷的提取缓冲液 (50mM HEPES，pH 7.4，50mM KCl，5mM MgCl2，2mM β-巯基乙醇，和5mM EGTA)洗涤细胞两次。用额外含有下列蛋白酶抑制剂的相同缓冲液洗涤细胞： 松胞菌素B，亮肽素、抑肽酶和胃蛋白酶抑制剂A(各10μg/mL)。在冰上培养5 分钟后，以1000rpm离心细胞，1分钟。小心地除去上清液，留下大约一半的溶 液体积。

将细胞经过3个冻融循环(-80℃至室温)，并于4℃、以12,000rpm离心30 分钟。收集上清液提取物，然后加入2％甘油。在液氮中冷冻在0.6mL试管内的 等份试样(0.1mL)并且存储于-80℃。

诸如这样的胎儿和胚胎提取物富含用于再生年老细胞、组织、器官和哺乳 动物全身的因子。这种方法还可以用于提取其他的胎儿组织、全胎儿、胚胎和 胎盘。

实施例4-制备用作再生因子的胚胎干细胞(ESC)

将ESC胰蛋白酶化(参见实施例1)，然后在1.5mL试管中收集大约2 x 107 个细胞。如实施例3中所述，首先用冰冷提取缓冲液洗涤细胞两次，然后经历3 个冻融循环(-80℃至室温)，并于4℃、以12,000rpm离心30分钟。收集上清液 提取物，然后加入2％甘油。在液氮中冷冻在0.6mL试管内的上清液等份试样(0.1 mL)并且存储于-80℃。

这种方法还可用于从其他组织干细胞、脐带血干细胞以及已再生新生细胞 中分离细胞提取物，用于细胞再生。这种方法还可用于从组织如胎儿、胚胎和 胎儿的组织提取组织提取物。

实施例5-从ESC细胞核提取物中制备再生因子

应用如早期所述的方法(Tian等，DNA Repair(Amst)，2002，1：1039-49)， 纯化ESC细胞核提取物。概括地，经室温、2200rpm离心5分钟，得到ESC，然后 用5倍细胞体积的冷PBS洗涤一次。将ESC悬浮于5x细胞体积的缓冲液A中，缓冲 液A是10mM HEPES缓冲剂、1.5mM MgCl2、10mM KCl、0.5mM DTT的低渗缓冲 液。保温于4℃，用玻璃均质器(Wheaton A Dounce均质器，-10个冲程)溶解 ESC，然后通过以2200rpm离心15分钟，收集细胞核。将细胞核置于1/2细胞核体 积的缓冲液C(10mM HEPES缓冲液，25％甘油，1.5mM MgCl2，420mM NaCl，0.5 PMSF，0.5mM二硫苏糖醇[DTT])中，从而提取细胞核蛋白质，于4℃搅拌30分 钟(必要时在Dounce中再均质一次)，然后经过3个冻融循环(-80℃至室温)。4C、 高速(12,000rpm，SS-34)离心混悬液30分钟。然后，在冷室内，将上清液经 50体积的缓冲液D(20mM HEPES，pH 7.9，20％甘油，0.2mM EDTA，100mM KCl， 0.5mM苯甲基磺酰氟[PMSF]和0.5DTT)透析。更换缓冲液，然后经50体积 的缓冲液D透析～2.5小时。将上清液转移至30mL Corex试管中，然后在HB-4旋 转器中、4C、10,000rpm旋转20-30分钟。测量蛋白质的浓度，然后调节至25-30 mg/mL蛋白质，以0.1mL等份试样在液氮中冷冻并储存于-80C，用于以后的细 胞再生。

这种方法还可用于从其他的组织干细胞、脐带血干细胞和已再生的细胞分 离细胞核提取物。

实施例6-再生年老细胞的方法

可以使用从较年轻哺乳动物个体的多种组织或细胞收集的细胞或者细胞核 提取物再生年老的细胞。经再生后，得到的细胞为更多潜能的。经再生后，细 胞在老化过程中丧失的功能性被恢复。用皮肤纤维原细胞来示例这种方法。

根据实施例1中所述而制备纤维原细胞。概括地，将纤维原细胞胰蛋白酶化 然后在1.5mL试管中收集大约3x105个细胞的等份试样。用冰冷的汉克斯平衡盐 溶液(HBSS)洗涤细胞，然后用300-1000ng/mL链球菌溶血素O(SLO，Sigma) 于37C预处理1小时，以便于打开细胞间隙连接。在用200μL冰冷的HBSS洗涤 之后，以1200rpm于4C离心3分钟，然后用缓冲液T(20mM HEPES，pH 7.3，110 mM KAc，5mM NaAc，2mM MgAc，1mM EGTA，2mM DTT，1μg/mL的每种抑肽 酶、胃蛋白酶抑制剂A和亮肽素)洗涤细胞。经离心后，将细胞沉淀混悬于20μL 的再生缓冲液中，该再生缓冲液含有1mg/mL BSA，1mM ATP，5mM磷酸肌酸，25 μg/ml肌酸激酶(Sigma)，0.4U/mL核糖核酸酶抑制剂(Invitrogen)，和各自1mM 的四种dNTP(三磷酸核苷酸)，以及在缓冲液T中制备的ESC细胞核提取物 (Martys JL等，1995年J.Biol.Chem 270：25976-84；Hansis C等，2004年Curr  Biol 14：1475-80)。细胞在水浴中37C培养约1小时，偶尔振摇。在这种再生 步骤之后，通过在6孔板中加入含有2mM CaCl2和抗生素的KO-DMEM，将细胞再 密封，以便于密封被SLO打开的膜孔。每日都更换KO-DMEM培养基，直至再生纤 维原细胞汇合。将细胞胰蛋白酶化并分散至100mm板中，图2表示的是对照纤维 原细胞(图2A和2B)与用胎儿提取物处理的新生细胞(图2D)以及用ES细胞胞 核提取物处理的新生细胞(图2E)的对比。对照纤维原细胞以非常慢的速度生 长而且没有达到汇合；将细胞广泛地分开而且稀疏地分布在板上。相反地，新 生细胞快速地生长而且达到汇合；新生细胞非常拥挤而且排列在一起。在液氮 中储存这些再生细胞，待用。

本发明人考虑到了一些变更。同样地，在细胞再生前，应用蛋白酶(例如， 胰蛋白酶和胶原蛋白酶)、洗涤剂(洋地黄皂苷)和电穿孔来预处理细胞膜。在 另外的实验(数据未列出)中，发现应用二分之一体积的胎儿组织提取物和二 分之一体积的ESC细胞核提取物是优化的。胎儿组织提取物可能作用为再生年老 细胞的引发剂而发挥作用，而ESC细胞核提取物作用为加速再生过程的促进剂。

用这种方法再生的细胞保持了与初始未处理的细胞相同的形态。但是，再 生细胞具有比对照细胞更高的细胞增殖率和更佳的细胞功能。例如，再生纤维 原细胞比未处理的纤维原细胞合成更多的胶原蛋白和弹性蛋白，表现出在化妆 品疗法中的价值(参见下面的数据)。再生骨髓细胞或造血干细胞可用于治疗化 疗方案引起的液态癌、白血病和造血功能障碍。同样地，我们预计再生细胞具 有更长的端粒和更高的端粒酶活性。

实施例7-皮肤组织的再生

这是一种简化的再生年老皮肤组织的方法。按照实施例1获得皮肤活检，然 后培养于补充了10％FBS和100U/mL青霉素以及100μg/mL链霉素的DMEM培养基 中。经过夜培养后，皮肤组织已附着在板上。除去培养基，然后向皮肤组织中 加入50μL再生缓冲液和50μL再生因子(ESC细胞核提取物)。将皮肤组织于37℃ 再生4小时，然后加入一体积含FBS的2xDMEM。培养皮肤组织2星期，每2天更换 一次培养基。图3表示的是左侧的未处理皮肤，具有很少的纤维原细胞长出。右 侧再生的细胞具有从皮肤出现的、许多新生长的细胞而且附着于皮肤边缘。这 些数据说明，可以再生皮肤组织，而不仅是单独的细胞。再生后，皮肤获得了 年轻皮肤的功能而且生长了更多的新生细胞。因此，这种再生方法可用于修复 组织或器官而且恢复了老化组织和器官的功能。

用上述的方法恢复从年老小鼠中分离的骨髓基质细胞。从年老小鼠中分离 的对照骨髓基质(stroman)细胞生长得非常缓慢(图2A)。用胎儿干细胞提取 物再生之后，基质细胞显得非常健康而且以更快的速度倍增(图2H)。有趣的是， 用ESC细胞核提取物再生的基质细胞在培养中生长得甚至更好(图2I)。

实施例8-小鼠皮肤纤维原细胞再生为胚胎干样(ESL)新生细胞

用小鼠ESC的细胞核提取物(实施例5)体外再生小鼠纤维原细胞的细胞系 (FNSK1；Hu等，Mol Endocrinol 1995，9：628-36；Hu等，J Biol Chem 1996， 271：18253-62)。采用三个筛选步骤以便于将纤维原细胞去分化为ESL新生细胞。 经过这种特殊的筛选操作后，只有那些完全重编程的细胞生长于筛选培养基中。 1)首先将再生细胞培养于倒置的液滴中，然后在0.35％琼脂糖凝胶上，在补充了 20％FBS、1x抗生素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)、1mM谷氨酰胺、1％非 必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、4ng/mL bFGF、0.12ng/mL TGF-β1和10ng/mL LIF的Knock-Out DMEM(KO-DMEM)(Invitrogen)中混悬培养。2)筛选ESL集落， 然后生长于胚胎纤维原细胞饲养细胞上。经培养后，有些细胞变成聚集的而且 形成较小的、形态与ESC相同的新生细胞集落。在培养生长2天或更多天后，新 生细胞集落长得更大(图4D)。3)小心地挑选细胞集落，然后接种在新鲜的饲养 细胞上(图4F)。这些衍生细胞被称作FN-ESL，然后扩增并储存于液氮中，除了 小份经保存并针对ESC标志物进行分析。本实验表明，依据去分化方案的体外再 生方法能够诱导纤维原细胞去分化为ESL细胞。基于它们的形态以及端粒酶的表 现(相同于ESC)(参见实施例9和20)，预计这些FN-ESL细胞在细胞疗法中发挥 如ESC一样的作用。

为了检验这种推测，从已培养的FN-ESL细胞生长EB。在含有20％FBS、1000 U/mL LIF的KO-DMEM培养基中培养FN-ESL细胞。用胰蛋白酶分离法收集指数生长 期的FN-ESL，然后在倒置培养皿的盖子上将细胞混悬液制成悬滴(20μL)。在 培养皿的底添加PBS或水。3天后，EB已形成，并被收集至新鲜的、预涂0.1％明 胶的培养皿上。通过FN-ESL形成EB表明，FN-ESL功能类似于ESC。

实施例9-在FN-ESL细胞中表达ESC标志物

应用胰蛋白酶-EDTA，从板上收集FN-ESL细胞。用Tri-Reagent方法(Sigma， 圣路易市，密苏里州)，从细胞中提取总RNA。为了消除在cDNA合成中的DNA污染， 首先用DNA酶I处理RNA样品；然后用RNA逆转录酶合成cDNA(Vu和Hoffman，J Biol  Chem 1996，271：9014-9023；Hu等，Mol Endocrinol 1995，9：628-36；Hu等，J Biol Chem 1996，271：18253-62)。

在cDNA样品中，用PCR检查基因表达，如前面所描述的，Vu，1996年，同上； Yao等，J Clin Invest 2003，111：265-73)。在存在50μM dNTP、1nM引物、 0.125U KT1 DNA聚合酶下，在3.0μL反应混合物中扩增cDNA样品(Hu等，J Biol  Chem，1997，272-20715-20；Yao，2003，同上)。将cDNA和引物加热至95℃，1.5 分钟，然后经35个循环进行扩增，所述循环为95℃、15秒，65℃、40秒和72℃、 30秒。在5％聚丙酰胺-尿素凝胶上，对PCR产物进行电泳，而且用phosphoImage 扫描仪(Molecular Dynamics，Sunnyvale，加州)进行扫描。下列PCR引物用于 mRNA定量：

Oct4：5′-引物(#3284)-AGCACGAGTGGAAAGCAACTCAGA(SEQ ID NO：1)

3′-引物(#3285)-CTTCTGCAGGGCTTTCATGTCCTG(SEQ ID NO：2)

Ndp52L1：5′-引物(#3288)-TAGAAGAGATGGAACAGCTCAGTGA(SEQ ID NO：3)

3′-引物(#3289)-ATTGACCCTCTGTGTTGCTTCCAGT(SEQ ID NO：4)

Dppa3：5′-引物(#3290)-CTATAGCAAAGATGAGAAGACTTGT(SEQ ID NO：5)

3′-引物(#3291)-TGCAGAGACATCTGAATGGCTCACT(SEQ ID NO：6)

β-肌动蛋白：5′-引物(#1483)-TGAGCTGCGTGTGGCTCCCGA(SEQ ID NO：7)

3′-引物(#1484)-GATAGCACAGCCTGGATAGCA(SEQ ID NO：8)

图5表示，泳道1和14为100bp DNA标志物。泳道2、6、10和15包括了未再 生纤维原细胞对照细胞产生的结果。泳道3、7、11和15包括了早期ESL新生细胞 产生的结果。泳道5、9、13和18表示了生长于饲养细胞上的新生细胞所产生的 结果。对照纤维原细胞被最后分化，然而没有表达三种ESC标志物(Oct-4， Ndp52L1和Dppa3)。但是，所有三个阶段的再生的新生细胞都表达了高水平的三 种ESC标志物。内对照β-肌动蛋白相等地表达于所有的细胞类型中，包括对照细 胞。这些数据证实了，体外再生方法能够将体细胞去分化为多潜能的ESL新生细 胞，而且能够分化为其他细胞和组织，用于细胞疗法中的ESC替代。

实施例10-用体外表观遗传的重编程而形成多潜能细胞

如前面的实施例，将纤维原细胞胰蛋白酶化，然后分成大约106个细胞的小 份于1.5mL试管中。离心这些试管，并且倾去上清液。然后，加入50μL的胰蛋 白酶-EDTA(Invitrogen)，而且将得到的混合物于37℃培养5分钟，以便于使细 胞膜透化。以1200rpm旋转细胞3分钟，以沉淀细胞。用缓冲液T(20mM HEPES， pH 7.3，110mM KAc5，5mM NaAc，2mM MgAc，1mM EGTA，2mM DTT，各自1 μg/mL的抑肽酶、胃蛋白酶抑制剂A和亮肽素)洗涤所得的细胞。然后，将细胞 再悬浮于20μL再生缓冲液(2mg/mL BSA，2mM ATP，10mM磷酸肌酸，40U/mL 肌酸激酶，0.5μL核糖核酸酶抑制剂，5μL缓冲液T，10μL ES或胚胎提取物) 中，而且于37℃再生1小时。在再生期结束时，向再生溶液加入280μL补充了10％ FBS5、1x抗生素(100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素)、1mM谷氨酰胺、1％ 非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、4ng/mL碱性纤维原细胞生长因子(bFGF)、 0.12ng/ml TGF-1和10ng/ml白血病抑制性因子(LIF)的KO-DMEM。

如实施例6，还可在细胞再生前应用洗涤剂(例如，洋地黄皂苷)链球菌溶 血素O(STO)或电穿孔来预处理细胞膜。

再生后，细胞被直接铺板时不能自动地去分化为多潜能ESL。但是，再生的 细胞具有短的倍增时间和其他改善的生理功能。应用下列的三步筛选工艺，完 全地分离重编程的细胞。

将已再生细胞培养于20μL液滴中。将细胞液滴置于100mm平板的盖子上， 然后小心地倒置。将PBS置于平板的底。培养细胞过夜。在此阶段，再生细胞是 高度地可移动的；大多数向上移动从而附着于未涂层的板盖上。为了从盖子上 分离这些细胞，将细胞胰蛋白酶化。将所有的细胞液滴合并，其中加入1mL KO-DMEM。然后，得到的细胞生长在饲养细胞(未再生细胞或未重新变成的细胞) 上。维持再生细胞，每天都更换培养基。筛选聚集的ESL细胞集落，然后作为被 混悬于补充了4ng/mL bFGF、0.12ng/mL TGF-β1和10ng/mL LIF的KO-DMEM中 的细胞在0.5％琼脂糖凝胶上生长。未重编程的和部分重编程的细胞不能存活于 混悬液培养基中。经过数代(2-4天)后，将聚集的ESL细胞转移至饲养细胞层上 生长。筛选具有与ESC相似形态和健康细胞类型的细胞，用于进一步的ES标志物 分析。经过数代后，将这些细胞保存于液氮中或者用于细胞分型和分化检验。

经过这三步特殊处理(倒置液滴、在琼脂糖上的混悬细胞以及ESC筛选)后， 这些培养的新生细胞具有不同于初始年老细胞的细胞形态。这些新生细胞是多 潜能性的而且在细胞疗法中可替代正常的异种ESC。因为这些细胞来自于接受 者，自体新生细胞不会引起用脐带血干细胞和其他细胞移植可能发生的、移植 物抗宿主反应。

实施例11-通过体外表观遗传的重编程将人皮肤纤维原细胞转化为多潜能 新生细胞

培养来自49岁男性的纤维原细胞，而且用不同的预处理和不同的细胞提取 物体外再生。经再生后，筛选新生细胞在琼脂糖凝胶的上层生长，并且在显微 镜下拍摄新生细胞集落的照片。数据清楚地表明，用胰蛋白酶-EDTA(图6B)、 链球菌溶血素O(图6C)、洋地黄皂苷(图6D)和电穿孔(图6E)预处理的纤维 原细胞产生了类似的再生细胞，相比于未处理的对照纤维原细胞(图6A)。此外， 用ESC细胞核(图6F)、GC细胞(图6G)、胚泡(图6H)以及非洲爪蟾卵(图6I) 的提取物可类似地再生纤维原细胞。

实施例12-通过复制缺陷的ESC融合而形成多潜能新生细胞

几个研究组已报道，通过用ESC体外杂交或融合而从体细胞(例如，纤维原 细胞)形成ES(例如，Tada等，Current Biology 2001，11：1553-58；和Cowan 等，Science 2005，309：1369-73)。但是，所形成的ESC是四倍体细胞，同时含 有靶细胞和ESC的基因组。对于临床应用而言，四倍体细胞不是理想的，因为它 们被认为是遗传上不稳定的。

为了解决这种问题，我们开发了一种新的方法，用一种“ESC复制缺陷”(ESR) 方法从体细胞构建二倍体的而非四倍体的、多潜能ESC。在这种方法中，我们首 先废除了重编程ESC的DNA复制体系(machinery)的功能，这样ESC基因组不能 复制或有助于新结合细胞的融合。尽管ESC复制被短期阻止，但是，存在的基因 组还是能产生mRNA以及随后的重编程因子蛋白，所述重编程因子蛋白在将靶细 胞转分化(trans-differentiating)为ESC中是必需的。得到的多潜能ESC是二 倍体的。更重要地，这些是个体化ESC，因此可用于在疾病治疗中代替ESC。

废除DNA复制功能所用的方法包括，但不限于，将ESC曝露于辐射、化学的 物质、化疗剂、病毒和物理处理。这些方法已用于阻止饲养细胞的DNA复制。在 ESC中检验了两种废除DNA复制功能的方法。

在一种方法中，将ESC曝露于辐射(铯，3000rds)。经曝露后，ESC DNA被 损伤而且不能复制产生子细胞。但是，这种已处理的ESC在培养至约一周时还存 活，而且许多基因，包括细胞重编程所需的那些基因，仍然是活跃的和表达蛋 白质的。结果是，被辐射的ESC可被用作一种可靠的来源，提供将体细胞转化为 多潜能ESC的重编程因子。由于复制缺陷的特征，ESC基因组不能复制而且在细 胞融合后不能贡献于子细胞基因组。

在另一种方法中，通过将ESC暴露于0.5μg/mL放线菌素D过夜而使DNA复制 无效。经处理后，放线菌素D阻止了ESC中的DNA复制，但是保持蛋白质合成体系 完整。经细胞融合后，已处理的ESC将重编程因子贡献于融合细胞，但是未贡献 于子细胞的基因组。经数代的筛选后，仅有那些二倍体ESC生长而且可用于治疗 应用。

对于细胞融合，将等量的复制缺陷ESC与靶体细胞(例如，纤维原细胞)混 合并且用CMF缓冲液(不含钙和镁的HBSS)洗涤两次。将得到的细胞沉淀离心分 离从而完全地除去残留的缓冲液。然后，拍动试管以便于松动和混合细胞沉淀， 此后，加入1.5-2mL PEG(聚乙二醇1500，编号783641，罗氏，德国)，1分钟 以上。为了混合细胞和PEG，再次轻拍并转动试管。随后，滴加20mL预热的(37℃) PMF缓冲液(0.2M PIPES，pH 6.95，2mM MgSO4和4mM EGTA)，3-5以上，没有 散开细胞团块。缓慢地加入额外的20mL PMF缓冲液，而且小心地将试管倒置以 便于混合细胞。然后，以1200rpm离心分离所得的细胞5分钟，并且重悬浮于补 充了4ng/mL bFGF和0.12ng/mL TGF-β1的KO-DMEM培养基中。如上所述，将融 合的细胞在琼脂糖凝胶上层或在明胶涂层板上混悬培养。

或者，可以应用电穿孔和病毒介导的细胞融合，从而由复制缺陷ESC和靶细 胞构建融合细胞。对于电穿孔，将等量的复制缺陷ESC和靶体细胞混合并用PBS 洗涤3次。以106个细胞/mL的浓度将细胞混悬于0.3M甘露醇缓冲液中。用电融 合(E＝2.5-3.0KF/cm)产生杂种细胞，应用带有1mm电极间隔的载玻片的BTX 电细胞操作系统(Electro Cell Manipulator)2000(BTX，Holliston，缅因州)。 经融合后，培养细胞而且在补充了4ng/mL bFGF和0.12ng/mL TGF-β1的KO-DMEM 培养基中进行筛选。

经融合后，用复制缺陷ESC所提供的因子在融合的细胞中对体细胞的细胞核 进行表观遗传地重编程。经过数代后，初始复制缺陷ESC的基因组已完全地消失 而留下重编程的体基因组在融合细胞内。在筛选后，培养的新生细胞具有多潜 能性而且是二倍体细胞，因此可用于细胞替代疗法。

数据表明，辐射(图7A和7B)和放线菌素D(图7C和7D)引起缺陷DNA复制。经 细胞融合后，筛选和扩增二倍体ESL-新生细胞。这些二倍体ESL-新生细胞是来 自患者的ESC，而且不存在重编程供体细胞(E12ESC)基因组污染的风险。这 些融合的细胞具有与ESC相同的形态和生长速度。同样地，融合的细胞表达ESC 生物标志物Oct4、Nanog和Stellar。因此，融合的细胞在细胞替代疗法方面是 有用的。

实施例13-多潜能新生细胞的分化

图8是示意性概括本发明的方法，将年老细胞再生为多潜能新生细胞、然后 为已分化细胞。如图1，首先收集年老细胞并培养于适当的培养基中以扩增细胞 群体。在细胞暴露于细胞膜透化试剂(例如，胰蛋白酶/EDTA)以打开细胞的间隙 连接之后，在再生缓冲液中用再生因子再生细胞。经再生后，将细胞培养于补 充了特定生长因子的适当培养基中。然后，在饲养细胞或涂层的基质(例如， 基质胶或琼脂糖)上筛选多潜能新生细胞的集落。所选的新生细胞具有胚胎干 细胞(ESC)或其他组织特异性干细胞的基本特征，而且可用于在细胞疗法中替 代ESC和干细胞。这些新生细胞的一个优点是，它们可源自相同的患者，因而显 著性地减少或消除在返回患者时的免疫排斥的机会。另一个优点是，当新生细 胞用于细胞疗法时，由于避免了使用人的胚胎，因此不存在伦理或政治的顾虑。

这些方法随着所探索细胞的类型而改变。通常，用于分化胚胎干细胞的已 公布方法适于分化ESL-新生细胞。下面是如何将新生细胞分化为脂肪细胞和骨 细胞的实例。

37℃在1000U/mL的LIF存在下，在含20％FBS的KO-DMEM中培养ESL新生细胞。 将细胞混悬液制备成培养皿上的悬滴(30μL)。在培养皿底添加PBS。2天后， 拟胚体(EB)形成，然后被收集到用0.1％明胶预涂的新培养皿上。对于脂肪细 胞的分化，将附着的EB用10-6M的全反式视黄酸(ATRA)处理3天，然后用10-7M 的胰岛素和2X10-9M的三碘甲状腺原氨酸(T3)。对于成骨细胞分化，在开始的第 5天，在含有3X10-4M的抗坏血酸磷酸酯和10-2M的Y-甘油磷酸酯的培养基中用 10-8M的1，25(OH)2维生素D3处理EB。在10天、20天和30天，终止培养，然后用 于免疫组织化学染色。经分化后，用免疫组织化学染色法确定脂肪细胞和骨细 胞的形成。

对于在已分化脂肪细胞中染色脂质，用PBS洗涤细胞并于10％中性福尔马林 中室温固定2分钟。经过用自来水漂洗后，用油红O染色细胞10-12分钟，直至油 滴在显微镜下可见是染色的。然后，用50％异丙醇和自来水漂洗载片。用苏木精 复染细胞10分钟。在光学显微镜下，观察已分化脂肪细胞(图9G)。在未处理的 对照纤维原细胞中不存在脂质染色(未示出)。相反地，经分化后，FN-ESL新生 细胞合成积聚于细胞质中的脂质。这些数据表明，FN-ESL新生细胞具有此潜能 而且确实分化为脂肪细胞。

实施例14-FN-ESL新生细胞分化为骨骼肌细胞

如上所述，形成EB。将所得到的FN-ESL细胞(大约5x105)转移至倒置的、 细菌培养皿中，在Iscove改进的Eagle培养基(Invitrogen)中，补充了20％FBS、 2mM L-谷氨酰胺、1x非必需氨基酸、450μM单硫代甘油(Sigma)和抗生素。在 5-7天后，将EB平铺至0.1％明胶涂层的6-孔组织培养皿中，密度为7-10个EB/孔， 并且培养4天。用Dulbeccos-PBS(D-PBS)洗涤细胞，然后用补充了2％灭活马血 清和1mL的C1C12培养介质上清液(用0.2μm过滤器过滤)的、2mL/孔的DMEM培 养。每天都更换培养基，共2-4天。随后用显微镜观察，在分化过程中肌管形成。

用免疫组织化学法确定骨骼肌的分化。用D-PBS洗涤已分化的细胞3次，然 后用100％乙醇固定5分钟。室温下，在含有0.05-0.1％皂苷的D-PBS中，用1-2％常 规山羊血清阻挡背景。将一抗稀释于含有4mg/mL的BSA和0.05-0.1％皂苷的D-PBS 中。加入小鼠抗MHC一抗(Sigma，1∶500)而且培养室温1-3小时或者4℃过夜。然 后，用D-PBS洗涤细胞5次(2次快速漂洗，1次15分钟，2次5分钟)。加入二抗溶 液(山羊抗小鼠1∶1000)而且室温培养0.5-1小时。在用含有0.05％皂苷的D-PBS 洗涤5次(同样的方案)之后，用Zeiss Axiovert 200倒置荧光显微镜观看细胞。

在对照细胞中不存在骨骼肌蛋白质的免疫染色(未示出)。经分化后，FN-ESL 新生细胞被聚集而且融合为肌管和合成骨骼肌特异性蛋白质(图9F)。这些数据 表明，FN-ESL新生细胞具有此潜能而且确实分化为骨骼肌。

实施例15-FN-ESL新生细胞分化为心肌细胞

在BMM2/NG饲养细胞上、在补充了20％FBS、1000U/mL LIF、L-谷氨酰胺、 非必要氨基酸以及β-巯基乙醇的Knockout Dulbecco′s改进的Eagle培养基 (KO-DMEM)中培养FN-ESL新生细胞。以30戈瑞(Gray)的Y-照射预处理BMM2/NG 饲养细胞，以停止它们的复制。在不含LIF的KO-DMEM中密度为大约2.0x106个细 胞，将FN-ESL新生细胞接种于细菌培养皿中，从而形成EB。3天后，收集EB并铺 板至1％基质胶涂层的培养皿、在10％FBS/KO-DMEM中。两个小时后，将100ng/mL 肌动蛋白A加入培养基而且培养细胞24小时。再次用10％FBS/KO-DMEM替换培养 基，共6小时。然后，将10-6M ATRA加至培养基而且细胞再培养24小时。用含有 10ng/mL bFGF的10％FBS/KO-DMEM处理细胞，共3天，然后切换至N2培养基， 其含有补充了B27、1μg/mL层粘连蛋白、10mM烟酰胺和10ng/mL bFGF的DMEM/F12 (1∶1)。这种N2培养基每天都更换直至分析。

在N2培养基中的第4天，在培养中存在搏动的细胞簇。将一些搏动的心肌细 胞转移至载片并且用4％多聚甲醛的PBS固定，于4℃过夜，然后用磷酸盐缓冲液洗 涤两次。室温下，用马血清封闭非特异性结合位点1小时。应用下列的一抗和稀 释比∶胰岛素AB-6小鼠单克隆抗体(Lab Vision，弗利蒙特市，加州)1∶200， 肌钙蛋白T小鼠单克隆抗体(Lab Vision，弗利蒙特市，加州)1∶100和抗C-肽抗 体(LINCO Research，Inc.，圣路易斯市，密苏里州)1∶100。根据制造商说明书， 应用第二即用型通用抗体。DAB(3，3′-二氨基联苯胺)用作反应底物。用Zeiss  Axiovert 200倒置显微镜拍摄图像(图9C-E)。

这些数据表明，FN-ESL新生细胞能够分化为功能性搏动的心肌细胞。

实施例16-FN-ESL新生细胞分化为分泌胰岛素的胰腺β细胞

如上所述，形成EB。应用经小改变的所述用于小鼠ESC的三步方法(Shi等 Stem Cells，2005，23：656-62)，分化分泌胰岛素的细胞。我们完成标准免疫 组织化学方案，使用了即用型Vectastain通用快速试剂盒(Vector Laboratories， Inc.，Burlingame，加州)。概括地，用4％多聚甲醛的PBS于4℃固定过夜，然后 用磷酸盐缓冲液洗涤两次。用马血清封闭非特异性结合位点，此后应用胰岛素 Ab-6小鼠单克隆抗体(1∶200；Lab Vision)和抗D-肽抗体(1∶100；Linco  Research，Inc.)培养细胞。根据制造商说明书，应用第二即用型通用抗体。DAB 用作反应底物。用Zeiss倒置显微镜拍摄图像。在对照细胞中，不存在胰岛素的 免疫染色。经分化后，观察到有些FN-ESL新生细胞已聚集为细胞岛。岛中的细 胞合成了在它们的细胞质中可看到的胰岛素(在图9C和9D中的棕色)。更长时间 的诱导导致在大质量的细胞中胰岛素信号积聚。这些数据表明，FN-ESL新生细 胞具有此潜能而且确实分化为产生胰岛素的细胞。

实施例17-FN-ESL新生细胞分化为分泌胰岛素的神经细胞

用Zhang等以前所描述的方法(2001，Nat Biotechnol 19：1129-33)实现 从FN-ESL新生细胞生成神经外胚层细胞。概括地，在聚集为EB后，分化的ESC1 在FGF-2存在下形成大量的神经管样(tube-like)结构。根据它们不同的粘附 性分离并纯化神经前体。在用脑源神经营养因子(BDNF)置换FGF-2之后，细胞 分化为神经元、星形细胞和少突细胞。如前所述(Zhang等，同上)，进行神经 细胞的免疫组织化学染色。本实验中所用的一抗包括抗巢蛋白(Chemicon， Temecula，加州，1∶750)和βIII-微管蛋白(Covance Research Products，伯 克利市，加州，1∶2000)多克隆抗体。应用适宜的荧光二抗，可看得到抗原(图 9A和9B)。这些数据表明，ESL新生细胞能够并且确实分化为神经细胞。

实施例18-将人维尔姆斯氏肿瘤细胞系转化为ESL新生细胞的方法

为了说明人细胞转化为新生细胞，应用上述的方法，用小鼠ESC的细胞核提 取物体外再生人维尔姆斯氏肿瘤细胞系(WTCL)。培养已再生的细胞而且在胚胎 纤维原细胞饲养细胞上进行筛选。在培养后，有些细胞开始聚集而且形成具有 ESC形态的、小的新生细胞集落。小心地挑选细胞集落并接种于饲养细胞上。图 10A表示的是未变化的WTCL肿瘤细胞。图10B表示的是WT-ESL新生细胞集落。图 10C表示的是在饲养细胞上的WT-ESL芽；和图10D表示的是在饲养细胞上的 WT-ESL新生细胞集落。这些结果表明，体外再生的方法能够诱导人细胞细胞去 分化为胚胎干样细胞。然后，应用上述的方法，能够将这些WT-ESL新生细胞分 化为各种细胞类型。在再生后，肿瘤细胞显示很差的或者没有产生肿瘤的能力， 如所示的，在裸鼠中极少形成琼脂胶集落和没有肿瘤。这种再生诱导的去分化 可提供一种开发肿瘤疗法的突破性策略。

实施例19-一步再生和分化(OSRD)方案

如上所述，首先将年老体细胞再生为多潜能新生细胞，随后分化为其他细 胞，如脂肪细胞、骨细胞、心肌细胞(cardiocytes)、骨骼肌和分泌胰岛素的 细胞。这些操作可耗时数月。为加速这个过程，我们将这两个操作合并为简单 的一步方案(这里称作OSRD操作)，将ESC细胞核提取物用作再生因子，而特异 性细胞提取物用作分化诱导物。下面是一个以纤维原细胞开始而以骨骼肌结束 的实例。用ESC的细胞核提取物和肌肉提取物同时地处理纤维原细胞。

纤维原细胞小份(大约106个细胞)放入1.5试管中。在50μL胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)处理而且用缓冲液T洗涤之后，将细胞重混悬于50μL含有ESC细胞 核提取物和骨骼肌提取物的再生缓冲液(1ng/mL BSA，1mM ATP，5mM磷酸肌 酸，25μg/mL肌酸激酶(Sigma)，2U核糖核酸酶抑制剂(RNasin)[Promega，麦 迪逊市，威斯康星州]，100μM GTP，和1mM dNTP(核苷酸三磷酸盐))。将细 胞于37℃再生1小时。然后，将得到的细胞培养于倒置的液滴中，在补充了20％ FBS、1x抗生素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)、1mM谷氨酰胺、1％非必 需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、4ng/mL bFGF、0.12ng/mL TGF-β1和10ng/mL LIF的KO-DMEM中。在第2天的上午，收集倒置的液滴且合并，然后将收集的细胞 培养在明胶涂层的板上，在补充了2％灭活马血清和1mL鼠成肌细胞(C1C12)培养 基的上清液(经0.2μm过滤器过滤)的DMEM中。每天都改变培养基，共2-4天。用 免疫荧光染色法检验分化过程中所形成的肌管。

用显微镜照片成像法(photophotographs)和免疫组织化学染色法检查骨 骼肌的形成。经再生后，纤维原细胞在琼脂糖凝胶长成小EB(图11A)。在分化 中，细胞聚集并融合为肌管(11B)，而且合成骨骼肌特异性蛋白质(11C)。这 些数据表明，应用一步再生分化，可将纤维原细胞直接地再生并分化为骨骼肌。

实施例20-端粒酶的再活化

真生殖细胞和干细胞含有一种取代端粒、被称作端粒酶的酶，因而防止它 们经受Hayflick限度。在人的生殖细胞和大约85％癌细胞中，这种酶人端粒酶逆 转录酶(h TERT)和一种RNA模板足以产生新的端粒。

为了确定上述的再生细胞是否与生殖和干细胞一样含有端粒酶，我们用 TRAP检验法(Kim NW等，Science 1994266：2011-15)检测了端粒酶的活性。 图12表示的是未再生和已再生纤维原细胞的端粒酶产物。在泳道2和3中所显示 的，分别包括人皮肤JH1纤维原细胞和小鼠皮肤FNSK6纤维原细胞，未再生细胞 不具有可检测到的端粒酶产物。类似于泳道6中所示ESC的结果，两种类型的已 再生细胞产生端粒酶的产物(泳道4和5)，证明了细胞中的端粒酶活性。

实施例21-体内再生组织或器官的方法

上面所述的再生因子，包括细胞核提取物、胚胎干细胞提取物、干细胞、 脐带血干细胞和新生细胞，同样地可直接用于体内再生方法，以便于再生组织、 器官和身体。这可以通过局部地应用再生因子系统性地或通过将再生因子注射 至期望起效的部位而实现。这被概括于图13中。

作为一个体内再生的实例，我们在一名男性愿者中试验了除去皮肤色素沉 着，该男子在其右手上有严重的、损伤引起的色素沉着区域。以细胞核提取物 或ES细胞的细胞提取物局部地施用于皮肤，可再生皮肤(例如，减少色素沉着 和皱纹)。首先用70％异丙醇消毒待再生的皮肤。然后，将一层胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)施用于该区域并保持10分钟，无需干燥。然后用0.9％盐水溶液冲 洗。将两层全纱布海绵(ALL-Gauze-sponge)浸泡于用1x再生缓冲液制备的人 ESC提取物中，并且轻轻地施用于透性区域。为了防止蒸发，用薄塑料覆盖ES提 取物浸泡的海绵，而且用适当的胶带将塑料的边缘密封到皮肤上。经过夜的再 生后，用0.9％盐水溶液洗涤，而且对再生区域施以一薄层皮肤用乳液。重复这 种操作每周一次或两次，共2周，还可根据需要而重复。图14A表示的是处理前 色素沉着的皮肤区域(箭头)。图14B表示的是经2周治疗后非常小的色素沉着区 域。经再生后，皮肤变得光滑、有光泽且清新。经再生处理后，同样色素沉着 完全消失。患者未经历不适。这些数据表明，体内再生组织是非常可行的。

再生皮肤的另一种方法是在皮肤下皮下地注射细胞核提取物或ESC和干细 胞的细胞提取物，每周两次。细胞核提取物中的因子再生皮肤细胞而且出去色 素沉着和皱纹。再生皮肤的另外一种方法是在皮肤下皮下地注射ESC、干细胞或 脐带血干细胞。被注射的细胞在皮肤下繁殖并且分泌生长因子，该因子再生皮 肤细胞和除去色素沉着及皱纹。

实施例22-再生全身的方法

可将上述的再生因子系统性地递送，以再生全身。再生因子包括，但不限 于，细胞核提取物和源自ESC、干细胞、脐带血干细胞以及新生细胞的细胞提取 物。被培养的细胞，包括干细胞、脐带血干细胞和新生细胞，同样地可用于这 个目的。为了再生身体，可将细胞核提取物和ESC、干细胞、脐带血干细胞以及 新生细胞的细胞提取物直接施用至人的身体，应用已知和规范的临床方法，包 括静脉注射、皮下注射、肌内注射、鞘内注射、鼻喷雾、植入缓释微球、局部 应用等。将细胞核提取物或细胞提取物中的再生因子暴露于身体的每个组织和 器官。同样地，应用常规的方法，可施用细胞，包括ESC、干细胞。脐带血干细 胞和新生细胞。这些细胞在它们达到组织和器官后能够存活和繁殖。局部地， 它们将被分化并取代老化的细胞。

在一项研究中，将再生试剂系统性地应用于再生动物。将老的无胸腺小鼠 (nu+/nu+，2年龄)分为三组。第1组(2只小鼠)经尾静脉接受ESC提取物，1mL提 取物/只小鼠，每周两次共3周。第2组(2只小鼠)经静脉接受PBS对照溶液。第3 组(2只小鼠)经尾静脉接受GN-ESL(在1mL中约107个)，每周两次共3周。每两天 记录食物消耗和体重。用摄像机记录动物的活动。

图15A和15C表示的是PBS-对照年老小鼠。图15B表示的是应ESC提取物再生 的小鼠。图15D表示的是用新生细胞再生的小鼠。经过处理3周后，在所有检测 的变量包括体重、食物消耗、外观和活动中，对照组没有经历显著性变化。但 是，用ESC提取物或用FN-ESL新生细胞处理的小鼠消耗更多的食物，尽管在体重 方面没有显著性差异。同时，被再生的小鼠比对照小鼠在体质方面更活跃和精 力更充沛。最有趣的是，被再生小鼠的更细纹的皮肤显得比对照小鼠更平滑、 更厚和更健康。这些数据尽管是初步的，但是揭示了，由ESC提取物或FN-ESL新 生细胞的再生改善了年老动物的生活。

这些体内再生方法可用于增强免疫功能，改善全身的健康，提高运动的能 力，有助疾病和瘫痪的康复，延长人的寿命，改正CNS系统的先天性缺陷，修复 被创伤或年老的器官(例如，心脏，肾脏，肝脏和大脑)，将老化的白发转变为 年轻的黑发，减少皮肤的皱纹和色素沉着，和治疗神经退行性疾病如阿尔茨海 默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化症(Lou Gehrig病)以及中风。

实施例23-用两步体外细胞重编程将体细胞再生为多潜能胚胎干样(ESL) 细胞

1.构建预编程载体。如在我们的小鼠体细胞重编程研究中，我们将三种 人ES细胞转录因子(Oct4，Sox2，和Nanog)克隆至哺乳动物表达载体(pEGFP-N3， Clontech，Palo Alto，加州)中。应用从人ES细胞系H7(NIH编号WA07)制备的 cDNA，PCR扩增转录因子。用限制性酶(Nhe1，Bg12和EcoR1)酶切全长cDNA产物 并且克隆至pEGFP N3载体中(图16)。在两个启动子(分别是pCMV和pTK)控制下 表达这些转录因子，而且用内部核糖体进入位点(IRES)和转录终止多聚A信号 (BGH-pA和SV40-pA)将其分开。最后的编程载体(pES)具有三种转录因子和串 联次序为pCMV-Oct4-IRES-Sox2-BGHρA-pTK-Nanog-IRES-EGFP-SV40pA(图16)。 用CMV启动子(pCMV)转录Oct4和Sox2，而用TK启动子(pTK)驱动Nanog和EFGP。 用EGFP示踪表达载体蛋白的细胞。

2.用ES细胞转录因子预编程人纤维原细胞.将四种细胞系(HFB1，JHF1， HSF1，和HBS1)保持于补充了10％胎牛血清和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素 的DMEM培养基(Invitrogen，Carlsbad，加州)中，而且生长于37℃、5％CO2条件 下。根据制造商的手册，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)包封的预编程pES 载体DNA(4μg)瞬时转染指数生长期的细胞(2x105)。在转染后七十二小时，用 FACS(FACSVantage SE，Becton Dickinson)分选表达载体蛋白的细胞，并接种 于新的6孔板中。汇合后，收集细胞，并用于下述第二步重编程。

3.用ES细胞核提取物表观遗传地重编程预编程的细胞。经过用三种ES转 录因子预编程后，用ES细胞提取物处理细胞以全部恢复纤维原细胞基因组的表 观基因型。应用如上所述的方法(Tian等，DNA Repair(Amst)，2002， 1：1039-49)，从人H7ES细胞系中提取胚胎干细胞的细胞核提取物。细胞用500 ng/ml链球菌溶血素(Sigma，圣路易斯市，密苏里州)进行膜透化(Taranger CK， Noer A，Sorensen AL，Hakelien AM，Boquest AC，Collas P.Induction of  dedifferentiation，genomewide transcriptional programming，and  epigenetic reprogramming by extracts of carcinoma and embryonic stem  cells(“用癌和胚胎干细胞的提取物诱导去分化，基因组转录编程，以及表观遗 传重编程”).Mol Biol Cell 2005；16：5719-5735；Hansis等，Curr Biol 2004， 14：1475-1480)，然后混悬于10μl转运缓冲液(20mM HEPES，pH 7.3，110mM KAc，5mM NaAc，2mM MgAc2，1mM EGTA，2mM DTT，各自1μg/ml的抑肽酶、 胃蛋白酶抑制剂A和亮肽素)。然后，通过加入在重编程缓冲液(2mg/ml BSA，2 mM ATP，10mM磷酸肌酸，40U/ml肌酸激酶，和20U/ml RNASE OUT(Invitrogen)) 中制备的10μl H7ES细胞提取物，于37℃将膜-透化的细胞重编程1小时。在细 胞重编程后，用2mM CaC12密封细胞膜，通过加入补充了10％FBS、1x抗生素(100 U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)、1mM谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、4ng/ml碱性纤维原细胞生长因子(bFGF)以及0.12ng/ml TGF-β1 的500μl KO-DMEM培养基(Invitrogen)而停止反应。

4.完全重编程细胞的筛选.通过将以上处理的细胞悬于培养皿盖上的液滴 (20μl)中，筛选完全重编程的细胞。在悬滴中，完全重编程的细胞以簇的形 式而聚集，而且附着于培养皿的盖子，未重编程的细胞则以单独的细胞而留于 培养基中。从培养皿的盖子上收集成簇的重编程细胞，然后培养在饲养细胞上、 在补充了生长因子的KO-DMEM中。那些完全重编程的细胞的细胞形态进一步变得 接近ES细胞，而且在饲养细胞上形成典型ESL细胞克隆。收集ESL细胞克隆并在 不含饲养细胞的mTeSR1培养基中扩增，如Ludwig等所描述(Ludwig TE， Bergendahl V，Levenstein ME，Yu J，Probasco MD，Thomson JA. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.Nat Methods 2006；3：637-646.)。

5.完全重编程的ESL细胞是多潜能性的。早期，我们在试验中说明了在源 自饲养的雄性阿尔及利亚小鼠(M.Spretus)和雌性C57B/c的小鼠纤维原细胞 细胞系FSK6中检验这种重编程的方法(Hu等，1996，J Biol Chem 271：18253- 62)。在条件培养基中筛选后，我们成功地将FSK6纤维原细胞转化为显示相同于 ES细胞形态的ESL细胞。重编程细胞表达ES特异性生物标志物(Oct4，Ndp52L1， 和Dppa3)而且具有已活化端粒酶的活性(图5)。在这种情况下，这些ESL细胞(示 于图17B和17C)也是多潜能性的，如分化为多种其他细胞类型中所示的。

这些数据已证明了这样的观点：用我们的体外重编程方案能有效地重编程 体细胞。

本发明以示例说明的方式得到了描述，应当理解为，所用的术语是描述而 非限制的性质。显然，根据上述的教导，本发明的修饰和变更是可能的，而且， 本领域的普通技术人员可以根据这种教导提出不脱离或者超出本发明权利要求 范围的另外的实施方案和改进。因此，应当理解为，在所附权利要求范围内， 本发明可以以不同于特别描述的方式实施。相应地，应当理解为，这里的附图 和说明书是以实施例的方式而提供的，目的是有助于理解本发明，而不应当解 释为限制本发明的范围。