一种克隆草地早熟禾水通道蛋白内参基因的方法

摘要

本发明公开了一种克隆草地早熟禾水通道蛋白内参基因的方法，所述方法包括：(1)以草地早熟禾总RNA为模板反转录获得cDNA第一链，(2)以cDNA为模板，以引物：EF1αF1进行PCR扩增，(3)扩增产物回收目的基因条带，(4)将获得的目的基因连接到pMD18-T载体中，转化至感受态细胞中，对培养菌液进行DNA测序，得到174bp早熟禾水通道蛋白内参基因序列。本发明方法获得的草地早熟禾EF-1α内参基因不受细胞生长状态影响，能经受住外界非生物因素影响，在组织中表达非常稳定，优于传统内参基因。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种克隆草地早熟禾水通道蛋白内参基因的方法。

背景技术

随着我国经济建设的飞速发展，草坪对人们赖以生存的环境起着越来越多的改善、美化与保护作用，成为生存环境的重要组成部分。在我国人口较密集的城市，一个绿草茵茵、花香四溢的生活和工作环境，将会带来不可估量的生态效益、社会效益和经济效益。然而水资源的匮乏与草坪面积的增加，是限制草坪应用的一个最突出的矛盾，人们在日益倚重于草坪功能性、娱乐性和观赏性的同时，又面临解决草坪草生长所需水分的问题。特别是在水资源变得日益紧缺的城市地区，草坪灌溉需水量是竞争用水的一个重要方面。在我国北方干旱和半干旱地区，水资源仅占全国总量的7％左右，近年来有减少的趋势。在草坪草生长初期，水分的多少起致关重要的作用，决定着草坪建植的成败及成坪的速度、时间与质量。解决这一问题的途径除了继续开辟水源，利用农艺和工程技术进行有效节水灌溉、保墒等非生物节水措施来提高环境水资源利用效率外，另一更重要的措施是通过生物自身节水潜力(生物节水)(张正斌，2006，作物水分利用效率的遗传改良研究进展)提高草坪草的水分利用效率(Wateruse efficiency，WUE)，利用现代科技开拓草坪节水新途径，培育抗旱节水新品种，让每一滴水生产出更多的绿色，创造出更多的生态效益和社会效益。

草地早熟禾(学名：Poa pratensis L.英文名：Kentucky bluegrass)属于禾本科(Gramineae)、早熟禾系(Poatae)、早熟禾属(Poa L.)的多年生冷季型根茎-疏丛型禾草，是世界公认的优良冷季型草坪草，长期以来，一直备受草坪业发达国家的重视。其自然资源广泛分布于世界温带、寒温带和高寒地区，中国也是草地早熟禾资源蕴藏量极为丰富的国家。草地早熟禾叶色浓绿、叶形和株形优美，形成的草皮结实而富有弹性，因此广泛应用于城市绿地、公园、庭院等草坪绿化，此外还被用于高尔夫球场的球道和高草区。由于草地早熟禾对水分胁迫敏感而且耗水量比较大，利用分子生物学技术挖掘抗旱基因并进行基因重组育成抗旱品种成为目前的育种目标。近年来发现和获得一种对草地早熟禾水分吸收机制有重要调节作用的水通道蛋白基因，对其克隆并与其他基因重组为实现育种目标提供了可能。但是由于对水通道蛋白基因克隆时缺乏内参基因，难以实现基因表达的校正和标准化，大大阻碍水通道蛋白基因在基因重组育种中的应用，成为世界公认急需解决的科研难题。

内参基因是目的基因表达用作参照的基因，其在各组织和细胞中的表达相对恒定。内参基因的作用主要是对目的基因的表达进行校正，使目的基因克隆时达到标准要求并使qRT-PCR的结果准确(胡瑞波，2009，植物实时荧光定量PCR内参基因的选择)。实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chainreaction，FQ RT-PCR)是检测低丰度mRNA的敏感方法，为了去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异，通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。内参基因扩增中的变化可以反映RNA产量、质量和/或cDNA合成效率的变化。选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是必须的。所以，寻找草地早熟禾水通道蛋白基因合适的内参基因成为草地早熟禾水通道蛋白基因育种研究的关键。

目前，国内外有关内参基因的获得和应用只在一些作物研究上有报道(郑小亚等，2011，逆境条件下糯玉米水分利用效率和水通道蛋白表达差异研究)，但针对于草地早熟禾水通道蛋白基因表达时的内参基因，国内外尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，为了克服现有技术中草地早熟禾水通道蛋白基因育种研究的困难，本发明提供一种草地早熟禾水通道蛋白内参基因及其克隆方法，此基因不受早熟禾细胞生长状态的影响，能经受住盐胁迫、干旱等外界非生物因素的影响，在组织中表达稳定，可用于草地早熟禾水通道蛋白基因表达的校正和标准化。

本发明的目的之一是：提供一种用于草地早熟禾水通道蛋白内参基因克隆的引物，所述引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，即：

EF1αF1：5’-GTTGCHGTTGCHTBAAGCGTGG-3’

EF1αR1：5’-TCWGCAAACTTRACAGCAATGTG-3’。

本发明的目的之二是：提供上述引物克隆得到的草地早熟禾水通道蛋白内参基因，所述内参基因序列SEQ ID NO：3为：TGTTGCTGTTGCATTAAGCGTGGGTTTGTGGCTTCTAACTCCAAGGATGACCCAGCCAAGGAGGCTGCCAACTTCACCTCCCAGGTCATCATCATGAACCACCCTGGCCAGATCGGCAACGGTTACGCCCCGGTGCTGGACTGCCACACCTCCCACATTGCTGTCAAGTTTGCAGA。

本发明的目的之三是：提供克隆上述草地早熟禾水通道蛋白内参基因的方法，所述方法包括：

(1)以草地早熟禾总RNA为模板，进行反转录获得cDNA第一链，

(2)将获得的cDNA作为模板，以引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，即：

EF1αF1：5’-GTTGCHGTTGCHTBAAGCGTGG-3’

EF1αR1：5’-TCWGCAAACTTRACAGCAATGTG-3’进行PCR扩增，

(3)将PCR扩增产物经DNA电泳，回收凝胶获得目的基因条带，

(4)将获得的目的基因连接到pMD18-T载体中，连接产物转化至感受态细胞中，对培养菌液进行DNA测序，得到174bp的草地早熟禾水通道蛋白内参基因序列。

本发明的目的之四是：提供一种准确校正水通道蛋白基因表达量的方法，其实现方案是：将各种盐胁迫条件下的处理植株和无处理对照植株，取嫩叶部位进行水通道蛋白基因和内参基因的克隆，将克隆基因在菌体中进行表达，将内参基因的表达量对各胁迫条件下水通道蛋白基因的表达量进行矫正，其中，所述内参基因的克隆为：(1)以草地早熟禾总RNA为模板，进行反转录获得cDNA第一链，(2)将获得的cDNA作为模板，以引物SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2，即：

EF1αF1：5’-GTTGCHGTTGCHTBAAGCGTGG-3’

EF1αR1：5’-TCWGCAAACTTRACAGCAATGTG-3’

进行PCR扩增，(3)将PCR扩增产物经DNA电泳，回收凝胶获得目的基因条带，(4)将获得的目的基因连接到pMD18-T载体中，连接产物转化至感受态细胞中，对培养菌液进行DNA测序，得到174bp的草地早熟禾水通道蛋白内参基因序列。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明的草地早熟禾EF-1α内参基因达到了实时荧光定量RT-PCR(real-timequantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR)在进行水通道蛋白基因表达分析的准确定量的要求。

(2)本发明基因不受细胞生长状态的影响，能经受住外界非生物因素的影响(盐胁迫、干旱等)，在组织中表达非常稳定，这是传统内参基因不能保证的。

附图表说明

图1草地早熟禾EF-1α基因扩增电泳图

图2草地早熟禾EF-1α基因扩增曲线

图3草地早熟禾EF-1α基因溶解曲线

表1不同逆境处理草地早熟禾EF-1α基因表达量

表2以草地早熟禾EF-1α作内参的水通道蛋白基因表达结果

具体实施方式

本发明按照如下步骤进行：

(1)引物设计：根据Genbank登陆的小麦(Wheat)/马铃薯(Solanum tuberosum)/烟草(Nicotiana tabacum)/辣椒(Capsicum annuum)/番茄(Tomato)/无翅猪毛菜(Salsolakomarovii)EF1α基因的mRNA序列(AccessionNumber.M90077.1/AB061263.1/D63396.1/AF242732.1/X14449.1/AB073631.1)，设计一对兼并引物EF1αF1/EF1αR1，引物序列如下：

EF1αF1：5’-GTTGCHGTTGCHTBAAGCGTGG-3’

EF1αR1：5’-TCWGCAAACTTRACAGCAATGTG-3’

引物由上海生工生物技术有限公司合成。

(2)草地早熟禾EF-1α基因克隆：以总RNA为模板，应用试剂盒为HaiGene，cDNA 1stSynthesis Kit进行反转录获得cDNA第一链；在PCR管中配制以下混合液：

在PCR仪上按以下条件进行反转录反应：30℃ 5min，42℃ 45min，95℃ 5min，4℃。

将获得的cDNA作为模板，用步骤(1)所设计的引物Plant EF-1α F1/Plant EF-1α R1进行PCR扩增，获得目的基因条带。反应体系如下：

在PCR仪上按以下条件进行反应：95℃5min，95℃20s，58℃45s，72℃42s，共35个循环，72℃5min。

获得的目的基因电泳图见附图1。

(3)将获得的PCR扩增条带经DNA凝胶回收后，连接到pMD18-T载体中，连接产物转化至感受态细胞中，37℃培养9-16h，挑取单菌落于LB液体培养基中培养，菌液送至上海生工生物技术公司进行测序，得到174bp产物，经测序验证，该序列为早熟禾EF-1α基因序列。可用于内参矫正分析。序列如下：TGTTGCTGTTGCATTAAGCGTGGGTTTGTGGCTTCTAACTCCAAGGATGACCCAGCCAAGGAGGCTGCCAACTTCACCTCCCAGGTCATCATCATGAACCACCCTGGCCAGATCGGCAACGGTTACGCCCCGGTGCTGGACTGCCACACCTCCCACATTGCTGTCAAGTTTGCAGA

(4)取草地早熟禾植株进行如下胁迫处理：用250mM Nacl、100μM ABA、5％PEG6000胁迫24h，并设无处理植株为对照，取嫩叶提取总RNA。应用试剂盒为HaiGene，cDNA 1st SynthesisKit进行反转录获得cDNA第一链。以获得的cDNA为模板，进行RealTime PCR扩增(HaiGene，SYBR Green Kit)，其反应体系如下：

反应条件：95℃ 2min，95℃ 10s，62℃ 35s，40 cycles

定量PCR仪为：Bio-Rad Min-Opticon2

获得的表达量见附表1无论哪种胁迫处理，草地早熟禾嫩叶中EF-1α表达量无明显差异，扩增曲线良好(见附图2)，溶解曲线单一(见附图3)，表明此基因稳定，可做克隆草地早熟禾水通道蛋白的内参基因。此基因只适于作草地早熟禾逆境条件下的水通道蛋白基因表达的内参基因，稳定性好于传统内参基因。

(5)用EF-1α基因作参照，用250mM Nacl、100μM ABA、5％PEG6000胁迫草地早熟禾植株24h，并设无处理植株为对照，取嫩叶部位进行水通道蛋白基因的克隆(水通道蛋白基因在基因bank中的登录号Accession Number为JN383984)，其结果见附表2。从结果可以看出，经过校正标准化后，用5％PEG6000胁迫的嫩叶，水通道蛋白表达量最高，其次表达量较高的是经250mM Nacl胁迫处理的叶片，而对照的叶片表达量仅为5％PEG6000处理的22.37％，为250mM Nacl处理的53.34％，为100μM ABA处理的43.53％。此步骤如果无内参基因校正，无法判断各处理之间水通道蛋白基因表达的真正量值。

表1不同逆境处理草地早熟禾EF-1α基因表达量

  EF-1α  EF-1α  EF-1α  Average  CK  24.26  24.17  24.36  24.26  Nacl  25.76  25.40  25.59  25.58  ABA  24.58  24.87  24.39  24.61  PEG  24.69  25.04  24.30  24.68

表2以草地早熟禾EF-1α作内参的水通道蛋白基因表达结果