毛红椿醛及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及医药技术领域，涉及从中国毛红椿(Toona ciliata var.pubescens)中分离得到的骨架新颖的三萜类化合物毛红椿醛(toonapubesic aldehyde)及其制备方法和在肿瘤和糖尿病治疗中的应用。本发明的毛红椿醛结构式如下所示。经实验证实，该化合物对酪氨酸磷酸酯酶(CDC25B)、半胱氨酸天冬氨酸位点特异性蛋白水解酶3(Caspase-3)和蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)具有显著抑制活性，可用于制备治疗肿瘤疾病和II-型糖尿病及其它由此引起的并发症的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体而言，涉及一种从中国毛红椿 (Toona ciliata var.pubescens)中提取分离得到的骨架新颖的三萜类化合 物毛红椿醛(toonapubesic aldehyde)，本发明还涉及该化合物的制备方 法。生物活性测试显示：该化合物对酪氨酸磷酸酯酶(CDC25B)、半胱 氨酸天冬氨酸位点特异性蛋白水解酶3(Caspase-3)和蛋白酪氨酸磷酸 酯酶1B(PTP1B)具有显著抑制活性，可用于制备治疗肿瘤、II-型糖尿 病或其并发症的药物。

背景技术

毛红椿为楝科香椿属植物，广泛分布在江西、湖北、湖南、广东、 贵州和云南等省；生于低海拔和中海拔的山地密林或疏林中。

CDC25B是CDC25磷酸酯酶家族的一员，CDC25B激活细胞周期蛋 白依赖激酶CDC2，是有丝分裂必需的，CDC25B在分裂的M和G1期存 在于细胞核中，而到S期和G2期转移到细胞质中。CDC25B具有原癌基 因性质，虽然其在癌症发生中的角色尚未被确定，但是寻找到特异高 效的抑制剂可以对癌症研究提供新的工具和手段。

Caspase-3(又称CPP32、apopain、Yama)是Caspases家族中的成员， 是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶。它在许多调亡过度相关疾病的病 理过程中起着很重要的作用，与老年性痴呆症、帕金森氏症、亨廷顿 舞蹈病、脊椎小脑失调等神经退行性疾病以及急性肝损伤、肝炎、骨 关节炎、风湿性关节炎等炎症性疾病相关。因此，寻找caspase-3高效、 高选择性的抑制剂将为治疗调亡过度相关疾病提供新的途径。

PTP1B是第一个被鉴定的蛋白酪氨酸磷酸酯酶(protein tyrosine phosphatase)，通过PTP1B剔除的老鼠实验表明，PTP1B通过对胰岛素 受体的脱磷酰化，进而在调节胰岛素敏感性和脂肪代谢过程中起着非 常重要的作用。因而，选择性的、高活性的PTP1B抑制剂在糖尿病和 肥胖症的治疗中有重要的价值。

发明内容

本发明是从中国毛红椿中提取分离得到的骨架新颖的三萜类化合 物毛红椿醛。经药理试验研究表明，该化合物对酪氨酸磷酸酯酶 (CDC25B)、半胱氨酸天冬氨酸位点特异性蛋白水解酶3(Caspase-3)和 蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)具有抑制活性。

因此，本发明的一个目的是提供新的三萜类化合物毛红椿醛。

本发明的另一目的是提供所述毛红椿醛的制备方法。

本发明的进一步目的是提供所述毛红椿醛在制备酪氨酸磷酸酯酶 (CDC25B)、半胱氨酸天冬氨酸位点特异性蛋白水解酶3(Caspase-3)和 蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制剂的药物中的应用，进一步在制 备治疗肿瘤、II-型糖尿病或其并发症的药物中的应用。

根据本发明的第一个目的，本发明首次从毛红椿中发现了一个骨 架新颖的三萜类化合物毛红椿醛，其化学结构如下所示：

根据本发明的第二个目的，本发明提供了毛红椿醛的制备方法， 它是从毛红椿中提取分离得到的，具体步骤如下：

提取：将中国毛红椿树皮用甲醇提取，所得提取液浓缩后得粗浸 膏；将该粗浸膏溶于水，混悬均匀后依次用氯仿和正丁醇萃取，所得 萃取液浓缩后分别得到氯仿浸膏和正丁醇浸膏；

分离：氯仿浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱； 其中，石油醚/乙酸乙酯体积比70∶30洗脱部分，经Sephadex LH-20凝 胶柱层析，以氯仿/甲醇体积比1∶1洗脱，洗脱液再经制备型HPLC， 以甲醇-水90∶10洗脱，得到毛红椿醛。

在上述制备方法中，在提取步骤中，所述提取采用的方法为甲醇 渗漉提取。

在上述制备方法中，在分离步骤中，石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱的 浓度依次为体积比90∶10、80∶20和70∶30。

在上述制备方法中，在分离步骤中，所述制备型HPLC的色谱柱 的填料为RP-18。

根据本发明的第三个目的，本发明提供了毛红椿醛的用途。

本发明对毛红椿醛进行了体外抗肿瘤实验。实验证明，毛红椿醛 对酪氨酸磷酸酯酶(CDC25B)、半胱氨酸天冬氨酸位点特异性蛋白水解 酶3(Caspase-3)和蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)具有明显抑制作用， 进而可以用来治疗肿瘤、II-型糖尿病或其并发症。体外采用MTT方 法进行对酪氨酸磷酸酯酶(CDC25B)、半胱氨酸天冬氨酸位点特异性蛋 白水解酶3(Caspase-3)和蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制实验。本 发明的毛红椿醛可以与药学上可接受的载体、赋形剂或辅料组合，进 而可制成治疗肿瘤、II-型糖尿病或其并发症的药物组合物。

本发明的毛红椿醛可通过从植物中分离纯化得到；也可以经本领 域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。

具体实施方式

在如下的实施例中所指的毛红椿醛的化学结构式(结构式中的阿 拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)：

实施例1毛红椿醛的制备

提取：将中国毛红椿树皮(采自江西省信丰县)4kg用甲醇(5L)进 行渗漉提取三次，所得提取液浓缩后得粗浸膏；将该粗浸膏溶于水， 混悬均匀后依次用(1L)和正丁醇(1L)分别萃取三次，所得萃取液浓缩 后分别得到氯仿浸膏(64g)和正丁醇浸膏(40g)。

分离：氯仿浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱， 梯度洗脱的浓度依次为体积比90∶10、80∶20和70∶30；其中，石油醚/ 乙酸乙酯体积比70∶30洗脱部分，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以 氯仿/甲醇体积比1∶1洗脱，再经制备型HPLC(色谱柱的填料为RP-18)， 以甲醇-水体积比90∶10洗脱，得到毛红椿醛(8mg)。

毛红椿醛，白色粉末，分子式为C₃₀H₄₈O₃。¹H及¹³C NMR数据 见表1。

表1毛红椿醛的¹H和¹³C NMR(ppm in CDCl₃)

实施例2抗肿瘤及II-型糖尿病活性的测试

1、实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中制备的纯品化 合物毛红椿醛。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液， 供活性测试。

测试蛋白酶的获得与活性测试方法：

酪氨酸磷酸酯酶(CDC25B)和蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)：采 用大肠杆菌表达系统表达获得CDC25B和PTP1B的催化结构域蛋白 用于蛋白酶活性的测试，其测试活性方法和条件参考文献报道[Acta Pharmacologica Sinica(2009)30：1359-1368]。半胱氨酸天冬氨酸位点 特异性蛋白水解酶3(Caspase-3)采用大肠杆菌表达系统获得活性的 Caspase-3蛋白用于抑制剂活性测试，其测试方法参考文献报道[THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.283，NO.44，pp. 30205-30215，October 31，2008]。

2、实验结果

见下表2。化合物毛红椿醛对酪氨酸磷酸酯酶(CDC25B)、半胱氨 酸天冬氨酸位点特异性蛋白水解酶3(Caspase-3)和蛋白酪氨酸磷酸酯 酶1B(PTP1B)抑制实验结果分别为IC₅₀＝0.96μg/mL、7.62μg/mL、 2.81μg/mL，表明其对酪氨酸磷酸酯酶(CDC25B)、半胱氨酸天冬氨酸 位点特异性蛋白水解酶3(Caspase-3)和蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B) 具有抑制活性。

表2

                                     

酶类型        IC₅₀(μg/mL)

                                     

CDC25B        0.96

Caspase-3     7.62

PTP1B         2.81

                                     

3、结论

化合物毛红椿醛在低浓度下对酪氨酸磷酸酯酶(CDC25B)、半胱氨 酸天冬氨酸位点特异性蛋白水解酶3(Caspase-3)和蛋白酪氨酸磷酸酯 酶1B(PTP1B)具有抑制活性。因此，本发明的毛红椿醛可用于制备治 疗肿瘤、II-型糖尿病或其并发症的药物。