荧光定量PCR检测血清miR-21试剂盒及其应用

摘要

本发明提供了一种实时荧光定量PCR检测血清miR-21试剂盒，其包括SEQ ID No.1所示的逆转录引物以及SEQ ID No.2和3所示的PCR引物，此外还可以进一步包括SEQ ID No.4所示的逆转录引物以及SEQ ID No.5和6所示的PCR引物，该试剂盒还可进一步包括：Trizol试剂、逆转录试剂、PCR扩增试剂。本发明还提供了一种应用上述血清miR-21检测试剂盒方法。本发明提供的检测乳腺癌血清中miR-21方法操作简便，费用低廉，诊断灵敏，且为定量检测，能方便地检测血清中miR-21，适合于乳腺癌患者的辅助诊断及复发的监测。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种血清miR-21检测试剂盒及其在乳腺癌辅助诊断中的应用。

背景技术

miRNA是一类长度为19～24个核苷酸(nt)的内源性非编码小分子单链RNA，在进化过程中高度保守，能通过与靶基因mRNA特异性的碱基互补配对，引起mRNA的降解或者抑制其翻译，而广泛地负调控靶基因的表达。大量实验证明miRNA在干细胞维持、细胞分化、增殖、凋亡、代谢、胚胎发育、免疫应答及肿瘤的发生发展等生命活动中发挥重要作用。近几年，miRNA被视为新一代肿瘤标志，其在肿瘤诊断，预后中起非常重要的作用。

miR-21被视为一种癌基因，在神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤的组织中上调表达。其的主要通过作用于抑癌基因PTEN及肿瘤抑制基因原肌球蛋白1(TPM1)，而促进肿瘤的发生发展。另有报道它也能直接作用于程序性细胞死亡因子4(PDCD4)与乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(maspin)而介导肿瘤的转移与侵袭。对于miRNA在肿瘤分子生物学的基础研究固然重要，若能在血液中检出肿瘤特异性的miRNA并用于肿瘤的早诊及预后则更具有意义。最近有报道血清miR-21作为肿瘤标志物，对乳腺癌的诊断和预后及监测有比较好的的价值。

由于血清中miR-21的含量远低于组织，需要寻找一种非常敏感且特异的检测方法。尽管目前有不少miRNA检测方法，如DNA/RNA杂交，芯片及测序，但实时荧光定量PCR具有快速、灵敏、特异性高、能检测出低丰度靶miRNA，国内外越来越多的公司与实验室已经和正在研发miRNA荧光定量PCR检测试剂盒。其中以ABI公司所生产的试剂盒质量较好，性能稳定，可实现高通量检测，在科研界已有应用，但因价格昂贵限制其在临床推广使用。

本发明用SYBR Green I荧光定量PCR技术建立血清miR-21检测试剂盒。在实时荧光定量PCR中，SYBR Green I染料法较ABI公司所用的Taqman探针法可使成本大大减低，但同时不可避免增加了反应的非特异性从而降低了检测的准确性。因此本实验在国内率先提出标本检测信号与背景信号两者之间信噪比的概念。同时通过系列优化与严格质量控制解决了RT-NTC(逆转录无模板对照)和PCR-NTC(PCR无模板对照)对检测准确性干扰的问题。最后建立了一种SYBR Green I实时荧光定量PCR检测血清miR-21试剂盒，并初步应用于乳腺癌诊断中，显示对乳腺癌辅助诊断具有较好的敏感性及特异性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种实时荧光定量PCR检测血清miR-21试剂盒及其乳腺癌辅助诊断的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供一种用于miR-21荧光定量检测的PCR引物，其包括：

miR-21逆转录引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACTCAACAT

miR-21PCR引物：

上游引物：CGCGGTAGCTTATCAGACTGATG

下游引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTG。

为了避免扩增产生的误差，本发明还以miR-16基因作为内参，相关引物如下：

miR-16逆转录引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACCGCCAAT

上游引物：GCGGTAGCAGCACGTAAATATTGG

下游引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTG

进而，本发明提供一种检测血清miR-21的实时荧光定量PCR试剂盒，其包括上述引物，并且还可进一步包括以下试剂中的一种或多种：

(1)Trizol试剂；

(2)逆转录试剂；

(3)PCR扩增试剂。

本发明所述的试剂盒中Trizol试剂，包括：重蒸苯酚200mL；8-羟基喹啉0.2g；β-巯基乙醇1.2g或二硫苏糖醇0.5g；异硫氢酸胍100g；蒸馏水118mL；0.75M柠檬酸钠7.04mL；10％十二烷基肌氨酸钠10.56mL；2M醋酸钠20mL然后混合，调节pH值至3.2-5.6，置于4℃保存，保质期约9个月。

其中，所述逆转录试剂包括：逆转录酶、逆转录缓冲液、DTT、dNTPs、RNAsin；优选所述逆转录试剂包括：50～400U/μL M-MLV，优选150～250U/μL；4～6×逆转录缓冲液；0.8～1.2mol/L DTT；8～12mmol/L dNTPs；35～45U/μL RNAsin，所述逆转录引物溶于逆转录试剂中浓度为100～2000nmol/L，优选为250～750nmol/L；更优选所述逆转录试剂包括：200U/μL M-MLV；5×逆转录缓冲液；1mol/L DTT；10mmol/L dNTPs；40U/μL RNAsin，所述逆转录引物溶于逆转录试剂中浓度为500nmol/L。

其中，所述PCR扩增试剂包括：PCR扩增试剂10μL；PCR上下游引物各1μL。PCR扩增试剂为含有荧光染料用于荧光定量PCR的扩增试剂。该扩增试剂可商业化试剂，例如罗氏公司的FastStartUniversal SYBK Green Master。

本发明还进一步提供了血清miR-21的检测方法，包括以下步骤：

(1)血清标本中总RNA的提取；

(2)用上述试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。

本发明方法为相对定量法，miR-16为miR-21检测的内参基因。采用以上方法进行检测时步骤(2)包括RNA的逆转录和PCR扩增，所述逆转录的反应条件为：16℃退火30min，37℃逆转录30min，85℃灭活逆转酶5min；所述PCR扩增的反应条件为：95℃10min；95℃15s，62℃1min，45个循环；60℃～95℃绘制熔解曲线。

使用本发明的试剂盒检测的具体实施方式为：

1DEPC水的配制

取2mL的DEPC(焦碳酸二乙酯；自备)与2L的三蒸水(1∶1000比例)加入2.5L内置磁力棒的锥形瓶中，在磁疗搅拌器上旋转搅拌4h使其DEPC水充分溶解。注意DEPC有剧毒，戴口罩与手套，通风橱中操作。

2吸头，EP管的处理

将各种型号的吸液枪头，EP管，放入已搅拌均匀的DEPC水中浸泡过夜。枪头盒先用蒸馏水洗净，再用DEPC水擦拭。然后将它们于高压干燥锅中高压1h，通过高温降解DEPC，同时灭菌。

3血清总RNA的提取

3.1取乳腺癌或正常人335μL血清加入已被DEPC水处理的2mL EP管中，再分别加入1mL Trizol，与200μL三氯甲烷，充分涡旋混匀1min(注意，涡旋时间不够或力度不强将不能很好分层)。然后静置3min。

3.212000rpm，4℃离心15min之后。小心吸取上层水相600μL于1.5mL EP管中(切勿触及中间白色层，否则容易导致蛋白污染)。然后再加入预冷的600μL异丙醇，充分混匀后，4℃离心15min。

3.3小心倾倒已离心的液体，残留液体可稍离心再用200mL枪吸取干净，但尽量不要碰管壁与管底。加入预冷的1mL的75％酒精洗涤，涡旋混匀(酒精容易挥发，若存储时间超过2星期重新配制)。然后7500rpm，4℃离心5min。

3.4小心倾倒酒精，再置超净台通风干燥20-30min，然后加入100μL已高压的DEPC水，再将EP管在65℃水浴箱中10min(使RNA充分溶解)。

3.5取出立即置于冰上，然后置于-20℃保存备用。

4逆转录

取20μL提取的RNA和20μLDEPC水(作为RT-NTC，逆转录无模板对照)分别加入逆转录试剂，其具体成份与体积见表1，反应条件为：16℃，退火30min；42℃，逆转录60min；85℃，灭活逆转酶5min。然后逆转录产物保存于-20℃或立即进行下步PCR反应。

表1miRNA逆转录反应体系

5实时荧光定量PCR

逆转录产物和DEPC水(作为PCR-NTC，PCR无模板对照)5μL分别加入FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)10μL，DEPC水5μL，PCR上下游引物各1μL。然后进行实时荧光定量PCR检测。开始以95℃，热激活10min后，再95℃10min；95℃15s，62℃1min，45个循环。

本发明的结果分析：设立RT-NTC及PCR-NTC均为阴性对照，其分别为逆转录的阴性对照和PCR阴性对照。根据健康人血清miR-21相对表达量均值的加上二倍的标准差作为阈值(cutoff值)，当大于其值定义为阳性，而小于其值则判为阴性。整个过程一天可以完成。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的试剂盒具备较好的敏感性及特异性，可检测血清mi-21的相对表达量。其乳腺癌患者的检出率可达到51.5％，特异性达到93.9％。

(2)本发明的试剂盒为血清检测，标本来源方便且性能较稳定，较适合用于临床。

(3)检测灵敏，成本低，可在一天内出结果，操作简便且同时对几十例标本检测。适用于乳腺癌患者的辅助诊断，预后及治疗后的动态监测。

附图说明

图1为健康人血清标本、RT-NTC和PCR-NTC的SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增曲线图，4份健康人血清标本miR-21检测Ct值分别为：22.94、25.57、26.90、26.99，而RT-NTC和PCR-NTC的Ct值分别为34.27和36.7，表明背景信号对标本检测信号干扰很小，反映检测特异性高；

图2为本试剂盒检测miR-21的标准曲线；

图3为miR-21与miR-16的批内CV曲线图；

图4为miR-21与miR-16的批间CV曲线图；

图5显示的是miR-21在健康体人与乳腺癌患者中的表达。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

本发明所述试剂盒中的逆转录引物及PCR引物通过Primer 5设计有赛百盛公司合成而得。

实施例1Trizol试剂配制

Trizol试剂配制，首先将100g异硫氢酸胍、118mL蒸馏水、7.04mL浓度0.75M柠檬酸钠、10.56mL 10％十二烷基肌氨酸钠、20mL浓度2M醋酸钠混合，充分搅拌溶解；之后将200mL重蒸苯酚(常温下为结晶体)于60℃水浴至完全融化，然后分别加入0.2g 8-羟基喹啉和1.2gβ-巯基乙醇或0.5g二硫苏糖醇；再将上述试剂全部混合，充分搅拌，最后调节pH值至4.6，置于4℃保存。保质期约9个月。

实施例2血清RNA的提取

(1)取33例乳腺癌患者和49例健康人血清加入已被DEPC水处理的2mL EP管中，再分别加入实施例1中配制的1mL Trizol试剂，与200μL三氯甲烷，充分涡旋混匀1min(注意，涡旋时间不够或力度不强将不能很好分层)。然后静置3min。

(2)将EP管12000rpm，4℃离心15min之后。小心吸取上层水相600μL于1.5mL EP管中(切勿触及中间白色层，否则容易导致蛋白污染)。然后再加入预冷的600μL异丙醇，充分混匀后，4℃离心15min。

(3)小心倾倒已离心的液体，残留液体可稍离心再用200mL枪吸取干净，但尽量不要碰管壁与管底。加入预冷的1mL的75％酒精洗涤，涡旋混匀(酒精容易挥发，若存储时间超过2星期重新配制)。然后7500rpm，4℃离心5min。

(4)小心倾倒酒精，再置超净台通风干燥20-30min，然后加入100μL已高压的DEPC水，再将EP管在65℃水浴箱中10min(使RNA充分溶解)，取出立即置于冰上，然后置于-20℃保存备用。

实施例3miR-21与miR-16逆转录

将实施例2提取的RNA用自组装的逆转录试剂盒进行逆转录。将23μL提取的RNA与23μL DEPC水[作为逆转录无模板对照(RT-NTC)]分别加入逆转录试剂盒中各种试剂，其含具体体积为500nmol/L miR-21或miR-16茎环逆转录引物1μL、200U/μL M-MLV1μL、逆转录缓冲液2μL、1mol/1DTT 0.1μL、10mmol/1DNTPs 0.5μL和40U/μL RNAsin 0.1μL。反应条件为：16℃退火30min，42℃逆转录60min，85℃灭活逆转酶5min。然后，将逆转录产物置-20℃保存。

实施例4SYBR Green I实时荧光定量PCR对逆转录产物扩增

5μL逆转录产物与5μL DEPC水[作为PCR无模板对照(PCR-NTC)]分别加入FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)10μL、DEPC水5μL、PCR上下游引物各1μL；然后用实时荧光定量PCR检测血清miR-21。检测参数为95℃10min；95℃15s，60℃1min，45个循环；60℃～95℃绘制熔解曲线。

实施例5试剂盒检测条件优化

在SYBR Green I荧光定量PCR中，RT-NTC与PCR-NTC可通过引物二聚体发生非特异性扩展，产生背景信号。试验分析用其产生的循环阈值(Ct)与标本检测Ct差值(ΔCt)的大小，以确定检测特异性。本试验的信噪比根据ΔCt越高则反应特异性越好；而灵敏性可由Ct值所反映，其值越低则检测灵敏性越高。由于反应特异性越高，则灵敏性有可能越低。

从表2可见，条件(3)时，其标本检测Ct值最低，即灵敏性最高；而条件(2)时，其ΔCt值最大，即特异性最高。在SYBR GreenI的荧光定量PCR检测中，由于背景信号的干扰为本方法最为重要因素。由于本检测需要更高的信噪比来提高检测的准确性，所以选择条件(2)进行后续的试验。

表2退火，延伸的温度及时间对检测灵敏度与特异性的影响

实施例6试剂盒特异性实验

在SYBR Green I荧光定量PCR中，RT-NTC与PCR-NTC可通过引物二聚体发生非特异性扩展，产生背景信号。试验分析用其产生的循环阈值(Ct)与标本检测Ct差值(ΔCt)的大小，以确定检测特异性。本试验的信噪比根据ΔCt＞6表示背景信号低，说明检测具有很高的特异性；而ΔCt＜3则表示背景信号高，试验检测值的特异性较低。

如图1所示，4例健康人血清标本miR-21检测Ct值分别为22.94，25.57，26.90，26.99，RT-NTC和PCR-NTC的Ct值分别为34.27和36.70。将健康人中Ct值为26.99的标本与PCR-NTC相比较，ΔCt为9.71表明PCR-NTC对标本扩增的荧光信号干扰很小。而RT-NTC对试验影响稍大，其ΔCt为7.28。但总之，根据ΔCt＞6，RT-NTC和PCR-NTC对背景信号干扰均较小，本检测具有很高的特异性。

实施例7试剂盒精确性实验

确定最优实验条件后，我们通过对逆转录产物进行倍比稀释(1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64)和不同浓度miR-21的相应Ct值建立标准曲线。如图2所示，其拟合曲线为直线，方程为Y＝-0.3085X+10.521，R²＝0.9948，表明自建方法检测血清中不同浓度miR-21的线性相关性良好，具有很好的精确性。

实施例8试剂盒稳定性实验

通过对同一乳腺癌患者血清本的24个平行孔检测，miR-21的Ct值为28.54±0.2，批内CV为1.03％；miR-16的Ct值为26.97±0.08，批内CV为0.03％(图3)，miR-21与miR-16的批内CV均＜1.5％，表明批内检测具有很好的稳定性。

将同一份乳癌血清分成8份通过8次不同时间检测其Ct值，miR-21的Ct值为29.02±0.79，其批间CV为2.72％；miR-16的Ct值为21.92±0.84，批间CV为3.82％(图4)，miR-21与miR-16的批间CV均＜4％，表明批内检测具有较高的稳定性。

miR-21与miR-16的批内CV差异均＜1.5％，批间CV差异均＜4％。此外，从图5中虽然可见存在加样误差、仪器升温不均等对检测产生误差，但由于本方法将miR-16为内参，可很大程度地抵消检测误差，得到比较准确的miR-21相对表达量(同一份标本miR-21与miR-16偏差趋势一致)。

实施例9miR-21表达对乳腺癌的辅助诊断

将优化的试剂盒用于乳腺癌的辅助诊断。其中乳腺癌血清标本来自2011年3月至2011年4月北京肿瘤医院经病理确诊的33例女性乳腺癌患者，年龄54(36～72)岁。健康人血清标本来自同院同期49名女性健康体检者，年龄51(31～65)岁。

当以miR-16为内参，用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测乳腺癌患者健康人血清miR-21的相对表达量为分别为20.83±18.18和9.33±4.44(见图5)。两组表达量经Mann-Whitney检验，之间差异有统计学意义(Z值为-2.58，P≤0.01)。以miR-21的相对表达量18.32作为临界值时，本方法对乳腺癌诊断的敏感度为51.5％(17/33)，特异度为93.9％(46/49)。