一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CS23及其应用

摘要

本发明属于微生物领域，涉及一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CS23及其应用。一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus FJ768456.1)CS23，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.4735。用保藏号为CGMCC NO.4735的短小芽孢杆菌CS23制备的生防菌剂，其中短小芽孢杆菌CS23活菌总浓度为1×10

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种防治日光大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CS23及其应用。 

背景技术

黄瓜霜霉病，俗称“跑马干”，是古巴假霜霉菌(Psedoperonspora cubensis(Berkis Curt)Rostov)引起的一种真菌病害，世界各地普遍发生。该病原物为专性寄生菌，对寄主植物的选择专化性很强，其孢子囊可随风雨、黄瓜甲虫、农用器具等传播，是一种重要的气传病害。 

随着我国日光大棚面积急剧增加，其病菌一年四季可以侵染黄瓜；发病严重时，全叶呈黄褐色干枯，最后导致植株早死，缩短收瓜期，严重影响黄瓜产量，损失可达20％-60％，此病害是日光大棚黄瓜产量的主要制约因素之一。 

化学农药的反复使用极易导致抗药性的产生。如1979年首次报道黄瓜霜霉菌对甲霜灵存在抗性，随后有关其对乙磷铝抗性的报道也出现。目前农民主要依照经验来喷施化学药剂来防治这种病害，一周喷施一次化学药剂，交替选择不同种类药剂。这样虽然可以略微减轻抗药性，但是单剂喷施的化学农药用量依然成递增趋势。同时，消费者逐渐意识到化学农药残留问题对人体健康的影响，各界转而开始使用生物农药，如克菌康、武夷菌素、绿盾丰、双抗等，活体的生防菌剂主要有芽孢杆菌和假单胞类，但大多处于实验室研究开发阶段。且因霜霉病是活体寄生菌，大多完成简单的室内测定试验，在我国主要黄瓜栽培区进行日光温室或者露天试验药效广谱性测试的生防研究微乎其微。 

综上所述，开发新的、更为高效和安全的微生物杀菌剂控制黄瓜霜霉病的发生是提高社会生产总量的需要，同时更是农业安全及可持续发展的需要。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中没有对黄瓜霜霉病有较高防效的生防制剂的现状，提供一种防治黄瓜霜霉病的单一生防菌菌株及其菌剂，该菌剂对其防效可达到60％以上。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

一种短小芽孢杆菌CS23(Bacillus pumilus)，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.4735。 

所述的保藏号为CGMCC NO.4735的短小芽孢杆菌CS23在防治黄瓜霜霉病中的应用。 

优选所述的保藏号为CGMCC NO.4735的短小芽孢杆菌CS23在防治日光大棚黄瓜霜霉病中的应用。 

所述的保藏号为CGMCC NO.4735的短小芽孢杆菌CS23制备的生防菌剂。 

其中，优选该生防菌剂中保藏号为CGMCC NO.4735的短小芽孢杆菌CS23活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹¹CFU/ml，进一步优选8.5×10⁹-6.5×10¹⁰CFU/ml。 

一种制备所述的生防菌剂的方法，将保藏号为CGMCC NO.4735的短小芽孢杆菌CS23的种子菌液以1∶500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，32℃、180rpm培养44～48h，然后离心，取沉淀即得所述的生防菌剂。 

所述的生防菌剂中活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹¹CFU/ml，优选8.5×10⁹-6.5×10¹⁰CFU/ml。 

所述的离心条件为4000rpm离心15min。 

所述的保藏号为CGMCC NO.4735的短小芽孢杆菌CS23的种子菌液制备方法为：将保藏号为CGMCC NO.4735的短小芽孢杆菌CS23菌株接种到LB培养液中32℃培养180rpm振荡培养至600nm处的OD值为0.8时结束培养。 

所述的生防菌剂稀释100-1000倍后在日光温室大棚黄瓜移栽后4叶期开始进行喷雾处理或者喷雾/灌根处理，在天气因子适合黄瓜霜霉病流行前期，7d/10d一个间隔周期使用一次，第七天统计发现在淮安丁集实验基地的黄瓜，喷雾处理和喷灌处理对黄瓜霜霉病的防达分别为65.46％和60.06％。 

本发明的有益效果是： 

本发明是专门针对黄瓜霜霉病开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于日光大棚蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留，有利于蔬菜的出口。 

温室实验表明：该短小芽孢杆菌CS23(CGMCC NO.4735)能显著降低黄瓜霜霉病的发生。利用该菌制备的生防菌剂稀释100倍在移栽时灌根/喷雾处理，在温室条件下对于黄瓜霜霉病生防效果可以达65.23％以上。 

生物样品保藏信息 

一种短小芽孢杆菌CS23(Bacillus pumilus)，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.4735。 

具体实施方式

实施例1 

菌株来源：CS23由江苏省扬州市黄瓜根围土壤中分离得到。 

菌株分离方法：平板稀释法(中国科学院南京土壤所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京：科学出版杜，1985.) 

菌株筛选依据：水解五种酶活性(蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶、嗜铁素、IAA测定Yang J.-H.，Liu H.～X.，Zhu G.-M.，Xu L.-P.，Pan Y.-L.，and Guo J.-H.*.2008.Diversity analysis of antagonists from rice associated bacteria and their application in biocontrol of rice diseases.Journal of Applied Microbiology.104(1)：91～104.)和对疫霉菌颉颃作用(对峙培养法，林福呈，李德堡.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理学报，2003，33(2)：174～177.)，通过细菌的赋值评估(Faltin等，2004)，最终选择CS23作为有效细菌成分。 

菌株鉴定方法：鉴定方法为16S r DNA基因片段序列测序。 

鉴定结果见表1： 

表1：测序比对结果 

CS23形态学特征：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CS23为芽孢杆菌属，菌体细杆状，0.6～0.7μm×2.0～3.0μm，革兰氏阳性。B.pumilus存在半透明型和不透明型两种不同的菌落形态，对两种菌落分别进行传代，半透明菌落能产生半透明和不透明型菌落，且基本各占一半。而不透明菌落在传代过程中只产生少许的半透明菌落，且传至第4代时半透明型菌落消失。 

实施例2CS23生防菌剂的制备 

将短小芽孢杆菌CS23(CGMCC NO.4735)菌株接种到LB培养液中32℃培养180rpm振荡培养16h后，每隔2h在超净工作台中取样测600nm处的OD值，当OD值为0.8时结束培养作为种子菌液。把种子菌液以1∶500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，32℃、180rpm培养48h，然后4000rpm离心15min，取沉淀即得所述的CS23生防菌剂。所得生防菌剂中活菌总浓度为8.5×10⁹CFU/ml。 

实施例3实验室温室试验 

本实验黄瓜品种采用“津优30”。待长出8片真叶时开始喷施处理药剂，设3个处理组，处理药剂分别为：A：用清水40倍稀释的实施例2制备的CS23生防菌剂；B：20％霜霉威水剂；C：清水对照。每处理设4个重复，每个重复24棵苗。喷施处理药剂后5d接种霜霉病菌孢子囊，浓度为10⁵个孢子囊/ml，接种后8d时对照组发病。 

霜霉病病原菌Pseudoperonospora cubensis(Berkely et Curtis)Rosto wzew，公知公用，见参照文献“汤钿.葡萄霜霉病离体接种方法的研究[J]微生物学通报，1994，(06).”。 

病菌孢子囊悬浮液制备方法(参考文献：杜兴兰.葡萄霜霉病和白粉病生物防治的研究[D]河北农业大学，2008)：傍晚采集发病严重的新鲜黄瓜霜霉病病叶(近几天未施过农药)，用冰壶带回实验室，冲去叶面上的杂物和原有的孢子囊，用浸水的脱脂棉包住叶柄，置于18℃培养箱中黑暗保湿培养，24h后待长出新鲜孢子囊。用无菌水刷取新长出的孢子囊，双层纱布过滤，12000rpm 15min离心，弃去上清液，用灭菌水稀释至10⁵个孢子囊/ml，在18℃培养箱中黑暗培养2-3h，待有大量游动孢子囊出现时使用。 

调查病害严重度并计算防效，生防效果为65.23％，如表2。 

表2：CS23菌剂对黄瓜霜霉病生防效果 

实施例4日光大棚田间小区试验初步检测CS23生防菌剂对黄瓜霜霉病的生防效果 

黄瓜移栽后四叶期，将实施例2制备的生防菌CS23稀释100倍后终浓度为10⁷CFU/mL雾处理黄瓜叶片，设清水为空白对照；每个处理组60株，面积为100cm*50cm，四次重复小区。5d后大棚出现霜霉病症状。日光大棚相对湿度85-95％，5至10d分别调查病级数，计算病害严重度和防效。 

根据GB/T17980.26-2000《杀菌剂防治黄瓜霜霉病田间药效试验准则(一)》的黄瓜霜霉病分级标准：0级：无病斑，1级，病斑面积占整个叶面积的5％以下；3级，病斑面积占整个叶面积的6％～10％；5级，病斑面积占整个叶面积的11％～25％，7级，病斑面积占整个叶面积的26％～50％；9级，病斑面积占整个叶面积的50％以上。 

调查方法：每株的每片叶子都调查，新叶也调查。 

病害严重度％＝[∑(病级叶片数×代表级数)/总叶片数数×最高代表级值]×100； 

生物防治效果％＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100 

调查结果显示，生防菌剂CS23喷雾处理5d对黄瓜霜霉病的生防效果达到67.98％(表3)，喷雾/灌根同时处理生防效果达到66.24％(表3)。8d对黄瓜霜霉病的生防效果达到66.19％(表4)，喷雾/灌根同时处理生防效果达到60.35％(表4)。 

表3：生防菌剂CS23处理对黄瓜霜霉病的生防效果(5d) 

表4：生防菌剂CS23对黄瓜霜霉病的生防效果(8d) 

实施例5日光大棚田间验证试验 

实验地点一：淮安市丁集镇黄瓜日光大棚 

黄瓜品种为“津优35”。大田试验选择在淮安市丁集镇黄瓜日光大棚，共设3个处理组，处理药剂分别为：A：用清水500倍稀释的实施例2制备的CS23生防菌剂；B：20％霜霉威水剂；C：清水对照。每处理设4个重复小区，每个重复60棵苗，各小区采用随机区组排列，小区之间以保护行隔离。施药方法采用小喷壶精细喷雾至每片黄瓜叶子上，主要喷施叶子背面；以及喷雾和灌根处理同时进行两种方法。 

移栽后20d(长出5-6片真叶)喷施处理药剂，采用一定农用措施，控制好大棚温湿度，大棚出现霜霉病情开始调查。 

数据显示，喷雾处理此菌剂对黄瓜霜霉病的生防效果为65.46％，而喷雾和灌根同时处理的生防效果为60.06％，但两者之间没显著差异。如表6。 

表5：CS23菌剂对黄瓜霜霉病的生防效果(处理7d) 

注：sp表示采用喷雾处理；ss表示采用喷雾和灌根处理同时进行，CS23稀释500倍，灌根处理 时每株黄瓜苗100ml。 

实验地点二：淮安市柴米河公司黄瓜日光大棚 

黄瓜品种为“津春5号”。共设3个处理组，处理药剂分别为：A：用清水500倍稀释的CS23；B：20％霜霉威水剂；C：清水对照。每处理设4个重复小区，每个重复60棵苗，各小区采用随机区组排列，小区之间以保护行隔离。施药方法采用小喷壶精细喷雾至每片黄瓜叶子上，主要喷施叶子背面；以及喷雾和灌根处理同时进行两种方法。 

移栽后20d(长出5-6片真叶)喷施处理药剂，采用一定农用措施，控制好大棚温湿度，大棚出现霜霉病情开始调查。 

数据显示，喷雾处理此菌剂对黄瓜霜霉病的生防效果为63.79％，而喷雾和灌根同时处理的生防效果为63.04％，如表6。 

表6：CS23对黄瓜霜霉病的生防效果(处理7d) 

注：sp表示采用喷雾处理；ss表示采用喷雾和灌根处理同时进行，CS23菌剂稀释500倍，灌根处理时每株黄瓜苗100ml。 

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